Name: クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶクライオ電子顕微鏡によるヌクレオソーム複合体の作製法。DNA修復因子との相互作用を構造生物学で解析し、標準的な実験機器を用いて生化学研究を補完する。

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国立環境衛生科学研究所のクライオEMコアのマリオ・ボルニア博士とノースカロライナ大学チャペルヒル校のジョシュア・ストラウス博士のクライオEMグリッド準備の指導とトレーニングに感謝します。また、このプロジェクトの初期段階での技術支援を提供してくれたジュリアナ・メロ・ダ・フォンセカ・レゼンデ博士にも感謝します。故サミュエル・H・ウィルソン博士と彼の研究室メンバー、特にラジェンドラ・プラサド博士とヨーナス・ジャムセン博士の遺伝的融合APE1-Polβ複合体の精製に対する重要な貢献と支援に感謝します。国立衛生研究所 国立環境衛生研究所 学内研究プログラム[課題番号 Z01ES050158, Z01ES050159, K99ES031662-01]の支援を受けています。

1. 塩析透析によるヌクレオソームコア粒子のアセンブル化
注:構造研究のための組換えヒストンタンパク質を用いたヌクレオソームコア粒子の調製は、他の14,15,16によって詳細に説明されています。14、15他に記載の組換えX. laevisヒストンおよびヒストン八量体アセンブリの精製に従い、以下に記載されるようにヌクレオソーム基質をアセンブルする。
<ol><li>示されたスケールで3つのオリゴヌクレオチド( 表1に記載)を購入します:UND-197mer、161mer、35mer。<ol><li>PAGEは、17に記載のウルトラマー(197merおよび161mer)を精製する。<ol><li>1xアニーリングバッファー(10 mM Tris-Cl、pH 8.0、50 mM NaCl)中の等モル量のオリゴヌクレオチドのアニール。例えば、40 μLの161量体[166.7 μM]を混合します。8 μL の 35 量体 [292.4 μM];16.8 μL の 197 量体コンプストランド [408.2 μM];10 μLの10xアニールバッファーと10.9 μLのdH2O。 注:アニーリング反応を温度勾配で制御することが重要です。温度勾配の詳細については 、表2 を参照してください。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>少量の再構成(最終容量50 μLの場合、以下に示す例の1/57倍のスケール)を実行して、DNAとヒストン八量体の比率を決定します(DNA:八量体の典型的な開始比は次のとおりです:1:0.9、1:1.1、1:1.2、1:2; 図2Aを参照)。この比率は、小規模な再構成で経験的に決定することが重要です。<ol><li>この比率が決定されたら、大規模な再構成を準備します。例えば、32.9 μL の DNA-197 bp [99.4 μM] を混合します。1647.1 μL の TE (1x);1120 μLの5 M NaCl、および62.3 μLのWTヒストン八量体[2.56 μM]。</li>
	</ol></li>
	<li>透析バッファーを作る:表3と表4に記載されているように、それぞれRB低とRB高。前述のように再構成を設定します14.<ol><li>透析チューブをRBハイを含むビーカーに移し、穏やかに攪拌しながら、16時間、または2 L RBロー が廃ビーカーに移されるまで透析を進行させます。</li>
	</ol></li>
	<li>透析チューブをRB50mM バッファー(表5)を含む1 Lビーカーに移し、サンプルを少なくとも3時間または一晩透析します。<ol><li>6%ポリアクリルアミド非変性ゲルの再構成効率を評価し、10%未満の遊離DNAと単一のNCPバンドがあることを確認します。NCPは4°Cで保存してください。 代表的な最適な再構成結果については、図 2A (レーン5)および 図2B を参照してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2. NCP-DNA修復因子複合体(NCP-DRF)を調製する
<ol><li>分取ゲル電気泳動による精製 注:この方法は(説明されている2つのうち)最も労働集約的であり、高分子量(HMW)種(図 6A)希釈係数が高いため、に示すように分解が発生する可能性があります 図 7A (NCP調製セルアウトレーン)、DNAを放出する。ただし、最大25%の遊離DNAは、クライオEM研究と互換性があります。希釈率が高いため、この方法を使用して、複合体全体ではなくNCPのみを精製します。<ol><li>ポリアクリルアミドゲル溶液37.5:1、アクリルアミド:ビスアクリルアミドを使用して、0.2x TBE中の6%非変性ポリアクリルアミドゲル溶液70 mLを調製します。外半径28 mmの円筒形ゲルを注ぎ、一晩重合します。</li>
		<li>6〜8 kDaのMWカットオフを有する透析膜を使用して、分取ゲル実行装置を組み立てる。ランニングバッファーとして0.25x TBEを使用し、1x 溶出バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 7.5)を使用します。円筒形ゲルを一定の12 Wで1時間事前に実行し、蠕動ポンプを約1 mL / minの流量で作動させている画分を収集します。 注:UV検出器を使用してDNAを含む画分を同定できない場合は、 32P-NCPを使用したスクリーニング実験を実行して、目的の画分を同定できます。すべての条件を同じに保つことで、標識されていないNCPはUV検出器なしで精製できます。</li>
		<li>遠心フィルター(MWカットオフ30 kDa)を使用して2.8 mLのNCPを250 μLに濃縮し、分取ゲルと電気泳動に合計6時間ロードします。2時間後、キシレンシアノールがゲルからなくなったら、1.5mL画分の収集を開始します。 注:2.5時間で、フラクションはキシレンシアノールがなくなります。DNA(197mer)は約3〜3.5時間で溶出し、NCPは4.5〜5時間で溶出すると予想されます。</li>
		<li>6%非変性ポリアクリルアミドゲルで目的の画分を分析します。NCPを含む画分をプールし、直ちに遠心フィルター(MWカットオフ30kDa)で1mg/mLまで濃縮する。翌日、目的のDNA修復因子(DRF)と複合体形成する前に、6%ポリアクリルアミド非変性ゲルでNCPの品質を評価します。</li>
		<li>NCPと目的のDRFを氷上で、特定の複合体に最適なバッファーを使用して15分間インキュベートします。例えば、1,000 μL の NCP [1.2 μM] を混合します。260 μLの5x結合バッファー(250 mM HEPES、pH 8、500 mM KCl、25 mM MgCl2)、22 μLの3 M KCl、および18 μLのMBP-Pol β-APE1 [338 μM]。 注:錯体が作られる温度とイオン強度は、異なる錯体に対して最適化が必要な場合があります。</li>
		<li>グルタルアルデヒドを追加します(開封したて;EMグレード)を最終濃度0.005%まで。したがって、この反応に、26.8 μLの0.25%グルタルアルデヒドと13.2 μLのdH2Oを加え、よく混合し、室温で13分間インキュベートします。</li>
		<li>1 M トリス-Cl、pH 7.5、終濃度20 mM Tris-Cl、pH 7.5までクエンチします。~50 μLまで濃縮し、脱塩カラムを使用して1x凍結バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 7.5)でバッファーを交換します。 注意: グルタルアルデヒドは、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害であり、吸入すると有毒です。白衣、ゴーグル、手袋を着用し、ヒュームフードでグルタルアルデヒドを処理し、マスクを着用してください。 注:この低濃度のNCPと架橋反応を大量に行うことが重要です。架橋の以前の試みは、この濃度のグルタルアルデヒドでさえ、しかし10倍高い濃度のNCPでは、SDS PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって示されるように、サンプルの凝集および過剰架橋をもたらした。これらのグリッドには、塊だけの識別可能な粒子はありませんでした(図5D、E)。</li>
		<li>OD 280およびOD260の吸光度を決定し、必要に応じてOD280に基づいて1.3〜3 mg / mLに達するようにさらに濃縮します(OD260 / OD 280 = 1.7-2の典型的な比率は良好な粒子を生成します)。 この50μLの小容量の場合、サンプル損失を減らす最良の方法は、透析膜(6〜8 kDa MWカットオフ)で覆われた1.7 mLチューブの蓋付きの透析ボタンを作成し、チューブの底部を切断し、チューブのリムを使用して蓋の上部にあるメンブレンをシールすることです。</li>
		<li>サンプルを含む透析ボタンをポリエチレングリコールベッドの上に置き、膜を下に向けてください(2分ごとに進行状況を確認します)。この方法は、濃縮器でサンプルが希釈または失われるのを避けるために、必要な濃度が2.5倍以下の場合に推奨されます。このステップの後、複合体のクライオEMグリッドを直ちに準備することが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>サイズ排除クロマトグラフィーによる精製<ol><li>凍結の前日に、サイズ排除カラムを60 mLのdH2Oで洗浄し、平衡化した後、80 mLの凍結バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 8)を0.4 mL/minの速度で一晩平衡化します。再構成直後にNCPを使用して、次のように2.5倍の量を使用して同じ複合体を調製します:2,500 μLのNCP [1.2 μM]を混合します。650 μLの5x結合バッファー;45 μL のMBP-Pol β-APE1 [338 μM] および 55 μL の 3M KCl</li>
		<li>混合物を架橋剤なしで氷上で15分間インキュベートします。次いで、グルタルアルデヒドを、分取ゲル法に記載されるように最終濃度0.005%となるように添加する。ただし、この場合は、事前に平衡化された(凍結バッファーを含む)遠心フィルターで複合体を約120 μLまで濃縮します。</li>
		<li>ピーク画分を直ちに分析し、前述のようにヒストンとMBP-Pol β-APE1を含む画分を濃縮します。サイズ除外法を使用した場合の正常な結果については 、図 5A、B、C および両方の方法を使用した 場合の図 7 を参照してください。</li>
	</ol></li>
</ol>3.ヌクレオソーム複合体を凍結する
<ol><li>プランジフリーザーの電源を入れ、加湿器に50mLのdH2Oを充填した後、チャンバー温度を22°C、HR( 湿度)を98%に設定します。エタンカップと液体窒素カップ(ラベル付きのグリッドボックスを含む)をそれぞれのスペースホルダーに入れます。</li>
	<li>エタンカップをエタン蓋ディスペンサーで覆い、その上に液体窒素(LN2)を慎重に注ぎ、LN2 カップにLN2を満たします。LN2 レベルが安定して100%に達し、温度が-180°Cになったら、エタンバルブを慎重に開き、透明な蓋に気泡が形成されるまでエタンカップを満たします。エタンディスペンサーを取り外します。</li>
	<li>2枚のろ紙を吸い取り装置の上に置き、金属リングで固定します。セットアップに移動し、ブロッティングに次のパラメーターを使用します:0プレブロット、3秒ブロット、0ポストブロット; Aプランジ を選択し、[ OK]をクリックします。</li>
	<li>メイン画面で、Load Forcepsをクリックし、カーボン/塗布側を左に向けてグリッドをロードします(前と同じように準備しました)。Z軸を調整して鉗子を調整し、しっかりとしたしみを確保します。 下部チャンバー をクリックし、3 μLの複合体(1.3-3 mg / mL;OD280)。 ブロット/Aプランジをクリックします。これにより、グリッドが回転して正面から吸い取られ、急落してフリーズします。</li>
	<li>グリッドを移し、LN2 チャンバーのグリッドボックスに保管します。4つのグリッドすべてが凍結してグリッドボックスに配置されたら、すべてのグリッドが蓋で覆われているニュートラル位置に蓋を回転させ、ネジを締めます。グリッドは、スクリーニングが開始されるまで LN2 に保管できます。</li>
</ol>4.スクリーングリッド
<ol><li>サンプルを顕微鏡にロードする前に、ガラス化グリッドをリング上に置き、Cクリップを使用して固定します。氷の汚染を避けるために、湿度管理された部屋でLN2 の下でこのクリッピングプロセスを実行します。</li>
	<li>顕微鏡をロードするときは、グリッドを12スロットカセットに挿入します。カセットをナノキャブカプセルにシャトルし、オートローダーにロードします。オートローダのロボット メカニズムがプロセスを開始します。</li>
	<li>グリッドをカセットから顕微鏡ステージに移します。ステージを10°ぐらつき、同時に画像に最小の平面シフトが観察されるまでZ高さを移動して、ステージをユーセントリック高さに調整します。</li>
	<li>ユーセントリックの高さに達したら、イメージングを開始します。まず、グリッドの3 x 3モンタージュ画像を撮影し、各モンタージュを62倍の倍率で撮影してアトラスを取得します。さまざまなサイズの3つの正方形を選びます。ユーセントリックの高さを取り、210倍の倍率で画像化します。</li>
	<li>正方形が画像化されたら、正方形内のエッジ、中央、およびその間のそれぞれから1つの穴を選択します。各穴を2600倍の倍率で画像化します。</li>
	<li>この高倍率画像を撮影する前に、オートフォーカスは撮像領域のオフセットで発生します。穴の中心から36,000倍の倍率、7.1秒の露光時間、60フレーム、1.18ピクセルサイズ、3μmのデフォーカスで高倍率の画像を撮影します。スクリーニングの代表的な画像を図5、図6、および図7に参照してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

DNA修復因子を精製するための特定のプロトコルは、目的の酵素に依存するであろう。ただし、タンパク質の発現と精製のための組換え法の使用など、いくつかの一般的な推奨事項があります18。目的のタンパク質が小さすぎる(<50 kDa)場合、クライオEMによる構造決定は、融合システム19、ナノボディ結合足場20、およびイメージング戦略の最適化21を使用して、最近までほぼ不可能でした。
初期段階で低品質のグリッドを取得することは非常に一般的です。ネガ染色に酢酸ウラニルと炭素被覆銅グリッドを使用して、架橋剤なしでNCPの均一性と安定性を決定する最初の試みでは、凝集を最小限に抑えた安定した、うまく分散したNCPが示されました。しかし、このサンプルをクライオEMグリッドで(20倍高い濃度で)ガラス化すると、粒子は検出されませんでした。NCPがバラバラになったり集約されたりしないようにするためのサンプル最適化が最...

真核生物のDNAはヒストンタンパク質によって組織化および圧縮され、クロマチンを形成します。ヌクレオソームコア粒子(NCP)は、DNA修復、転写、および複製のためのDNA結合タンパク質へのアクセスを調節するクロマチンの基本的な繰り返し単位を構成します1。NCPの最初のX線結晶構造は20年以上前に最初に解決され2、3,4,5,6以降、NCPの構造はさらに多くのものが発表されていますが、ヌクレオソーム基質のDNA修復メカニズムはまだ解明されていません。クロマチンのDNA修復の根底にある分子の詳細を明らかにするには、NCPの局所的な構造的特徴がDNA修復活性をどのように調節しているかを理解するために、関与する成分の構造特性評価が必要です。BER酵素を用いた生化学的研究により、触媒作用のための酵素特異的構造要件およびヌクレオソーム内のDNA病変の構造位置に依存するヌクレオソーム内のユニークなDNA修復メカニズムが示唆されていることを考えると、これは塩基除去修復(BER)の文脈において特に重要である7,8,9,10,11,12,13。.BERが重要なDNA修復プロセスであることを考えると、これらのギャップを埋めると同時に、関連するヌクレオソーム複合体を含む他の技術的に実行可能な構造研究を実施できる出発点を確立することにかなりの関心があります。
クライオ電子顕微鏡は、均質なサンプルの大規模な調製が困難な複合体の3次元(3D)構造を解くための選択方法に急速になりつつあります。DNA修復因子(NCP-DRF)と複合体を形成したNCPの設計と精製には、カスタマイズされた最適化が必要になる可能性がありますが、安定したNCP-DRF複合体を生成および凍結するためのここで紹介する手順では、サンプルとクライオEMグリッド調製を最適化する方法の詳細を説明します。 図 1 に示す 2 つのワークフロー (相互に排他的ではありません) とプロトコルの具体的な詳細は、重要なステップを識別し、これらのステップを最適化するための戦略を提供します。この研究は、ヌクレオソームDNA修復の分子メカニズムをよりよく理解するために、構造研究で生化学的に補完することが技術的に実現可能になる方向にクロマチンとDNA修復分野を推進します。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7.5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエンティフィック 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>バイオラッド</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% グルタルアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491Prep Cell</td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 遠心フィルター (MW カットオフ 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 遠心フィルター (MW カットオフ 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid Tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>自動プランジフリーザー</td><td>ライカ</td><td>ライカ EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 タッチサーモサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C クリップとリング</td><td>サーモフィッシャー</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>クリッピングステーション</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>透析膜 (MW cufoff 6-8 kDa)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドピンセット</td><td>テクニプロ</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>統合 DNA技術</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI TITAN Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 精製システム</td><td>AKTA Pure</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge Cleaning System</td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>Grid Boxes</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>グリッドストレージアクセサリーパック</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>液体エタン</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 蠕動運動 2ヘッドポンプ</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (VWR) ローリテンション</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>ポリアクリルアミドゲル溶液 (37.5:1)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール (PEG)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>ピュアライザー マキシ 3500</td><td>ミリポアシグマ</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>精製された組換えDNAの修理因子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1.2/1.3 Cu 300の網 四</td><td>分石</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒストンの八量体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ばねのクリッピング用具</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 コラム 10/300</td><td>ミリポア シグマ</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>サーモフィッシャー</td><td>タロス アークティカ 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット FEI用 Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure グリセロール</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>サイモフィッシャー サイエンティフィック 15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>サーモフィッシャー</td><td>マークIVシステム</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 濾紙 (55 mM)</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシア</td><td>ノール Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Micro Spin Desalting Columns、7K MWCO、75 & micro;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのdna修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

クロマチンの文脈でのDNA修復はよく理解されていません。クロマチンの基本繰り返し単位であるヌクレオソームコア粒子を用いた生化学的研究では、ほとんどのDNA修復酵素が遊離DNAと比較してDNA損傷を減少した速度で除去することが示されています。塩基除去修復(BER)酵素がヌクレオソームのDNA損傷をどのように認識して除去するかについての分子の詳細は解明されていません。しかし、ヌクレオソーム基質の生化学的BERデータは、ヌクレオソームがDNA病変の位置と酵素に応じて異なる構造障壁を提示することを示唆しています。これは、遊離DNAのDNA損傷を除去するためにこれらの酵素によって使用されるメカニズムが、ヌクレオソームで採用されているメカニズムとは異なる可能性があることを示しています。ゲノムDNAの大部分がヌクレオソームに集合していることを考えると、これらの複合体の構造情報が必要です。今日まで、科学界はこれらの複合体の技術的に実行可能な構造研究を実行するための詳細なプロトコルを欠いています。ここでは、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)構造決定のために、ヌクレオソームの出入り付近の一塩基ギャップに結合した2つの遺伝子融合BER酵素(ポリメラーゼβとAPエンドヌクレアーゼ1)の複合体を調製する2つの方法を提供します。どちらのサンプル調製方法も、プランジ凍結 による 品質グリッドのガラス化に対応しています。このプロトコルは、異なるBER因子、パイオニア転写因子、およびクロマチン修飾酵素を有する他のヌクレオソーム複合体を調製するための出発点として使用できます。

適切に組み立てられたNCP(図2)を使用して、MBP-Polβ-APE1の組換え融合タンパク質との複合体を作成しました(図3)。安定な複合体を形成するためのNCPとMBP-Polβ-APE1の比率を決定するために、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)(図4)を実施し、MBP-Polβ-APE1の5倍モル過剰でNCPの単一シフトバンドを示しました。この複合体を作る最適化の間、グルタルアルデヒドとの架橋はNCPがバラバラになるのを防ぐために重要でした。最初に、NCP-Polβ-APE1の複合体の組み立ては、0.005%の最終グルタルアルデヒド濃度を用いて、約10μM NCPのより小さな体積で行われた。これらの条件下では、サンプルは過度に架橋され(図5D-E)、識別可能な個々の複合体のない凝集体をもたらしました。約10倍希釈したNCP(...

このプロトコルは、TEMグリッドを凍結するためのサンプル調製の2つの方法を使用したヌクレオソーム複合体の調製について詳細に概説しています。

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

塩基除去修復酵素がクロマチンに関連してDNA病変をどのように除去するかに関する構造情報は乏しい。これは、ヒト疾患の病因に関与するメカニズムの理解における大きなギャップを構成します。私たちのプロトコルの主な利点は、標準的な実験装置を使用してサンプル調製を最適化していることです。これにより、この分野の他の生化学者は、技術的に実現可能なクライオEM研究で生化学的研究を補完することができます。私たちのプロトコルは、パイオニア転写因子を含む他の因子がヌクレオソームにどのように関与しているかを調べるためにさらに使用することができます。これは、構造情報も限られている領域です。凍結条件に移行する前にサンプル調製を最適化することは、プロジェクトを前進させるための鍵であり、これは基質設計、結合、および架橋条件における標準的な生化学的アッセイで最もよく行われます。まず、特定の複合体に最適なバッファーを使用して、NCPと目的のDNA修復因子を氷上で15分間インキュベートします。次に、グルタルアルデヒドを最終濃度0.005%まで添加よく混合した後、室温で13分間インキュベートします。1モルのトリス-CLで、pH 7.5で終濃度20ミリモルのトリス-CLまでクエンチします。その後、約50マイクロリットルまで濃縮し、脱塩カラムを用いて緩衝液を凍結緩衝液と交換する。次に、光学密度280および260ナノメートルでの吸光度を決定し、必要に応じて、光学密度280ナノメートルに基づいてミリリットルあたり1.3〜3ミリグラムに達するようにさらに濃縮します。透析ボタンを準備したら、メンブレンを下に向けてポリエチレングリコールベッドの上にサンプルを入れたボタンを置きます。サイズ排除クロマトグラフィーによる精製を行うには、サイズ排除カラムを60ミリリットルの蒸留水で洗浄および平衡化し、続いて80ミリリットルの凍結バッファーを毎分0.4ミリリットルの速度で一晩平衡化します。その後、直ちにピーク画分を分析し、ヒストン注入タンパク質MBP-PolBeta-APE1を含む画分を濃縮する。以下の手順を実演するのは、ここNIHのクライオEMコアからの学士号取得後の研修生であるエリザベス・ビベレットです。プランジフリーザーの電源を入れ、加湿器に50ミリリットルの蒸留水を入れた後、チャンバーの温度を摂氏22度、湿度を98%に設定し、次にエタンカップと液体窒素カップをそれぞれのスペースホルダーに入れます。その後、エタンカップをエタン蓋ディスペンサーで覆い、窒素カップに液体窒素を満たしながら、その上に液体窒素を注意深く注ぎます。液体窒素レベルが安定して100%に達し、温度が摂氏マイナス180度に達したら、エタンバルブを慎重に開き、透明な蓋に気泡が形成されるまでエタンカップを満たします。次に、エタンディスペンサーを取り外します。2枚のろ紙を吸い取り装置の上に置き、金属リングで固定します。セットアップに移動し、原稿の説明に従ってブロッティングパラメータを設定し、A-プランジを選択してOKをクリックします。メイン画面で、Load Forcepsをクリックし、カーボン塗布側が左を向いたグリッドでロードします。鉗子を校正し、Z軸を調整してしっかりとしたしみを確保します。下部チャンバーをクリックして、3マイクロリットルの複合体を塗布します。次に、ブロットAプランジをクリックすると、グリッドが回転して正面からブロットし、プランジフリーズします。移送後、グリッドを液体窒素チャンバー内のグリッドボックスに保管してください。4つのグリッドすべてが凍結してグリッドボックスに配置されたら、すべてのグリッドが蓋で覆われるニュートラル位置に蓋を回転させ、ネジを締めます。サンプルを顕微鏡にセットする前に、ガラス化グリッドをリング上に置き、氷の汚染を避けるために、湿度管理された部屋で液体窒素の下でCクリップを使用して固定します。顕微鏡をロードするときは、グリッドを12スロットカセットに挿入します。カセットをナノキャブ カプセルにシャッフルし、オートローダーにロードします。次に、グリッドをカセットから顕微鏡ステージに移します。ステージを 10 度ぐらつき、同時に Z 高さを移動して、画像に最小の平面シフトが観察されるようにすることで、ステージをユーセントリック高さに調整します。ユーセントリックの高さに達したら、各モンタージュを62倍の倍率で撮影してアトラスを取得するグリッドの3 x 3モンタージュ画像を撮影してイメージングを開始します。さまざまなサイズの3つの正方形を選び、ユーセントリックの高さを撮影した後、210倍の倍率で画像化します。正方形が画像化されたら、正方形内のエッジ、中央、およびその間のそれぞれから1つの穴を選択します。次に、各穴を2, 600倍の倍率で画像化します。36、000倍の倍率、7.1秒の露光時間、60フレーム、1.18ピクセルサイズ、3マイクロメートルの焦点ぼけで、穴の中心から高倍率の画像を撮影します。上映の代表的な画像をご覧ください。安定な複合体を形成するためのNCPとMBP-PolBeta-APE1の比率を決定するために、電気泳動移動度シフトアッセイを実施し、MBP-PolBeta-APE1の5倍モル過剰でNCPの単一シフトバンドを示しました。少量では、NCP-PolBeta-APE1の複合体の組み立ては、サンプルが過度に架橋され、識別可能な個々の複合体のない凝集体をもたらすことを示しました。しかし、NCPを10倍に希釈すると、凝集が大幅に減少し、粒子の安定性が向上しました。分取ゲルとサイズ排除の方法を組み合わせることができ、分取ゲルが大量の高分子量凝集体を含む場合、NCPの品質を改善し、続いてサイズ排除によって複合体を精製します。結果は、両方の方法を独立して使用して安定した錯体を生成できることを示しています。さらに、両方のグリッドから収集されたデータは、ほぼ同一の2次元クラスと約3.2オングストロームの解像度で3次元マップを示しています。DNA修復因子に対するNCPの最適な比率を最初に決定し、次いでグルタルアルデヒドとの複合体の架橋を凍結に必要な濃度の少なくとも10倍希釈して実施すべきである。複合体のクライオEM 3Dマップを取得した後、DNA修復因子がどのように見出されるかを決定し、これらの相互作用にとってどの領域が重要であるかを特定するために、さらなる構造改良が必要になります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡（AFM）は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。...

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

電子分光イメージングは、ナノメートルの分解能で核酸とタンパク質を画像化し、区別することができます。miniSOGシステムと組み合わせることで、透過型電子顕微鏡サンプル中のタグ付きタンパク質を特異的に標識することができます。これらの技術の使用を例として、二本鎖断線修復病巣を使用して説明します。...

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

このプロトコルでは、シアノ バクテリアの一時的な DNA の締固めを可視化する方法について説明します。同期の栽培、蛍光顕微鏡、急速凍結、高によって監視電圧低温電子断層撮影法を使用します。これらの方法のためのプロトコルを提案し、,...

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM)...

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3)...

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。...

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

このプロトコールは、 Methanocaldococcus jannaschii...

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

学ぶクライオ電子顕微鏡によるヌクレオソーム複合体の作製法。DNA修復因子との相互作用を構造生物学で解析し、標準的な実験機器を用いて生化学研究を補完する。

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

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