RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

RNA FISH染色は、微生物叢細菌や細胞内病原体など、C.elegansに自然にコロニー形成または感染する微生物の可視化、同定、定量に役立ちます。この技術は単純、迅速、堅牢であり、無傷の動物全体の状況で微生物を効果的に染色および視覚化することができます。RNA FISHを使用して、野生のC.elegansの腸内細菌叢を検出して視覚化することができます。

これは、哺乳類のシステムにおける比較可能な相互作用を理解するのに役立ちます。線虫を目的の微生物とともにNGMプレートから微量遠心チューブに移した後、1ミリリットルの1X PBSTを微量遠心チューブに加えて線虫を洗浄します。マイクロ遠心分離機またはナノフュージでサンプルを適切な速度でスピンダウンします。

ピペットを使用して、100マイクロリットルを除くすべての上清を除去します。PBSTによる洗浄を2〜3回繰り返します。線虫をパラホルムアルデヒドで固定するには、線虫ペレットの上に100マイクロリットルの上清を含むマイクロフュージチューブに33マイクロリットルの16%パラホルムアルデヒドを加えて、最終濃度4%パラホルムアルデヒドにすることから始めます。

目的の微生物にコロニー形成または感染した線虫を含むサンプルを室温で30〜45分間インキュベートします。パラホルムアルデヒド溶液を除去し、0.5ミリリットルのPBSTをサンプルに加えます。テキスト原稿に記載されている適切な速度でマイクロ遠心分離機でサンプルをスピンダウンします。

ピペットで、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を取り除きます。0.5ミリリットルのPBSTをマイクロフュージチューブ内のサンプルに加えます。PBSTによる洗浄を2〜3回繰り返します。

最後の洗浄に続いて、サンプルをスピンダウンして上清を除去し、ペレットを乱さないままにします。次に、1サンプルあたり1ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーを調製する。線虫ペレットを含むマイクロフュージチューブに800マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを追加します。

マイクロ遠心分離機でサンプルをペレット化します。ペレットを乱すことなく上清を除去します。所望のFISHプローブとのハイブリダイゼーションバッファーのサンプルあたり100マイクロリットルを、マイクロリットルプローブおよびボルテックスあたり5〜10ナノグラムの最終濃度まで調製して混合する。

FISHプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーを各サンプルに100マイクロリットル加えます。チューブを軽くフリックまたは反転させて混ぜます。サンプルを摂氏46〜54度のドライバスまたは摂氏46〜54度のサーマルミキサーで毎分1, 200回転で一晩インキュベートします。

サンプルあたり3ミリリットルの洗浄バッファーを調製します。サンプルを適切な速度で遠心分離します。線虫ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用してハイブリダイゼーションバッファーを除去します。

各サンプルに1ミリリットルの調製洗浄バッファーを加えます。サンプルを適切な速度で遠心分離します。ペレットが乱されないように注意しながら、ピペットを使用して洗浄バッファーを取り除きます。

各サンプルに1ミリリットルの調製洗浄バッファーを加えます。サンプルを摂氏48〜56度のドライバスまたはサーマルミキサーで摂氏48〜56度、毎分1, 200回転で1時間インキュベートします。ドライバスでインキュベートする場合は、15〜20分ごとにチューブを静かに反転させます。

サンプルを適切な速度で遠心分離します。ピペットを使用して、ペレットが邪魔されないように注意しながら、洗浄バッファーを取り除きます。各サンプルに100〜500マイクロリットルのPBSTを追加します。

この時点で、サンプルは、プロトコルを継続する準備ができるまで、摂氏4度のPBSTに最大1週間保存できます。適切な速度でサンプルをペレット化します。線虫ペレットを乱すことなく、できるだけ多くのPBSTを除去します。

DAPIを含む20マイクロリットルの退色防止封入剤をサンプルに追加します。20マイクロリットルのピペットチップを200マイクロリットルのピペットチップでロードし、はさみを使用してピペットの先端を切り取り、より大きな線虫をピペットで移すことができます。カットしたピペットチップで、5〜10マイクロリットルのペレットを顕微鏡スライドに移します。

22 x 22のカバーガラスで覆います。スライドを保管するには、カバーガラスの端をマニキュアで密封し、さらに使用する準備ができるまで摂氏4度の暗い箱に入れておきます。微分干渉造影顕微鏡下で、野生のCaenorhabditis tropicalis株は、腸上皮に配向的に接着しているように見える細菌でコロニー形成されていることが判明した。

緑色のユニバーサル16S rRNAプローブと赤色のアルファプロテオバクテリア種プローブからの蛍光シグナルは完全に重なり合っており、腸にコロニーを形成するほとんどの細菌が付着しているアルファプロテオバクテリア細菌であることを示唆しています。オルセーウイルスの二部RNAゲノムは、RNA1セグメントとRNA2セグメントからなり、両方のセグメントを標的とするFISHプローブが開発されています。緑色蛍光タンパク質でタグ付けされたZIP1タンパク質は、細胞質内で陽性のオルセーウイルスFISH染色を示す細胞の腸内核に局在しているのが見られる。

オルセー特異的またはN.parisii特異的FISHで染色された複数の動物は、容易に定量化できるようにこのシグナルの強度を示すことが示されています。18Sへの結合を競合する種特異的プローブを使用した2つの微胞子虫寄生虫とのC.elegansの同時感染、核を染色するためのDAPIの使用は、動物全体、特に大きくて容易に識別可能な核を有する腸の状況における感染のより良い局在化を可能にする。N.parisiiによる感染は、胞子へのメロンの発生をもたらします。

得られたFISH染色は、N.parisii特異的プローブで赤色に染色されたN.parisii胞子に対応する可能性が高い大小の棒状構造を示しています。固定剤を選択する際には、PFA固定により形態とトランスジェニックGFPの保存が向上しますが、スポロプラズムの視覚化にはアセトン固定が必要であることに注意してください。RNA FISHは、C.elegans腸にコロニーを形成する細菌を同定し、可視化するために使用できます。

その後、研究者は、これらの宿主と微生物の相互作用に関与する因子を特定するために、より多くの遺伝子スクリーニングを実行できます。