Name: 自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ、自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達法。ガイドカニューレを用いた精密な技術で、腸内細菌叢が脳機能と行動に与える影響を解明し、腸脳軸のメカニズム理解に貢献する。

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国立成功大学(NCKU)の実験動物センターのスタッフに、動物の世話をしてくれたことに感謝します。この作業は、チェンシン医療財団のクンイェンファン教育基金からC.-W.L.への奨学金によってサポートされました。台湾の科学技術部(MOST)からの資金:(学部研究MOST 109-2813-C-006-095-B)からT.-H.Y.;(ほとんどの107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)からW.-L.W.;高等教育スプラウトプロジェクト、教育省からNCKUの大学進学本部からW.-L.W.

著者には、この作業に関連する利益相反はありません。

腸由来の代謝産物は、体内での複数の結合部位のために、あまり正確なメカニズムなしに脳介在性疾患と関連しています6,12,24。以前の報告では、SCFAがGタンパク質共役型受容体、エピジェネティック調節因子、および体内の複数の部位でのエネルギー生産の源のリガンドとして機能する可能性があることが示されました6,12。末梢由来の交絡因子(免疫細胞、ホルモン、自律神経系など)を回避するため、自由に動くマウスにガイドカニューレを介してSCFAを脳内に脳内注射する方法を開発しました。さらに、カニューレ挿入部位と注入部位を検証して、SCFAの影響を受ける可能性のある脳領域を探索しました。全体として、この論文は、腸脳軸研究のために腸由来の代謝物を脳に送達するための正確で綿密で検証された方法を提示します。
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ヒトの胃腸管には、宿主に影響を与える多様な微生物が宿主を宿している1,2,3。これらの腸内細菌は、宿主によって消費される食事成分の利用中に腸由来の代謝産物を分泌することができる4,5。興味深いことに、末梢で代謝されていない腸代謝産物は、循環を介して他の臓器に輸送することができます6。注目すべきことに、これらの分泌された代謝産物は、中枢神経系と腸の間の双方向通信として定義される腸脳軸のメディエーターとして機能することができます7。以前の研究では、腸由来の代謝物が動物の複雑な行動や感情を調節できることが示されています8,9,10,11。
短鎖脂肪酸(SCFA)は、食物繊維と難消化性炭水化物の発酵中に腸内細菌叢によって生成される主要な代謝物です6。酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩は、腸内で最も豊富なSCFAです12。SCFAは、消化管内の細胞のエネルギー源として機能します。腸内の代謝されていないSCFAは、門脈を通って脳に輸送され、脳と行動を調節することができます6,12。以前の研究では、SCFAが神経精神障害において重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています6,12。例えば、自閉症スペクトラム障害(ASD)の動物モデルであるBTBR T+ Itpr3tf/J(BTBR)マウスへの酪酸の腹腔内注射は、彼らの社会的欠陥を救済しました13。うつ病の被験者から微生物叢を投与された抗生物質治療ラットは、不安様行動および糞便SCFAの増加を示した14。臨床的には、ASD患者では、通常発達中の対照と比較して、糞便SCFAレベルの変化が観察されました15,16。うつ病の人は、健康な被験者よりも糞便SCFAレベルが低くなっています17,18。これらの研究は、SCFAがさまざまな経路で動物や人間の行動を変える可能性があることを示唆しています。
微生物代謝産物は、体内の複数の部位に多様な影響を及ぼし、胃腸管、迷走神経、交感神経など、宿主の生理学と行動に影響を与えます4,19。末梢経路を介して代謝物を投与する場合、脳内の腸由来代謝物の正確な役割を特定することは困難です。.この論文では、自由に動くマウスの脳における腸由来代謝物の影響を調べるためのビデオベースのプロトコルを提示します(図1)。SCFAは行動テスト中にガイドカニューレを介して急性に投与できることを示しました。代謝物の種類、量、注入速度は、目的に応じて変更することができます。カニューレ挿入部位を調整して、特定の脳領域における腸代謝物の影響を調べることができます。私たちは、腸由来の微生物代謝物が脳と行動に与える潜在的な影響を探求する方法を科学者に提供することを目指しています。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advil Liqui-Gels 可溶化イブプロフェン A2:D41</td><td>ファイザー</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ 抗ウサギ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>抗蛍光金 (ウサギ ポリクローナル)</td> <td>ミリポア</td><td>AB153-I</td><td></td></tr><tr><td>ボトル トップ真空フィルター、500 mL、0.22 &mu;m、PES、滅菌</td><td>ネスト</td><td>121921LA01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ACSF: 0.14 g/L</td></tr><tr><td>クロルヘキシジン スクラブ 2%</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-611-09</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジン溶液</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-599-09</td><td></td></tr><tr><td>市販ダミー</td><td>RWD Life Science</td><td>62004</td><td>Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm</td></tr><tr><td>市販ガイドカニューレ</td><td>RWD Life Science</td><td>62104</td><td>Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5んん&nbsp;</td></tr><tr><td>市販のインジェクター</td><td>RWD Life Science</td><td>62204</td><td>Single_OD 0.21 mm-33G/ M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>ACSF: 0.61 g/L</td></tr><tr><td>歯科用アクリル</td><td>HYGENIC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>固定ネジ</td><td>RWD Life Science</td><td>62521</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td> 付き<td>Fluoroshield 封入剤</td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BBraun</td><td>XG-LBB-9151133S-1BX</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>パニオン&BFバイオテック</td><td>DG-4900-250D</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3911</td><td>ACSF: 0.19 g/L</td></tr><tr><td>ケトプロフェン&nbsp;</td><td>スイスファーマシューティカル</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン&nbsp;</td><td>アストラゼネカ</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ACSF: 0.19 g/L</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー スリップ</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油ライト、白色 NF</td><td>マクロン ファインケミカルズ</td><td>MA-6358-04</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S9888</td><td>ACSF: 7.46 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>ACSF: 0.18 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>ACSF: 1.76 g/L</td></tr><tr><td>n-ブチルシアノアクリレート接着剤 (組織接着接着剤)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>3M Vetbond</td></tr><tr><td>ニューラルトレーサー&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>SC-358883</td><td>フルオロゴールド</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン チューブ</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>62329</td><td>OD 1.50、I.D 0.50 mm および OD 1.09、I.D 0.38 mm</td></tr><tr><td>Puralube 獣医 (目) 軟膏</td><td>Dechra&nbsp;</td><td></td><td></td>12920060</tr><tr><td>酢酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>SCFA: 13.5 mM</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>SCFA: 8 mM</td></tr><tr><td>プロピオン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1880</td><td>SCFA: 5.18 mM</td></tr><tr><td>ステンレスガイドカニューレ</td><td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td><td>なし</td><td>外径 0.63 mm;地元のベンダー</td></tr><tr><td>ステンレスインジェ</td><td>クターChun Taステンレス鋼企業CO.、LTD。</td><td>n/a</td><td>OD 0.3 mm; ダミーはインジェクターから作られています; 地元のベンダー</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td>KG94548R</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula holder</td><td>RWD Life Science</td><td>B485-68217</td><td></td></tr><tr><td>シーリング カメラ</td><td>FOSCAM</td><td>R2</td><td></td></tr><tr><td>デジタル定位固定装置</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>INNOVIEW</td><td>SEM-HT/TW</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ滅菌器</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>RS1501</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>ライカ顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>鋸歯状、わずかなカーブ。非常に繊細です。0.5mmの先端幅;4インチの長さ&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5918</td><td>4.5インチ角度シャープ</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションコントローラー</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ(WPI)</td><td>MICRO2T</td><td>スマートコントローラー</td></tr>マイクロ<tr><td>インジェクションシリンジポンプ</td><td>ワールドプレシジョンズ(WPI)</td><td>UMP3T-1</td><td>UltraMicroPump3&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロリットルシリンジ</td><td>Hamilton</td><td>80014</td><td>10 &micro;L</td></tr><tr><td>光ファイバー コールド ライト ダブル ファイバー</td><td>ステップ</td><td>LGY-150</td><td>ローカル ベンダー</td></tr><tr><td>ペット トリマー</td><td>WAHL</td><td>09962-2018</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ステップ</td><td>AS-01</td><td>ローカル ベンダー</td></tr><tr><td>ビブラート</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>動物の行動ビデオ追跡ソフトウェア</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>バージョン:15.0.1416</td></tr>ライ<tr><td>カアプリケーションスイートXソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>LASX</td><td>バージョン:3.7.2.22383</td></tr></tbody></table>

自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

腸内細菌叢とその代謝産物が宿主の生理学と行動に与える影響は、この10年間で広範囲に調査されてきました。多くの研究により、腸内細菌叢由来の代謝物が宿主の複雑な腸脳経路を介して脳を介した生理学的機能を調節することが明らかになっています。短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢による食物繊維発酵中に生成される主要な細菌由来の代謝物です。腸から分泌されたSCFAは、末梢の複数の部位で作用し、SCFA受容体の膨大な分布により、免疫、内分泌、および神経応答に影響を与える可能性があります。したがって、SCFAの経口および腹腔内投与を通じてSCFAの中枢および末梢効果を区別することは困難です。この論文は、自由に動くマウスのガイドカニューレ を介して 脳内のSCFAの機能的役割を調べるビデオベースの方法を提示します。脳内のSCFAの量と種類は、注入量と速度を制御することによって調整できます。この方法は、脳内の腸由来代謝物の役割を理解する方法を科学者に提供することができます。

ガイドカニューレ移植からの回復から1週間後にマウスにSCFAを注入し、新規ケージ内の自発運動を評価した。マウスを新しいケージに入れ、最初の5分間で2,100 nLのSCFAまたはACSFを注入しました(送達速度7 nL / s)脳の側脳室に埋め込まれた市販のガイドカニューレを介して脳に注入します。新規ケージ内の自発運動は、注入後さらに30分間記録されました。.SCFAsとACSFの注入では、新規ケージ内の自発運動活動に差は認められなかった(図6)(n = 2匹/群;データはs.e.m.±平均値として示し、双方向ANOVAで分析した)。
脳領域へのガイドカニューレの移植の精度を検証するために、蛍光ニューラルトレーサーをガイドカニューレ を介して SCFAと同じ体積と送達速度でマウスに注入しました(5分で2,100 nL; 7 nL / s)。脳は30分後に組織学のために集められました。蛍光色素は、マウス脳の側脳室および周辺領域で検出された(図7A)...

腸由来の微生物代謝物は、動物の複雑な行動につながる多面的な影響を及ぼします。私たちは、ガイドカニューレを介した脳室内送達を介して脳内の腸由来微生物代謝物の影響を描写するための段階的な方法を提供することを目指しています。

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

腸内細菌叢によって放出される代謝産物は、宿主に複雑な影響を及ぼします。このプロトコルは、マウスの脳と行動における腸代謝物の役割を調べる方法を提示します。この技術は、自由に動くマウスの脳に腸代謝物を送達するための正確で綿密で検証された方法を提供します。私たちは、腸の脳軸研究への洞察のための包括的かつ生理学的な最良の方法論を提供します。マウスを定位固定装置フレームに置き、マウス切歯を定位固定装置用切歯ホルダーの切歯バーに固定します。ノーズコーンマスクで鼻を覆います。次に、上部ピンチ反射を介してマウスの侵害受容を評価し、手術部位を切開する前に一定の呼吸数を確保します。頭の上のトリミングされた毛皮が粘着テープによって取り除かれたら、痛みを和らげ、目の軟膏を塗るために鎮痛剤ケトプロフェンを皮下注射します。次に、先のとがったイヤーバーを外耳道に挿入して頭を固定します。切歯ホルダーのノーズクランプを締め、頭をそっと押して頭が固定されていることを確認します。頭皮を消毒するためにクロルヘキシジン綿棒の3つの交互のスクラブを使用してください。次に、解剖メスを使用して、前方後方の頭皮に1センチメートル未満の切開を行います。切開部を開いた後、微小解剖鉗子で保持した綿棒で頭蓋骨を拭きます。定位固定装置座標に基づいて、原稿に記載されているように右側脳室の位置を特定し、ラベルを付けます。次に、固定装置用ドリルを使用して、ラベル付けされた部位の頭蓋骨に穴を開け、その後、頭蓋骨にさらに2〜4個の穴を開けます。リドカイン綿棒で頭蓋骨を拭き、穴に2〜4本のステンレスネジを取り付けます。市販のガイドカニューレを定位固定装置用カニューレホルダーに置き、ガラス速度滅菌器で摂氏150度で消毒します。次に、定位固定装置カニューレホルダーを側脳室用に開けられた穴に移動し、目的の深さに達するまで市販のガイドカニューレを穴にゆっくりと挿入します。次に、10マイクロリットルのn-ブチルシアノアクリレート接着剤を塗布して、市販のガイドカニューレをドリル穴に固定し、3〜4分間待ちます。市販のガイドカニューレを定位固定装置用カニューレホルダーからそっと解放し、切開した頭皮に歯科用アクリルを塗布して市販のガイドカニューレを固定し、少なくとも5分間待ちます。市販のダミーを市販のガイドカニューレに埋め込みます。次に、麻酔からの回復のために、下に加熱パッドが付いた新しいケージにマウスを置き、マウスが完全に目覚めるまで観察し続けます。10マイクロリットルの蒸留水を含むマイクロリットルシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付けます。インスリン注射器を使用して、ポリエチレンチューブに蒸留水を満たし、マイクロリットルシリンジを吊り下げポリエチレンチューブに接続します。マイクロインジェクションコントローラーの電源を入れ、すべてのチャンネルを表示を押してコマンド画面にアクセスします。次に、構成を押して、ボリューム目標を毎秒100ナノリットルの配信速度で9, 800ナノリットルに設定します。次に、方向を押して注入モードに切り替え、実行を押して、マイクロリットルシリンジに接続されたポリエチレンチューブから9, 800ナノリットルの蒸留水を注入します。次に、インジェクターを鉱油を含むバイアルに入れ、構成を押して、体積目標を3, 000ナノリットルに設定し、送達速度を毎秒100ナノリットルに設定します。3, 000ナノリットルの鉱油を引き出すには、方向を押して撤回モードに切り替えてから、実行を押します。ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジ針から分解します。マイクロリットルのシリンジ針から3, 000ナノリットルの蒸留水を吐き出すには、方向を押して注入モードに切り替え、実行を押します。次に、マイクロリットルのシリンジをポリエチレンチューブに戻します。インジェクターをSCFAを含むバイアルに入れます。構成を押して、ボリューム目標を9, 500ナノリットルに設定し、配信速度を毎秒100ナノリットルに設定します。方向を押して撤回モードに切り替えて実行を押して、9, 500ナノリットルのSCFAを引き出します。オイルSCFA相にラベルを付けて、SCFAが正常に注入されたかどうかを検証します。構成を押して、配信速度で目的のボリュームターゲットを7ナノリットル/秒に設定します。方向を押して注入モードに切り替えます。SCFA注射用のカニューレにインジェクターを挿入する前に、市販のインジェクターの前端に液体が出るまで、実行を押してマイクロリットルのシリンジを前方に注入します。マウスに麻酔をかけた後、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入します。マウスが麻酔から回復したら、新しいケージに入れ、35分間自由に探索します。最初の5分間で2, 100ナノリットルの目標体積に対して毎秒7ナノリットルの送達速度を使用してSCFAを注入する。次に、方向を押して注入モードにし、実行を押します。動作テストの後、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレから取り外します。注入部位を確認するために、毎秒7ナノリットルの送達速度で2, 100ナノリットルの中性トレーサーを注入する。蛍光顕微鏡を使用して注入部位の蛍光シグナルを画像化します。ACSFおよびSCFAを注入したマウスの両方が、新規ケージ内で合計35分間移動した。新規ケージの自発運動活動は、SCFAの注入とACSFの間で観察されませんでした。.蛍光色素は、市販のガイドカニューレを注入したときにマウス脳の側脳室および周辺領域で検出された。同様に、ステンレス鋼ガイドカニューレを介した注入は、側脳室およびマウス脳の周辺領域における信号の検出をもたらす。この手順を回路ベースの神経技術と組み合わせることで、科学者は脳の回路ベースの制御と腸代謝物によってもたらされる行動についての洞察を得ることができます。この技術は、研究者が複雑な腸の脳軸における微生物叢と代謝物の役割を探求するための道を開きます。

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