解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査
2022年8月4日
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとマイクロ流体RT-qPCRの組み合わせは、単一ニューロンおよびグリアのトランスクリプトームを測定する際に解剖学的およびバイオテクノロジーの特異性を提供します。精神疾患に対するシステムの生物学的アプローチによる創造的な方法を適用することは、依存症における神経炎症反報酬仮説などの理解と治療におけるブレークスルーにつながる可能性があります。
このプロトコルは高感度で、シングルセル分解能での遺伝子発現プロファイルのハイスループットキャプチャを可能にします。この技術は、単一細胞分解能で解剖学的空間的特異性と分子特異性の両方を提供します。脳を採取し、単一細胞を選択し、mRNAを調製した後、プライミングのためにコントロールライン液をqPCRチップに注入します。
qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。Primeスクリプトを選択し、プログラムを実行します。プログラムが完了したら、プライミングされたqPCRチップを取り出し、6マイクロリットルの反応をPCRサンプルプレートからプライミングされたqPCRチップの対応するサンプルウェルにピペットで入れます。
次に、6マイクロリットルの反応物をPCRアッセイプレートからプライミングされたqPCRチップ内の対応するアッセイウェルにピペットで入れます。次に、チップをマイクロ流体混合装置に挿入します。Load Mix スクリプトを選択し、プログラムを実行します。
マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームの電源を入れ、電球を温めます。マイクロ流体混合装置からqPCRチップを取り外し、チップの下部から保護ステッカーをはがします。マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームを開き、qPCRチップをプラットフォームにロードします。
[新しい実行の開始]をクリックして、データ収集ソフトウェアを起動します。チップのバーコードとチップの種類を確認します。次に、[次へ]をクリックします。
チップ実行ファイルを選択し、データ収集ストレージのファイルの場所を参照します。次に、[アプリケーションタイプ]をクリックして、[遺伝子発現]を選択します。パッシブリファレンス、シングルプローブにはROXを、プローブタイプにはEVAGreenを選択します。
クリックして熱サイクルプログラムを選択し、Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2を選択します。PCL ファイルにエクスポートします。データ分析ソフトウェアをダウンロードします。
ソフトウェアを起動して、マイクロ流体RT-qPCR実験を分析します。[チップラン]をクリックして、チップランを開きます。実験ツールによって作成された BML ファイル。
パッシブリファレンス、プローブ、PCRサーマルプログラムなどの実験の詳細を表示するウィンドウがポップアップ表示されます。[チップ エクスプローラ]タブで、[サンプル プレート設定]をクリックし、新しいサンプル プレート テンプレートを作成します。サンプルラベルをコピーして、実験計画に従ってソフトウェアスプレッドシートに貼り付けます。
サンプル名と標準サンプルに使用するRNA濃度を入力します。次に、タスク メニューから [マップ] をクリックし、[SBS96-Left.dsp] を選択して、サンプル セットアップをマップします。次に、[詳細ビュー]を選択してファイル内のこれらの変更を更新し、[分析]をクリックします。
検出器プレートのセットアップを選択し、新しいアッセイプレートを作成します。適切なコンテナーの種類と形式を選択します。実験デザインに従ってアッセイ名を貼り付け、分析をクリックします。
分析設定ペインで、ユーザーをクリックし、フィットを自動に設定します。次に、96x96チップの各反応を手動で確認します。増幅曲線と融解曲線を視覚化して、各反応が予想されるqPCRパターンに従っているかどうかを判断します。
増幅曲線または融解曲線が予想と一致しない場合は、その反応に失敗します。QCに続いて、ファイルを選択し、[エクスポート]をクリックしてデータをエクスポートし、データセットをcsvファイルとして保存します。エクスポートされた csv ファイルには、パス フェイル マトリックスと生の CT 値を持つマトリックスの両方が含まれているため、パス フェイル マトリックスを使用して、データセット内の失敗したセルを NA に置き換えます。オープンソースRソフトウェアの最新バージョンをダウンロードしてから、R Studioアプリケーションをダウンロードします。
中央値のセンタリングでは、Rソフトウェアを使用して、個々のサンプルのすべてのCT値から計算されたCT値の中央値を計算し、この中央値からすべての個々のCT値を減算して、マイナスデルタCT値を取得します。ハウスキーピング遺伝子の正規化では、各サンプルのハウスキーピング遺伝子の平均発現を計算し、この値を使用して個々のCT値を差し引きます。マイナスのデルタデルタCT値を生成するには、Rソフトウェアでコードを実行します。
正規化されたデータセットを R にアップロードし、スケール関数を使用してデータを分析し、スケーリングされたデータを生成してから、R ヒート マップ関数または別のソフトウェアを使用してヒート マップを生成します。他の機能のためにデータセットを整理するには、各遺伝子間のピアソン相関を計算し、続いてmelt関数を計算します。このデータをエクスポートし、遺伝子相関ネットワークソフトウェアにアップロードします。
ニューロンはNeuNの発現上昇を示し、ミクログリアサンプルはミクログリアマーカーCd34およびCx3xr1の有意な発現を示した。Th+ニューロンサンプルは、Thニューロンおよびミクログリアサンプルと比較して、Thの発現が有意に上昇したことを示しました。ThニューロンはGcgの有意な発現を示し、Thニューロンサンプルが神経伝達物質としてGlp1を使用するニューロンで濃縮されていることを示唆しています。
線形識別分析は、これら3つの細胞タイプが65遺伝子すべてにわたって異なる遺伝子発現プロファイルを有することを示した。アルコール離脱時系列によるGlp1濃縮ニューロンサンプルの細胞サブ表現型をヒートマップを用いて表した。炎症性遺伝子クラスター1を高度に発現するサブ表現型Aは、8時間の離脱時点で比率が増加し、32時間の離脱で最大に達する。
炎症性サブ表現型は、176時間の離脱によって制御するように正規化される。GABA受容体遺伝子クラスター2を高発現するサブ表現型Bは、176時間の離脱条件によるこの遺伝子クラスターの発現の全体的な抑制を示す。個々のサンプルの遺伝子発現を平均に組み合わせて、遺伝子クラスターの発現とその遺伝子転写産物のタンパク質位置を時系列全体で視覚化できるようにしました。
この技術は、疾患または摂動に対する細胞応答を理解するために、任意の生物学的システムまたは組織に適用することができる。それは、組織の空間的および解剖学的構造に関連する単一細胞分解能での分子応答を解読することです。
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概要
本研究では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとマイクロ流体RT-qPCRを活用し、個々のニューロンおよびグリア細胞におけるトランスクリプトームを解析します。本手法の高い感度と特異性に重点を置くことで、神経炎症に関連する精神疾患、特に依存症における理解を深めることが期待されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 転写解析
- 精神疾患
背景
- ニューロンおよびグリア細胞におけるRNA発現パターンの理解は、精神疾患を解明する上で極めて重要である。
- 従来の手法は、解剖学的な空間特異性と分子特異性の両方が不足していた。
- 神経炎症は、依存症の抗報酬仮説に関与しているとされる。
研究目的
- 単一細胞解像度で遺伝子発現プロファイルをキャプチャするための高感度な手法を開発すること。
- これらの分子変化が精神疾患における行動反応とどのように関連しているかを分析すること。
- 依存症関連メカニズムにおける神経炎症の役割を評価すること。
使用方法
- マイクロ流体RT-qPCRを用いることで、単一細胞からのハイスループットなデータ収集を可能にした。
- mRNAの調製および解析のため、採取後の脳組織から単一細胞を分離した。
- チップのプライミング、データ収集、および解析に関する詳細なプロトコルを実施した。
- 遺伝子発現データを検証し、統計ソフトを用いて解析した。
主な結果
- ニューロンではNeuNの発現上昇が認められ、一方でミクログリアではCd34およびCx3xr1の有意な発現が認められた。
- 遺伝子発現プロファイルに基づき、特に離脱および神経炎症への反応において、異なるサブタイプが特定された。
- ヒートマップ解析から、離脱ストレス中の遺伝子クラスターとその制御に関する主要な結論が導き出された。
結論
- 本研究は、これらの手法を組み合わせることで、神経炎症に対する細胞型特異的な反応をより深く理解できることを示しています。
- 得られた知見は、依存症を伴う精神疾患に対する標的治療法の開発に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
解剖学的特異性を伴うシングルセル遺伝子発現プロファイリングは、神経精神疾患の標的探索において、特に依存症および抗報酬経路におけるメカニズム的なリスク低減を可能にします。このアプローチは、神経炎症のドライバーに関する高解像度の知見を提供し、分子病理学と行動表現型の接点における予測の信頼性を高めます。これらの手法を早期探索パイプラインに統合することで、CNS（中枢神経系）創薬におけるポートフォリオの選別およびトランスレーショナルな連続性が向上します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 単一細胞解像度で神経炎症および抗報酬仮説の検証を可能にする。
- 遺伝子発現を解剖学的および表現型特異性と結びつけることで、機能的ターゲットのバリデーションをサポートする。
- 依存症および離脱症状に関与するCNSターゲットのメカニズム的なリスク低減を促進する。
- 神経精神疾患ターゲットを前進させるための予測的信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流のトランスクリプトーム解析およびフェノタイプスクリーニングに向けた、バリデート済み細胞系の調製を可能にします。
- アッセイの標準化に不可欠な、定量的で再現性のある遺伝子発現出力を提供します。
- 定義された細胞型における遺伝子ネットワークの高スループット解析を実現します。
- 神経炎症経路に対する化合物の影響について、信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 依存症モデルにおける分子レベルの知見を、疾患に関連する神経解剖学的システムと整合させます。
- 神経炎症バイオマーカーの探索から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 中枢神経系（CNS）治療プログラムにおける、リスク調整後の進展決定に情報を提供します。
- 遺伝子発現を離脱表現型にマッピングすることで、トランスレーショナル・バイオマーカーの開発を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、中枢神経系（CNS）組織においてハイスループットで解剖学的に精密な遺伝子発現解析を可能にすることで、初期段階の発見と前臨床研究を橋渡しします。
- 探索生物学：神経炎症および抗報酬メカニズムの仮説検証と経路の解明を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物スクリーニングに不可欠な、再現性と定量性のある遺伝子発現データを提供します。
- アナリティクス：ネットワーク解析、ヒートマップ作成、および細胞表現型の統計的比較に適した、拡張可能なデータセットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：分子シグネチャーを疾患に関連する離脱状態やバイオマーカーの整合性に結びつけます。
- 企業内での再利用：多様なCNS（中枢神経系）および疾患モデルにわたるシングルセル・トランスクリプトミクスの再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CNSターゲット検証における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：標準化され、拡張可能で再現性のあるシングルセル遺伝子発現ワークフローを提供します。
- 戦略的価値：神経精神疾患のR&Dにおいて、情報に基づいたGo/No-Go判断と資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後のCNS治療候補物質の優先順位付けと推進をサポートします。
実施上の検討事項
- レーザーキャプチャーマイクロダイセクションおよびマイクロフルイディクスRT-qPCRプラットフォームに関する専門知識が必要である。
- ハイスループットのデータ処理およびネットワーク解析のための、堅牢な分析インフラストラクチャが求められる。
- サンプル調製およびデータ正規化プロトコルの、チーム間での標準化が必要である。
- 適切な最適化を行うことで、さまざまなCNS組織および疾患モデルに適応可能である。
- 専門的な計測機器およびバイオインフォマティクスによるサポートへのアクセスに依存する。
