Name: 成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ 誘導性トランスジェニック系統追跡法を用いて、成体マウス脳における幹細胞の活性化、増殖、移動、分化を時空間的に解析する方法。この技術は神経変性疾患の研究と脳可塑性の理解に貢献します。

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著者らは、ダイアナ・カルロン博士(ボストン小児病院、ハーバード大学医学部)とマシュー・ラインズ博士(ジョスリン糖尿病センター;メイン州医療センター研究所)の動物を利用した指導のため。

著者らには開示するものは何もありません。

インビボで成体マウス脳内のマウス系統マーキング幹細胞をトレースするトリプルトランスジェニック系統の作成、利用、および解析のための方法が記載されている。免疫染色または脳クリアリングと組み合わせると、脳全体のトレースされた蛍光細胞の同定および特性評価を達成することができる。この技術は、標識幹細胞が活性化、遊遊、分化、または増殖する際に、標識幹細胞の塑性/再生/リモデリングの可能性を理解する能力を提供する。チミジン−H3およびBrdUによる標識保持を介して得られた以前のデータは、V−SVZ、嗅球、および歯状回の顆粒下帯が成体哺乳動物2、3、4、5、6、7、8、...

<table><tbody><tr><td>抗体希釈剤</td><td>アジレント</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>抗原賦活化液</td><td>アジレント</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>インビトロジェン</td><td>A2311</td><td>1:500-1:000</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(CG)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX:007676</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング溶液 (IHC)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>鈍針</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain block</td><td></td><td>Braintree BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>コーニング</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>ジベンジルエーテル</td><td>ミリポア</td><td>Sigma 33630</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline Hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>豚粘膜由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>この製品はその後製造中止になりましたが、Glyo-Fixx(Therm Scientific、6764265)</td></tr>過<tr><td>酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHCセレクトTBSリンスバッファー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20845</td><td></td></tr>ケ<tr><td>タミン</td><td>ウェストワード</td><td>0143-95095-10</td>に置き換えることができます<td>この製品の保管と使用にはDEAライセンスが必要です。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ミリポアブロック</td><td>ミリポア</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>封入媒体</td><td>ミリポア シグマ</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>最適切断温度ソリューション</td><td>サクラ</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBSソリューション (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Sagittal brain block</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sudan (Typogen) Black</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>ティッシュカートリッジ</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

「Tet-On」系oTet-CreマウスをTertプロモーターに連結した新規な逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)導入遺伝子と交差させることにより、成体組織幹細胞の挙動と運命を調査するためにテロメラーゼ逆転写酵素(Tert)系統追跡マウス系統が開発され、成体脳幹細胞の新規集団を示すことが実証された。ここで、テトラサイクリン誘導体ドキシサイクリンをmTert-rtTA::oTet-Creマウスに投与すると、遺伝子Tertのプロモーター領域の4.4 kbフラグメントを発現する細胞集団を不滅にマークする。Rosa-mTmGレポーターを併用すると、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスは、ドキシサイクリン処理がTertも発現する細胞においてmTomato発現を膜EGFP(mGFP)で置換することを誘導するまで、膜tdTomato(mTomato)を発現する。したがって、これらのトリプルトランスジェニック系統追跡マウスがドキシサイクリン(TERT発現細胞がマークされる「パルス」期間)を受けると、これらの細胞は不滅にマークされたmGFP+細胞となり、その後にTert発現が失われても、ドキシサイクリン除去後(「追跡」期間)の任意の望ましい時間追跡することができる。次に、幹細胞の活性化、増殖、系統のコミットメント、さまざまな脳ニッチへの移行、成熟した細胞型への分化の変化を解釈するために、脳を灌流固定し、免疫蛍光やその他の下流アプリケーション用に処理します。このシステムを使用して、任意のrtTAマウスをoTet-CreおよびRosaレポーターに交配させ、幹細胞のマーカーを使用してドキシサイクリン誘導性「パルスチェイス」系統追跡実験を行うことができる。

蛍光レポーターを備えたTet-Onシステムから生じる蛍光シグナルは、目的のプロモーターおよび使用される蛍光色素によって異なるが、我々は、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG動物を用いて所見をどのように分析したかを説明する。パルスチェイス後の成体脳の分析は、様々な解剖学的ニッチ全体にわたって膜GFP発現細胞をもたらした。様々な細胞型間の蛍光強度の違いに注意しなければならない。蛍光強度に関する1つの変数は、細胞膜のサイズである。例えば、脈絡叢内の脈絡膜上皮細胞(CPEC)は、厚い細胞膜と強い蛍光シグナルを有し、周囲の細胞と容易に区別できる(図4A、B)。しかし、脈絡叢間質における他のより小さく、現在同定されていない細胞型は、より弱いGFPシグナルを有していた(図4C)。小脳では、バーグマングリア細胞はバスケット細胞よりも高いレベルのmGFPを発現し、個々のバスケット細胞間でもmGFP発現のばらつきが存在した(図4D</st...

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、 インビボでの活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析を可能にする。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多能性に関する新しい情報を明らかにすることができる。

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

幹細胞およびその子孫を誘導性トランスジェニック系統追跡マウス系統でマーキングすることにより、in vivoにおける脳内の成体幹細胞の活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析が可能になる。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多効力に関する新しい情報を明らかにすることができる。トランスジェニック系統追跡アプローチの利点には、特定の細胞系譜をトレースする特異性、細胞の代謝回転または分化に関係なく蛍光タンパク質の消去不能な発現、ドキシシリンの低毒性、条件付き活性化、および免疫染色および免疫蛍光を含む系統痕跡組織上の一般的な下流アッセイでの使いやすさが含まれる。成体脳における可塑性と細胞の広範な意味合いのために、成体幹細胞の特性評価と分析は、神経変性疾患の研究、脳の可塑性に対する代謝的影響、老化、およびその他の関連状態の情報を提供するのに役立ちます。開始するには、室温まで温め、氷冷アセトンで15分間固定後処理します。スライドを1Xすすぎ緩衝液中で5分間洗浄し、各工程の間に室温で毎分60回転で振とうする。核抗原を0.3%Triton X-100で室温で10分間静置するために透過処理する。0.3%Tween-20で細胞質抗原を室温で10分間静置するために透過させる。50~100ミリリットルの1x DAKO抗原検索液中のスライドを10分間、2回、低温で電子レンジで電子レンジで包み込み、抗原検索を行います。次に、緩衝液で室温で5分間リンスする。スライドを0.3%Typogen Black中の70%エタノール中で室温で20分間インキュベートし、その後すすぎ緩衝液で洗浄する。組織の周りに疎水性バリアを描きます。ブロッキング試薬で摂氏37度で20分間ブロックします。抗体希釈液で希釈した一次抗体と共に摂氏4度で一晩インキュベートした。スライドを室温で10分間洗浄する。翌日、切片をAlexa Fluor二次抗体中で室温で10分間インキュベートする。次いで、すすぎ緩衝液中でスライドを10分間2回洗浄する。AlexaFluor 488にコンジュゲートした1~500個の抗GFP抗体を100マイクロリットルで脳切片を覆い、摂氏4度で一晩インキュベートして内因性Fluor4を増強し、トレースされた細胞をマークします。翌日、すすぎ緩衝液で2回洗浄する。そして、流したDI水で5分間洗い流します。1ミリリットルあたり100ナノグラムの4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを5分間カウンターシミで染色する。その後、流したDI水で5分間洗浄する。各組織セクションの上に蛍光安全マウント媒体を1滴加え、22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップでシールします。最適な信号を確保するために、取り付け当日にイメージングをお勧めします。心経灌流後の固定および切片

lineage-tracing-inducible-fluorescently-labeled-stem-cells-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞...

遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの</em

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。...

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

出典:Gómez-Villafuertes, R., et.., ライブイメージングとそれに続くシングルセルトラッキングにより、細胞生物学と複数の神経集団の系統進行をモニタリングします。J. Vis. Exp. (2017)...

成体神経幹細胞の神経系統をモニタリングするためのライブイメージングとシングルセルトラッキング

出典:Daynac, M., et.alです。成体マウス脳室内ゾーンからの神経幹細胞および前駆細胞の細胞選別とそれらの細胞周期ダイナミクスのライブイメージング。J. Vis. Exp.

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経幹細胞分裂のタイムラプスイメージング

私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

この記事では、R26R-Confettiマウスを使用した多色系統追跡実験を設計し実行するための原理について説明します。私たちは、他の関心のある組織に修飾できる角膜上皮細胞を追跡するための特定のプロトコルを提供します。...

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析を用いて、単一細胞レベルで候補遺伝子の系統トレースと機能遺伝子解析を行うプロトコルを紹介する。MADMクローン解析は、個々の前駆細胞とその娘細胞の増殖行動、細胞出力、および系統関係を測定するための定量的枠組みを提供します。...

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ 誘導性トランスジェニック系統追跡法を用いて、成体マウス脳における幹細胞の活性化、増殖、移動、分化を時空間的に解析する方法。この技術は神経変性疾患の研究と脳可塑性の理解に貢献します。

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

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