Name: in vitroでカルシウム沈着を定量するための半自動化された再現性のある生物学的ベースの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ 血管平滑筋細胞を用いたin vitroカルシウム沈着の蛍光イメージング定量法。心血管疾患における血管石灰化の研究と新規治療法開発に貢献する半自動化プロトコルです。

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この研究は、マリー・スクロドフスカ・キュリー助成金契約第722609 764474号、NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムによって資金提供されました。この研究はBioSPXの支援を受けました。WJ-Dは、ドイツ研究財団(DFG)から資金提供を受けました TRR219-プロジェクトID 322900939およびプロジェクトID 403041552

1. 細胞の播種、維持、石灰化誘導
<ol><li>初代細胞の培養には、層流キャビネット、手袋、および滅菌装置を使用します。作業の前後に手と作業スペースを消毒します。すべての初代細胞と培地は、特に証明されていない限り、潜在的なバイオハザードとして扱います。好ましくは廃棄前に余剰細胞および培地をオートクレーブする。化学的に不活性化してオートクレーブすると有毒ガスが放出されるため、オートクレーブは行わないでください。</li>
	<li>コーティングされていない細胞培養プレート上でhVSMCを培養します。</li>
	<li>10%-20%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌を添加したM199培地からなる増殖培地でhVSMCを日常的に維持し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。</li>
	<li>70%〜90%のコンフルエントで細胞を分割します。<ol><li>分割するには、hVSMC を PBS で 2 回洗浄します。トリプシンを加え、37°Cで2〜5分間インキュベートします。 顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。</li>
		<li>血清含有培地を添加してトリプシン反応を阻害する。細胞を350 x g で4分間遠心分離し、ペレットを維持培地に再懸濁します。hVSMC は 1:2 分割スキームに従います。</li>
	</ol></li>
	<li>石灰化実験を開始するには、分割の手順に従って細胞を準備します(ステップ1.4.1)。再懸濁したら、細胞とシードを密度10-15 x10 3 細胞/cm2で48ウェルプレートにカウントします。 補足図1で推奨されているように、外側のウェルの使用を避けて細胞に播種します。</li>
	<li>細胞を接着させ、37°Cおよび5%CO2でインキュベートしながら24時間(一晩)回復させます。</li>
	<li>細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、2回目の 洗浄後に残りのすべてのPBSを注意深く吸引します。</li>
	<li>石灰化培地を穏やかに加え、さらに37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。石灰化培地には、石灰化刺激、蛍光標識されたフェチュインA(赤色蛍光タンパク質[RFP]など)(1 μg/mL)、およびHOECHST 33342(0.1 μg/mL)核染色または同様の生蛍光核染色が含まれている必要があります。DAPI は非透過性であるため、使用しないでください。</li>
	<li>石灰化が起こるまで光学顕微鏡で毎日チェックしてください。 注:hVMSCの細胞培養および維持に関する注意事項については、 補足ファイル1を参照してください。</li>
</ol>2. イメージングによる石灰化検出
メモ: 次のプロトコルは、準備、イメージング、およびデータ分析で実行する一般的な手順を示しています。自動イメージングプラットフォームと対応する画像解析ソフトウェア(詳細については、資料の表を参照)を使用した各ステップの手順をサポートするスクリーンショットは、補足ファイル2および補足ファイル3に記載されています。このプロトコルを適用するために、他の画像化機器および画像処理ツールを使用してもよい。ただし、各ウェルの同じ場所で繰り返しイメージングを行うことは、意味のあるデータ取得に不可欠です。再現性のある結果を得るには、すべてのイメージングステップで画像石灰化と再利用のためのプロトコルを作成する必要があります。この方法を初めて適用するときは、以下の手順に従ってイメージングの前に準備してください。
<ol><li>プロトコルのセットアップ<ol><li>ソフトウェアを開き、[プロトコル] と [新規作成] を選択します。</li>
		<li>[手順]を選択し、[温度の設定]をクリックします。ポップアップウィンドウで、温度を37°C、勾配を1°Cに設定し、[OK]をクリックします。ドロップダウンメニューから選択したプレートタイプを選択します。[画像] をクリックして、イメージング ステップを追加します。反転イメージャを選択し、「OK」をクリックします。</li>
		<li>3つのイメージングチャンネルを追加し、DAPI(377、447 nm)、RFP(531、593 nm)、および明視野に設定します。[ モンタージュ ]ボックスにチェックマークを付けて、画像の目的の数と場所を設定します。48ウェルプレートの場合は2 x 2が一般的な選択肢です。オーバーラップを変更して、各井戸のカバレッジを改善します。イメージングするウェルを選択します。新しいウィンドウが開き、目的のウェルを選択できます。</li>
		<li>[フォーカスオプション]をクリックして、フォーカスモードを設定します。新しいウィンドウが開きます。各チャンネルを個別に設定します。一般的に、井戸は「DAPI」チャネルに自動焦点を合わせます。他のすべてのチャンネルを最初のチャンネルから焦点距離を固定に設定し、「OK」をクリックして設定します。ウィンドウを閉じます。</li>
		<li>[データ削減]をクリックして事前設定 データ削減 手順を開始し、[ 画像前処理]を選択します。このステップを設定すると、蛍光バックグラウンドが減少します。[ OK] を選択して既定の設定をそのまま使用します。プレフィックス "TSF" が付いた新しいイメージのセットが作成されます。元の画像は保持されます。</li>
		<li>セルラー分析を選択して、細胞をカウントするステップを設定します。[チャネル] ドロップダウン メニューから [TSF DAPI イメージ] を選択します。イメージングの実行後にさらに詳細を設定します。このステップは、データ削減と見なすこともできます。常に元の画像を保持するようにしてください。</li>
		<li>統計を選択してRFP(石灰化)信号の分析を準備します。ポップアップ ウィンドウで、[ステップ] というラベルを付け、入力チャネルとして [TSF RFP] を選択します。[上限値] ボックスと [下限値] ボックスにチェックマークを付けます。下のリストの[総面積]チェックボックスをオンにします。[色の効果] 列で [なし] を選択します。ポップアップウィンドウで、[カスタム]をクリックし、[背景]ボックスにチェックマークを付けます。これにより、評価を容易にするために、低高の結果が色分けされます。OKを押します。</li>
		<li>公平に読み出すには、セルごとにRFP信号を正規化します。その際、セルごとに総面積が分割されます。このステップを設定するには、左側の 比率 を押します。ポップアップ ウィンドウで、ドロップダウン メニューから [データ入力 1 RFP 定量化: 総面積 ] を選択します。さらに、データ入力として セルカウント を選択します 2.</li>
		<li>最後に、新しいデータセット名を選択し、[OK]と[OK]をもう一度押します。前述のように [色の効果] を選択します。左上隅にある [ファイル] を選択し、ファイルをプロトコル (.prt ファイルの種類) として保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>最初の石灰化が起こった後の毎日
	<ol><li>すべての時点について、これらの手順を繰り返します。スタートアップソフトウェアで、[ 今すぐ読む ]と [既存のプロトコル]を押します。前の手順で作成したプロトコルを選択します。プログラムは実験を保存するように求めます。これは、このステップで実行できますが、後のステップで左上の[ 保存 ]ボタンをクリックして手動で実行することもできます。</li>
		<li>ポップアップウィンドウは、システムが熱くなるのを待つように求めます。CO2 ガスコントローラーの電源を入れ、5%に設定します。</li>
		<li>システムが設定温度に達すると、プレートを挿入して読み取るように求めるプロンプトが表示されます。 キャンセルを押します。これは、各時点で、各蛍光色素の露出を個別に調整する必要があるためです。</li>
		<li>プレートをインキュベーターからイメージャーに輸送し、破損やこぼれに強く、事故が発生した場合に生細胞を輸送するための地域のバイオセーフティ規制に準拠した安全なボックスに入れます。プレートをプレートリーダーに入れます。</li>
		<li>キャンセル後、[手順]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[イメージングステップのプリセット]を選択します。最初に DAPI チャネルのフォーカスと露出を調整します。すべてのチャンネルで[自動露出]ボックスのチェックを外します。次に、DAPIチャンネルの横にある顕微鏡アイコンをクリックします。新しいウィンドウが開きます。</li>
		<li>焦点を当てる井戸を選択します。このステップでは、中程度から高い石灰化のウェルを使用してください。信号がすでに表示されている場合は、最初に [オートフォーカス ]、[ 自動露出]の順にクリックします。そうでない場合は、最初に露出を上げて、 オートフォーカス と 自動露出を繰り返します。必要に応じて、露出ドロップダウンメニューを選択して手動で露出を調整できます。複数のウェルの設定を確認してください。満足したら、設定を保存します。</li>
		<li>すべてのチャンネルで同じ方法で露出を調整します。 注意: 他のチャネルに焦点を合わせないでください。露出のみを調整します。フォーカスプレーンは、すべてのチャネルで同じである必要があります。</li>
		<li>プロシージャ ウィンドウを閉じます。上部のタスク バーにある緑色の [ 今すぐ読む ] ボタンを選択します。ソフトウェアで示されているように実験を保存します。 注意: ソフトウェアは、選択した設定で選択したすべてのウェルを自動的に読み取るようになります。</li>
	</ol></li>
</ol>3.データ分析
注:自動イメージングプラットフォームと対応する画像解析ソフトウェアを使用してデータ分析を実行する方法の詳細なスクリーンショットについては、補足ファイル4を参照してください。 代替のイメージング機器または分析ソフトウェアを使用する場合は、画像をエクスポートしてバッチ処理し、露出、蛍光閾値、または強度が比較データセット内のすべての画像で均等に調整されるようにする必要があります。
<ol><li>システムがプレートを読み取る間、すべての画像はバックグラウンドで自動的に処理されます。表示する TSF DAPI イメージを選択して、セル数の設定を調整します。ダブルクリックして目的のウェルを選択します。新しいウィンドウがポップアップします。いずれかの画像を選択します。</li>
	<li>[ 分析 ] タブを選択します。ポップアップウィンドウで、[細胞 解析:細胞数]を選択します。 OK をクリックします。RFP チャンネルと明視野チャンネルの選択を解除します。[ ハイライトオブジェクト ]ボックスにチェックマークを付けます。</li>
	<li>[ オプション ] をクリックしてメニューを開きます。サイズと強度のしきい値を調整して、すべての原子核を含め、破片は除外します。 OK をクリックします。左下の[ 変更を適用 ]をクリックして、設定を他のすべての画像にも転送します。</li>
	<li>以前と同様の方法で、中程度から大量の石灰化を伴うウェルと画像を選択して、信号対雑音比を最適に調整します。タスクメニューの[ 分析 ]タブをクリックします。<ol><li>今回は [画像統計] を選択します。DAPIと明視野チャンネルの選択を解除します。[ オプション ] をクリックしてメニューを開きます。[ しきい値の外れ値] ボックスにチェックを入れます。しきい値の上限値と下限値を調整します。信号がバックグラウンドより上にある場合にのみ信号をカウントし、破片/アーティファクトがある場合は除外します。</li>
		<li>バックグラウンドより上の信号に非主観的なしきい値を設定するには、タスクバーからラインツールを選択します。ウィンドウがポップアップします。信号のパッチに線を引きますが、背景の領域も含めてください。 注意: ポップアップウィンドウにグラフが表示され、背景線より上の信号を表すピークが表示されます。25% のピーク高さの値は、推奨されるしきい値を表します。また、適切なスレッショルドを確実に選択するために、複数の信号パッチを測定することをお勧めします。信号のパッチを選択する際に、信号強度が非常に高い領域を選択すると、中程度またはそれ以下の信号を無視するしきい値が発生する可能性があります。したがって、バックグラウンドより上の中程度から低信号のパッチを選択することをお勧めします。高すぎる、低すぎる、および正確なしきい値の例を 補足ファイル 4 に示します。</li>
		<li>問題がなければ、[ OK ]と[ 変更を適用 ]をクリックして、設定を他のすべてのウェルに転送します。他のウェルで閾値が正確に選択されているかどうかを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>セル数と RFP しきい値を設定したら、データをエクスポートします。目的のプレートを選択します。ドロップダウンメニューでは、エクスポートする複数のパラメータを選択できます。関連するのは、セル数、RFP面積、およびグループ間の比較に使用されるメトリックである「面積/セル」です。ドロップダウン メニューの横にある [Excel ] ボタンをクリックして、データをスプレッドシートに直接エクスポートします。 注:ドロップダウンメニューで、セル数の計算値、RFP信号の総面積(石灰化の面積を反映)、およびセルあたりのRFP信号の総面積の正規化された比率を個別に選択してスプレッドシートにエクスポートできるようになりました。結果をセルあたりのRFP信号の総面積の比として表示し、可視化します(棒グラフなど)。対応のないスチューデントのt検定を適用して2つのグループを比較するか、対応のない分散分析を適用して異なるグループを同時に比較します。異なる時点で同じグループを比較するには、対応のある統計分析が必要になる場合があります。</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors%3A+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+%28PACC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li>
<li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcification%2C+coronary+disease+risk+factors%2C+C-reactive+protein%2C+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li>
<li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li>
<li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36(2018).</li>
<li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling%3A+focus+on+calcification-related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694(2019).</li>
<li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22La+Radiologia+Medica%22%5BJournal%5D)">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li>
<li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Egyptian+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26(2019).</li>
<li>Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li>
<li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Disorders+in+Hemodialysis%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li>
<li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li>
<li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification%3A+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li>
<li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li>
<li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease%3A+Integrative+roles+for+OPG%2C+RANKL+and+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li>
<li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening%3A+relevance+in+development%2C+aging%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li>
<li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li>
<li>Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+models+for+studying+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204(2020).</li>
<li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification%3A+solidifying+a+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li>
<li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+%28glucose-regulated+protein%2C+78+kDa%29-loaded+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li>
<li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+BioHybrid+assay%3A+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097(2021).</li>
<li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations%3A+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li>
<li>Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality%2C+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Failure%22%5BJournal%5D)">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li>
<li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ucma%2FGRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961(2018).</li>
<li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li>
<li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anatomica%22%5BJournal%5D)">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li>
<li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li>
<li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li>
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Leon Schurgersは、Bayer、Boehringer Ingelheim、NattoPharma、IDSから機関助成金を受けています。レオン・シュルガーズは凝固プロファイルの株式を所有しています。Willi Jahnen-Dechentは、CALCISCON AGの共同創設者兼株主です。

本稿では, in vitro 石灰化判定のための半自動法について述べる。この方法では、hVSMC石灰化の3つの重要なステップを最適化する必要があります。まず、細胞密度はhVSMC石灰化の発生に重要です。hVSMCの密度が低いと、細胞間接触の欠如と石灰化条件下で誘発されるストレスにより、石灰化が遅いかまったくないか、細胞死が発生します21。細胞密度が高いと過剰コンフルエントになり、その後細胞は老化し22 、石灰化の発達が止まります。その後の石灰化発生に使用されるウェルプレートに約70%のコンフルエントを播種し、hVSMCの増殖能力と細胞接続を確保することが重要です。
第二に、石灰化誘導に使用される細胞培養培地は最適化を必要とする。血管石灰化研究において、様々な状態および培地組成がhVSMCを石灰化することが報告されている23,24。この方法は、あらゆる種類...

血管石灰化(VC)は、心血管の罹患率と死亡率の独立した危険因子です1,2,3。長い間、異所性ミネラル沈着の受動的な化学プロセスと考えられていましたが、現在では、疾患のドライバーとして活性化血管平滑筋細胞(hVSMC)を含むさまざまな細胞の積極的な寄与を含む修正可能な組織治癒応答のように見えます4,5。生体内VCは、アテローム性動脈硬化性負荷の評価としてマルチスライスCTスキャンによって測定することができる6、7、8。現在、VCの重症度が心血管疾患、II型糖尿病、慢性腎臓病、および老化9,10,11,12,13,14,15の危険因子として認識されるようになるというパラダイムシフトが進行中です。
hVSMCは、心血管系で最も豊富な細胞型であり、VCの発生における主要なアクターです。in vitro hVSMC誘発石灰化は、心血管疾患の研究に広く使用されている疾患モデルです16,17。ただし、in vitro石灰化の検出のためのほとんどのプロトコルは、データ収集を制限し、細胞物質のより多くの使用を必要とし、研究を遅らせる可能性のあるエンドポイント測定を使用します。in vitro hVSMC石灰化を検出するための一般的な方法には、総タンパク質に対する可溶化カルシウム沈着を測定し、細胞溶解を必要とするo-クレゾルフタレインアッセイが含まれます18。また、アリザリンレッド染色が使用され、これは固定された細胞または組織19上のカルシウム沈着物に直接結合する。o-クレゾルフタレインまたはアリザリンレッドのいずれかでhVSMC石灰化を経時的に研究するには、時点ごとに反復のバッチが必要であり、生物学的材料の需要が増加し、ひいては変動の可能性が高まります。
本論文では、蛍光イメージングプローブを用いたhVSMCsを利用して、 in vitro VCの進行を決定し、特異な末期石灰化アッセイとして機能する新しいアッセイの適用方法について詳しく説明します。我々は以前に、このアッセイがo-クレゾルフタレインおよびアリザリンレッド法に直接匹敵し、さまざまな培養条件を区別するために使用できることを実証しました20。リアルタイム測定に加えて、このアッセイは、臨床VC開発のための代理マーカーとしての血清または血漿サンプルの傾向を決定するために使用され得る20。これは、心臓血管科学と疾患モデリングの生物学的戦略の適用に役立ちます。アッセイのさらなる用途は、血清または血漿などの血液成分からのVC重症度または進行を評価するためのトランスレーショナルバイオハイブリッドシステムとしてであり得る。

<table><tbody><tr><td>塩化カルシウム、93%、無水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6ウェル クリアTC処理ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 System</td><td>BioTek, Abcoude, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Merck</td><td>F7524-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td><td>社内</td><td></td>で調製<td></td></tr><tr><td>Gen5 ソフトウェア v3.10</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific 11150059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, 三塩酸塩</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroでカルシウム沈着を定量するための半自動化された再現性のある生物学的ベースの方法

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

血管石灰化は、炎症、細胞表現型の変化、細胞死、石灰化阻害剤の欠如を含む一連の変性病理を含み、同時に血管の弾力性および機能の喪失をもたらす。血管石灰化は、慢性腎臓病、真性糖尿病、アテローム性動脈硬化症など、多くの病状における罹患率と死亡率の重要な原因です。血管石灰化を研究するための現在の研究モデルは限られており、in vivoでの石灰化発生の後期段階でのみ実行可能です。血管石灰化を研究するためのin vitroツールは、エンドポイント測定を使用し、生物学的材料に対する要求を高め、研究研究にばらつきを導入するリスクを冒します。ヒト血管平滑筋細胞上でのin vitro石灰化発生に結合し、in vitro石灰化のリアルタイム発生を決定する新しい蛍光標識プローブの応用を実証します。このプロトコルでは、トランスレーショナルアプリケーションの可能性を秘めた疾患モデリングの新しいツールである、新しく開発された石灰化アッセイのアプリケーションについて説明します。このアッセイは、骨、軟骨、歯科研究への応用を含む、より幅広い鉱物沈着研究に関連すると想定しています。

結果には、HOECHST染色核の元の画像、RFP標識石灰化、および明視野画像が含まれます。低(図2)から高(図3)までの石灰化のさまざまな段階を検出および分析できます。石灰化は通常、光学顕微鏡を使用して黒い斑点として発見することができ(図2D および 図3B、矢印は石灰化を示します)、一次評価およびイメージングを開始する時期の決定に役立ちます。信号対雑音比を改善するには、処理されたRFP画像を分析して石灰化を定量化する必要があります(図2F および 図3D、矢印は石灰化を示します)。最後に、データは、代表的な画像を伴って、ある時点で2つ以上の条件を比較する棒グラフとして提示され得る(図4A、B、C</stro...

心血管疾患は、世界中の主要な死因です。血管石灰化は、心血管の罹患率と死亡率の負担に大きく貢献します。.このプロトコルは、蛍光イメージングによって血管平滑筋細胞媒介カルシウム沈殿 をin vitro で定量化する簡単な方法を記載しています。

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

私たちの方法は、ヒト血管平滑筋細胞を使用して患者サンプルの石灰化傾向を測定することを可能にします。これは、血管石灰化障害の研究を推進し、新しい治療法の開発を支援するのに役立ちます。この手法では、蛍光ベースの検出を使用して感度を高め、時間の経過とともにサンプルを測定できるため、反復の必要性が減り、堅牢性が向上します。まず、コーティングされていない細胞培養フラスコ上でヒト血管平滑筋細胞を37°C、5%二酸化炭素で培養します。70〜90%のコンフルエンシーに達したら細胞を分割します。分割するには、HVSMCをPBSで2回洗浄します。トリプシンを加え、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。血清含有培地を添加することによりトリプシン反応を阻害する。細胞を350 RCFで4分間遠心分離し、ペレットを維持培地に再懸濁します。実証されたように分割のために細胞を準備した後、細胞を数えて48ウェルプレートに播種し、石灰化実験を開始します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートした後、細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、2回目の洗浄後に残りのすべてのPBSを注意深く吸引します。石灰化培地を穏やかに加え、さらに摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。石灰化が起こるまで光学顕微鏡で毎日チェックしてください。イメージングで石灰化を検出するには、ソフトウェアを開き、[プロトコル]と[新規作成]を選択します。[手順]を選択し、[温度の設定]をクリックします。ポップアップウィンドウで温度を摂氏37度、勾配を摂氏1度に設定し、[OK]をクリックします。ドロップダウンメニューから選択したプレートタイプを選択します。[画像] をクリックして、イメージング ステップを追加します。反転イメージャーを選択し、「OK」をクリックします。3つのイメージングチャンネルを追加し、DAPI、RFP、および明視野に設定します。[モンタージュ]ボックスにチェックマークを付けて、画像の目的の数と場所を設定します。[オーバーラップ] を変更して、各井戸のカバレッジを改善します。イメージングするウェルを選択します。新しいウィンドウが開き、目的のウェルを選択できます。[フォーカスオプション]をクリックして、フォーカスモードを設定します。新しいウィンドウが開きます。各チャンネルを個別に設定します。一般に、ウェルはDAPIチャネルに自動フォーカスされます。他のすべてのチャンネルを最初のチャンネルから固定焦点距離に設定し、「OK」をクリックして設定します。ウィンドウを閉じます。[データ削減]をクリックしてプリセットデータ削減手順を開始し、[画像事前処理]を選択します。[OK] を選択して既定の設定をそのまま使用します。セルラー分析を選択して、細胞をカウントするステップを設定します。チャネル ドロップダウン メニューから [TsF DAPI イメージ] を選択します。イメージングの実行後にさらに詳細を設定します。ポップアップウィンドウのラベルステップで統計を選択し、入力チャンネルとしてTsF RFPを選択して、RFP信号の分析を準備します。[上限値] ボックスと [下限値] ボックスにチェックマークを付けます。下のリストの[総面積]チェックボックスをオンにします。[色の効果] 列で [なし] を選択します。ポップアップウィンドウで、[カスタム]をクリックし、[背景]ボックスにチェックマークを付けます。OKを押します。公平に読み出すには、左側のRatioを押して、セルあたりのRFP信号を正規化します。ポップアップウィンドウで、RFP定量化総面積を選択します。ドロップダウン メニューから [データ入力 1] を選択し、[データ入力 2] として [セル数] を選択します。最後に、新しいデータセット名を選択し、[OK]を2回押します。前に示したように [色の効果] を選択し、左上隅 OK.In をクリックして [ファイル] を選択し、ファイルをプロトコル ファイルの種類として保存します。石灰化の最初のインスタンスが発生した後のすべての時点の観測値を記録します。スタートアップソフトウェアで[今すぐ読む]を押して、[既存のプロトコル]をクリックします。前の手順で作成したプロトコルを選択します。プログラムは、実験を保存するように求めます。これは、この段階で行うことも、後で左上の[保存]ボタンをクリックして手動で行うこともできます。ポップアップウィンドウは、システムが加熱されるのを待つように求めます。二酸化炭素ガスコントローラーの電源を入れてに設定します 5%システムが設定温度に達すると、プレートを挿入して読み取るように求めるプロンプトが表示されます。キャンセルを押します。プレートをインキュベーターからイメージャーに安全な箱に入れて輸送し、破損やこぼれを防ぎ、事故が発生した場合に生細胞を輸送するための地域のバイオセーフティ規制に準拠しています。プレートをプレートリーダーに入れます。[手順]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[プリセットイメージングステップ]を選択します。最初に DAPI チャネルのフォーカスと露出を調整します。すべてのチャンネルで自動露出ボックスのチェックを外し、DAPIチャンネルの横にある顕微鏡アイコンをクリックします。新しいウィンドウが開きます。フォーカスを向けるウェルを選択します。信号がすでに表示されている場合は、まず「オートフォーカス」をクリックし、次に「自動露出」をクリックします。そうでない場合は、最初に露出を上げて、オートフォーカスと自動露出を繰り返します。露出は、[露出]ドロップダウンメニューを選択して手動で調整できます。複数のウェルの設定を確認し、設定を保存します。すべてのチャンネルで同じ方法で露出を調整します。RFPチャネルの場合は、中程度から高い石灰化のある井戸から始めてください。手順ウィンドウを閉じ、上部のタスクバーにある緑色の[今すぐ読む]ボタンを選択します。ソフトウェアで示されているように実験を保存します。各時点について、このプロセスを繰り返します。システムがプレートを読み取る間、すべての画像はバックグラウンドで自動的に処理されます。表示する TsF DAPI 画像を選択して、セル数の設定を調整します。ダブルクリックして目的のウェルを選択します。新しいウィンドウがポップアップします。いずれかの画像を選択します。ポップアップ ウィンドウで [分析] タブを選択します。「セルラー分析セル数」を選択し、「OK」をクリックします。RFP チャンネルと明視野チャンネルの選択を解除します。[ハイライトオブジェクト]ボックスにチェックマークを付けます。[オプション] をクリックしてメニューを開きます。[サイズ]と[強度のしきい値]を調整して、すべての核を含め、破片を除外し、[OK]をクリックします。左下の[変更を適用]をクリックして、すべての画像に設定を適用します。同様に、石灰化が中程度から多いウェルエンド画像を選択します。信号対雑音比を最適に調整するには、[タスク]メニューの[解析]タブをクリックします。[画像の統計情報] を選択します。DAPI およびブライトフィールドチャンネルの選択を解除します。[オプション] をクリックしてメニューを開きます。[しきい値の外れ値] ボックスにチェックを入れます。背景より上の信号の非主観的なしきい値を設定するには、タスクバーからラインツールを選択します。ウィンドウがポップアップします。背景の領域を含めながら、信号のパッチに線を引きます。しきい値の上限と下限を調整します。バックグラウンドより上の信号のみをカウントし、破片やアーティファクトがある場合は除外します。[OK]をクリックして変更を適用し、設定を他のすべてのウェルに転送します。他のウェルで閾値が正確に選択されていることを確認します。セル数と RFP しきい値を設定したら、データをエクスポートします。ドロップダウン メニューの横にある [Excel] ボタンをクリックして、データをスプレッドシートに直接エクスポートします。低から高までのさまざまな石灰化段階が検出され、分析されました。石灰化は光学顕微鏡を使用して黒い斑点として発見され、一次評価とイメージングを開始する時期の決定に役立ちました。改善された信号対雑音比のために、処理されたRFP画像を分析して石灰化を定量化しました。データは、2つ以上の条件を同時に比較することによって得られた。データは、細胞当たりの石灰化面積として細胞数に対して正規化した。データは、さまざまな時点で同じ状態を示す時系列としても描かれました。データの削減と分析の結果は、画像の変換としきい値設定の前に見ることができるものを反映していることが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。...

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

このビデオでは、ヒト末梢血単核細胞由来破骨細胞で培養したリン酸カルシウムコーティング細胞培養プレート上のin...

Resorption Pit Assay:リン酸カルシウムコーティング培養プレートを使用して成熟破骨細胞のカルシウム吸収活性を定量化するIn Vitro技術

このビデオでは、アニオン性色素であるAlizarin Red...

In vitro石灰化アッセイ:Alizarin Red S染色および抽出による骨移植代替物上の骨芽細胞カルシウム沈着物を定量するための比色法

このビデオは、大動脈弁間質細胞の石灰化をin...

大動脈弁間質細胞のカルシウム濃度を測定するための石灰化アッセイ

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、...

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。...

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

血管石灰化は、ヒトの心血管疾患の重要な予測因子であり、その一因となります。このプロトコルは、培養された初代血管平滑筋細胞の石灰化を誘導する方法、および近赤外蛍光イメージングを使用して動物大動脈の石灰化とマクロファージ負荷を定量化する方法について説明しています。...

血管平滑筋細胞と大動脈石灰化と炎症のイメージングの石灰化

この記事では、2段階コラゲターゼ法によるマウス大動脈弁細胞の単離について説明します。孤立したマウス弁細胞は、この インビトロ...

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。...

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

本論文では、マウス大動脈を単離し、石灰化した細胞外小胞を抽出して石灰化の可能性を観察することにより、血管石灰化を取得および評価するための方法論を提示します。...

in vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析

カルシウムシグナル伝達の生細胞イメージングは、単分子層で培養された安定した細胞株におけるカルシウム移動の研究に広く利用されています。このプロトコルは、複雑な一次組織に対するカルシウムシグナル伝達の生細胞蛍光イメージングを用い、機械学習ソフトウェアを活用して数千個の細胞の蛍光強度を同時に定量化することで解析を効率化します。...

一次ヒト気道上皮培養における蛍光ベースのカルシウムイメージング(自動細胞分割法による)

学ぶ 血管平滑筋細胞を用いたin vitroカルシウム沈着の蛍光イメージング定量法。心血管疾患における血管石灰化の研究と新規治療法開発に貢献する半自動化プロトコルです。

in vitroでカルシウム沈着を定量するための半自動化された再現性のある生物学的ベースの方法

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