Name: ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境解析法。ホルマリン固定パラフィン包埋組織で単一細胞解像度の定量と40マーカー同時検出が可能。抗体最適化の重要性と高品質イメージングの実現方法を解説。

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著者らは、この記事の編集のためにMDアンダーソンの研究医学図書館であるEditing ServicesのDon Norwoodと、MDアンダーソンの翻訳分子病理学部門のMultiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratoryを認めている。この出版物は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターがん免疫モニタリングおよび分析センター(CIMAC)への国立がん研究所(NCI)協力協定(U24CA224285)を通じて提供されたがん免疫モニタリングおよび分析センター-がん免疫学的データコモンズネットワーク(CIMAC-CIDC)に対する科学的および財政的支援によって促進された研究から部分的にもたらされました。

<ol><li>Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Beyond the tumour microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).</li>
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<li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Rad, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pandora%27s+box+of+novel+technologies+that+may+revolutionize+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.</a> Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).</li>
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著者らは開示すべき矛盾はありません。

TMEの複数の構成要素間の複雑で複雑な相互作用の包括的な解明は、依然としてがん研究の重要な目的である。メーカーは、この取り組みの一環として、特に過去5年間に多数の多重化アッセイを導入してきました。多重化空間解析は、腫瘍サンプルの構造形態を維持しながら、複数のターゲットの同時分類を容易にする汎用性と強力なツールです。空間分析技術は、本明細書11、12、13に記載の技術などの蛍光画像化または質量分析を用いて行うことができる。
染色の前に、抗体染色の再現性を標準化するために、通常の免疫組織化学プロトコルとそれに続く染色プロトコルを使用した抗体最適化が必要です。非常によく知られた事実は、異なる正規抗体クローンが異なる条件下で最適な発現を有し得ることである。しかしながら、抗体を金属タグと結合させるためには、パネルに組み込まれたすべての抗体について抗原検索のために同じpHを規定しているように、キャリアフリーの...

クローン性腫瘍集団を取り巻く多数の細胞型の重要性は、発癌の分類において重要な要素である。この腫瘍微小環境(TME)組成と相互作用の解明への関心は、がん治療兵器の一部としての免疫ベースの治療法の確立に続いて継続的に高まっています。したがって、治療戦略は、腫瘍中心のアプローチからTME中心のアプローチに移行している1.
近年、腫瘍サーベイランスやがん発生における免疫細胞の役割を解明する取り組みが目覚ましく増加しています2,3.医学研究では、サイトメトリーベースの方法やシングルプレックスおよびマルチプレックスイメージング技術など、TMEの複数の要素のユニークな相互作用を解読するこの試みの一環として、多数の方法が生まれました。
フローサイトメトリー(1960年代に発明)、蛍光活性化細胞ソーティング、マスサイトメトリーなどの先駆的な方法は、主にTME成分4の同定と定量に焦点を当てています。サイトメトリーベースの定量的手法は免疫ランドスケープ表現型化を可能にするが、細胞空間分布を決定することは不可能である。逆に、標準的なシングルプレックス免疫組織化学などの方法は、組織アーキテクチャを保持し、研究者が細胞分布を分析することを可能にするが、単一の組織切片における標的の数の減少は、これらの方法の限界である5,6。過去数年間で、マルチプレックス免疫蛍光、バーコード蛍光イメージング、イメージング質量分析などの単一細胞分解能のための多重イメージング技術が、同じ組織セクション7を使用して同時マーカー染色に関する情報を取得するための包括的な戦略として浮上してきました。
ここでは、金属タグ付き抗体と二次イオン質量分析を結合し、ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)、および新鮮凍結(FF)組織サンプル8,9を用いた単一細胞分解能定量、マーカー共発現(表現型解析)、空間分析を可能にする技術を紹介します。FFPEサンプルは、組織アーカイブサンプルに最も広く使用されている材料であり、新鮮な凍結サンプル10よりも多重化イメージング技術のためにより容易に利用可能なリソースを表す。さらに、この技術は数ヶ月後に画像を再取得する可能性を提供します。ここでは、FFPE組織サンプルを用いた染色および画像処理プロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>100% 試薬アルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>95% 試薬アルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>80% 試薬アルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>70% 試薬アルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>イオンパス</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X 低バリウム PBS pH 7.4</td><td>イオンパス</td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X トリス pH 8.5&nbsp;</td><td>イオンパス</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4°C;C冷蔵庫</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットチップP10</td>オ<td>リンパス</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットチップP20</td>オ<td>リンパス</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットチップP200</td>オ<td>リンパス</td><td>24-412</td><td></td></tr>エア<tr><td>ロゾルバリアピペットチップP1000</td>オ<td>リンパス</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルターUltrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン H2O</td><td>イオンパス</td><td>567002</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip スライド染色ジャー、緑色</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip スライド染色ジャー、黄色</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDipスライド染色キット(ジャー+ラック)、白色</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyDipステンレススチールホルダー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 70% EMグレード</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>熱誘起エピトープ賦活化(HIER)バッファー:10X トリス、EDTA、pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>耐熱スライドチャンバー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>62705-01</td><td></td></tr><tr><td>疎水性バリアペン</td><td>フィッシャー</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>MIBI / Oソフトウェア</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIcontrolソフトウェア</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIslide</td><td>Ionpath</td><td>567001</td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td></td><td>Ionpath NA</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>モイスチャーチャンバー (湿潤チャンバー)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>PT モジュール</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>急流滅菌ディスポーザブルフィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>097403A</td><td></td></tr><tr><td>シェー</td><td>カーBioRockerS2025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンカラム(Ultrafree-MCスピンフィルター、0.5mL 0.1&mu;m)</td><td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>スライドオーブン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>真空キャビネットデシケー</td><td></td><td>ターVWR30621-076</td><td></td></tr>タスク<tr><td>ホイップ</td><td>キンバリークラーク</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

免疫ベースの治療法の進歩は、がんの治療と研究に革命をもたらしました。これは、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価に対する需要の高まりを引き起こしました。標準的な免疫組織化学は組織構造の研究には適しているが、少数のマーカーの分析に限定される。逆に、フローサイトメトリーなどの技術は、組織形態に関する情報は失われるが、複数のマーカーを同時に評価することができる。近年、表現型解析と空間解析を統合した多重化戦略が、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価への包括的なアプローチとして浮上している。 ここでは、金属標識抗体と二次イオン質量分析を組み合わせた革新的な技術について、アッセイの開発と最適化、組織の準備、画像の取得と処理における技術的ステップに焦点を当てて説明します。染色する前に、金属標識抗体パネルを開発し、最適化する必要があります。このハイプレックス画像システムは、単一の組織切片で最大 40 個の金属タグ付き抗体をサポートします。注目すべきは、信号干渉のリスクは、パネルに含まれるマーカーの数とともに増加することです。パネル設計後、この干渉を最小限に抑えるために、抗体への金属同位体割り当てに特に注意を払う必要があります。予備パネル試験は、抗体の小さなサブセットおよび対照組織におけるパネル全体のその後の試験を用いて実施される。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片が得られ、金コーティングされたスライドに取り付けられ、さらに染色される。染色には2日かかり、標準的な免疫組織化学染色とよく似ています。サンプルが染色されると、画像取得装置に入れられます。視野が選択され、画像が取得、アップロード、および保存されます。最終段階は、システムの画像処理ソフトウェアを使用した干渉のフィルタリングと除去のための画像準備です。このプラットフォームの欠点は、分析ソフトウェアの欠如です。しかし、生成された画像は、異なる計算病理学ソフトウェアによってサポートされています。

扁桃腺癌および肺腺癌TMA組織切片(厚さ5mm)を入手し、組織サイズおよびスライドの安全なマージンに関する仕様に従って、金コーティングされたスライドの中央に配置した。組織の縁とスライドガラスの側方および下側の境界との間の5mmおよび10mmの自由なガラスマージンは、それぞれ最適な染色に必要である。組織切片を染色前にオーブンで一晩焼成し、スライドへの切片の適切な付着を確実にした。抗体パネルは、23個のマーカーで構成されていた。同じ染色バッチにおいて、複数の組織を含む扁桃腺スライドおよびTMAスライドが含まれ、肺腺癌サンプルにおいてわずかに発現するマーカーの発現を評価した(図1)。ポジティブコントロールは、パネルで使用される抗体の標的に従って選択する必要があります。例えば、SOX10発現を評価するにはメラノーマサンプルが必要であり、GAFP発現を評価するには膠芽腫サンプルが必要です(図2)。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-page...

がん免疫療法の時代、腫瘍微小環境ダイナミクスの解明への関心が飛躍的に高まっています。このプロトコルは、その染色およびイメージングステップに関して質量分析イメージング技術を詳述し、高度に多重化された空間分析を可能にする。

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

これらのプロトコルにより、単一細胞分解能の定量、マーカーの共発現、およびホルマリン固定およびパラフィン包埋および新鮮な凍結組織サンプルを使用した特別な分析が可能になり、がんにおける免疫細胞の役割を解明できます。この技術は、単一の組織切片上の40マーカーの同時特性評価を容易にし、サンプル中の組織の構造を広く保存する強力なツールです。重要なステップは、抗体の最適化と検証です。ステップを完了しないと、低品質の画像をもたらす可能性があり、高品質の再現性のあるデータおよび結果の保持を損なう可能性があります。まず、すべての抗体含有チューブを10, 000 x Gで5分間スピンダウンし、個々の抗体をブロッキングバッファーに加えてよく混合します。抗体チューブをピペッティングする際には、抗体チューブの底を乱さないでください。0.1マイクロメートルの遠心フィルター装置を100マイクロリットルのブロッキングバッファーで事前に濡らして、抗体パネルをろ過します。フィルターを10, 000 x Gで2分間回転させ、ピペットでブロッキングバッファーフロースルーを除去します。次に、抗体パネルをスピンカラムに移し、フィルターを10, 000 x Gで2分間回転させます。スピンカラムを破棄し、フロースルーをろ過された抗体パネルとして使用します。抗体染色では、各スライドを横向きに傾け、タスクワイパーに端を軽くたたき、スライドからブロッキングバッファーを取り除きます。スライドを水分チャンバーに入れ、100〜200マイクロリットルの抗体マスターミックスを組織に加えます。ポジティブおよびネガティブコントロールスライドを染色バッチに追加し、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。機器をセットアップするには、制御ソフトウェアにログインし、機器がスリープモードの場合は[ウェイクアップ]をクリックします。[サンプルの交換]をクリックしてスライドをロードし、[続行]をクリックしてドアを開きます。サンプルを上に向けて右側のラベルを付けてスライドをローディングスロットに入れ、[続行]をクリックしてドアを閉じます。プロジェクトを選択し、読み込まれたサンプルのスライド名を選択します。視野またはFOV選択のためにスライド光学画像ペインでパノラマ画像を視覚化し、[モード]メニューをクリックして[二次電子検出器]を選択し、[イメージングモード]メニューをクリックしてQC 300マイクロメータを選択します。ジョグステージをクリックしてFOVの位置を制御し、矢印をクリックしてFOVの位置をナビゲートして選択します。[FOVの追加]をクリックし、フィールドサイズとして400マイクロメートル×400マイクロメートルを設定し、[イメージングモード]として[ファイン]を選択し、1ミリ秒の滞留時間を選択して、[確認]をクリックします。FOVリストを作成したら、画像の焦点に進み、画像化されない組織領域にビームを移動して柱描を調整します。明確な中央画像が得られるまでパラメータを調整し、[実行の開始]をクリックします。取得した画像は自動的にアップロードされ、Webベースの画像管理アプリケーションに保存されます。ここに示すマトリックスは、プローブの純度と酸化物に由来するクロストークの割合を表しています。ここで、青いボックスは0.5%以上のクロストークを示し、クリアボックスは0.5%未満のクロストークを示します。マスタグの場合、チャンネルなし、1つまたは2つのチャンネル、または2つ以上のチャンネルに少なくとも0.5%のクロストークをもたらしたプローブがここに表示されます。プローブなし、1つまたは2つのプローブ、または2つ以上のプローブから少なくとも0.5%のクロストークを受信するマスチャネルも表示されます。肺腺癌、非腫瘍性腎臓、扁桃腺などのさまざまな組織における代表的な染色像がここに示されています。この技術を使用して染色され、フィルタリングと補正の前にサードパーティのデジタル画像分析ソフトウェアプログラムを使用して視覚化された扁桃腺組織切片の画像がここに表示されます。フィルタリングと補正の手順を行った後の同じ条件での同じセクションの画像がここに示されています。この方法は、サードパーティのデジタル画像解析ソフトウェアにアップロードできる画像を生成し、組織の区画化、細胞セグメンテーション、マーカー共発現、近傍分析、遠隔分析などの包括的な分析を可能にします。研究を通じて、高度に多重化されたイメージング法が利用可能です。さまざまなパネルを構築することにより、研究者は癌、正常、腫瘍随伴、炎症性および感染性のサンプルを調査できます。

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Cancer Research

がん研究

癌細胞プロテオームの詳細な分析は、新規の薬物標的と診断バイオマーカーの同定を容易にします。ここでは、液体および固体腫瘍に由来するがん細胞亜集団における(リン酸化)プロテオームの定量解析のための実験ワークフローについて説明します。これは、細胞濃縮戦略と定量的なSuper-SILACベースの質量分析を組み合わせることで達成されます。...

液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。...

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

試料調製法は、イメージング質量分析法による低分子交換を検出する細胞・組織の培養を対応するために開発されました。...

組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。...

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

このプロトコールは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の腫瘍含量パーセントを増加させる方法を提示する。...

腫瘍マクロ解剖による腫瘍含量の増加

このプロトコルは、レーザーマイクロダイセクションを使用して組織学分解細胞集団を濃縮するための、染色された薄い組織切片画像から病理学的に確認された関心領域を人工知能駆動でセグメンテーションするためのハイスループットワークフローを記述します。この戦略には、関心のある細胞集団を示す境界をレーザー顕微鏡に直接転送することを可能にする新しいアルゴリズムが含まれる。...

腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

この記事では、腹膜転移の三次元構造を特徴付けるために最適化されたマルチプレックス免疫蛍光法のプロトコルについて説明します。...

反復漂白法を用いた担腫瘍組織の三次元イメージングは、マルチプレキシック性アプローチを拡張します

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

このプロトコールは、マウスFFPE黒色腫組織のDNAバーコードベースのイメージングのためのマルチプレックス免疫蛍光抗体パネルを設計するためのステップバイステップガイドを提供します。また、マウスの黒色腫腫瘍免疫微小環境に対する空間的プロテオミクスの洞察を生成するためのオープンソースツールを使用した画像解析パイプラインについても説明します。...

DNAバーコードを用いたマルチプレックス免疫蛍光イメージングによる、遺伝的に再プログラムされたマウス黒色腫のFFPE検体を解析

学ぶ質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境解析法。ホルマリン固定パラフィン包埋組織で単一細胞解像度の定量と40マーカー同時検出が可能。抗体最適化の重要性と高品質イメージングの実現方法を解説。

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

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