Name: 電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイム測定法。電気刺激と共焦点顕微鏡を用いて、生きた個体の筋肉発達を高精度で観察し、筋萎縮症の治療戦略開発に貢献する。

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著者らは、記載されたプロトコルの開発のためのヒューズ研究室のメンバーであるSeetharamaiah Attili、Jana Koth、Fernanda Bajanca、Victoria C. Williams、Yaniv Hinits、Giorgia Bergamin、およびVladimir Snetkov博士の努力、およびプラスミドまたはゼブラフィッシュ系統を共有したHenry Roehl、Christina Hammond、David Langenau、Peter Currieに深く感謝しています。SMHは、プログラムグラントG1001029、MR / N021231 / 1、およびMR / W001381 / 1サポートを持つ医学研究評議会(MRC)の科学者です。MAは、キングスカレッジロンドンでMRC博士課程の博士課程の学生資格を取得しました。この研究は、学者、メンター、そして友人であるデビッドM.ロビンソンの三角関数の入力から恩恵を受けました。

著者は競合する利益を宣言しません。

本稿では,色素沈着が画像形成に大きな支障をきたさない段階や遺伝的変異において,一過性の麻酔や固定化が忍容性が高い場合に,生きたゼブラフィッシュ幼生の筋肉量を正確かつ効率的に推定する方法について報告する.これまではレーザー走査型共焦点顕微鏡を採用してきましたが、ここで説明するアプローチは、スピニングディスク共焦点顕微鏡やライトシート顕微鏡、および異なる焦点面で画像のスタックを作成するその他の方法に適用できます。組織サイズと細胞含有量の推定に対する一連のますます洗練されたアプローチについて説明します。それぞれの方法には利点と制限があり、定量化できることを示しています。組織成長の研究における主な制限は、急性投与された刺激によって触媒される一連の分子または細胞内イベントに応答して成長速度が変化するため、成長変化をリアルタイムで分析することの難しさです。さらに、個人差は、別々の個人を比較するときに問題を引き起こす可能性があります。現在のアプローチでは、単一の生きている個体における1日未満の期間にわたる組織成長の測定が可能です。このアプローチの適用は、分単位のタイムスケールで想定できます。
記...

細胞数の増加(過形成)および/または細胞サイズ(肥大)を含む調節された組織成長は、発生、再生、および生態学的および進化的適応における重要な要素です。ここ数十年で細胞生物学と発生生物学の両方の分子遺伝学的理解が大幅に進歩したにもかかわらず、組織と臓器のサイズの制御の機構的理解はまだ始まったばかりです。知識におけるこの不足の理由の1つは、必要な空間的および時間的精度で生物の組織成長を定量化することの難しさです。
生物全体の成長のさまざまな側面を経時的に繰り返し測定することができ、個々の成長曲線を明らかにすることができます1,2,3,4,5。二重X線吸収測定法(DXA)、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)などのますます洗練されたスキャン方法により、ヒトとモデル生物の両方の単一の個人における臓器全体および他の身体領域(たとえば、個々の識別された骨格筋)の成長の追跡が可能になります6,7,8,9,10.しかし、これらの方法では個々の細胞を明らかにする分解能がまだないため、細胞の挙動と組織レベルの成長との関連を特定することは困難でした。このようなリンクを作成するために、従来の研究では、類似した個々の動物のコホートに依存することが多く、そのうちのいくつかは連続した時点で犠牲にされ、細胞学的に詳細に分析されます。このようなアプローチでは、(できれば類似しているが、それでも変動する)個人のグループ間で観察された変化を平均化する必要があるため、時間的および空間的分解能の欠如に悩まされ、原因と結果を示唆する細胞レベルで相関イベントを見つけるのが困難です。
無脊椎動物のモデル生物に関する研究は、最初はC.エレガンスとD.メラノガスターでしたが、光学顕微鏡を開発して細胞分解能を達成し、単一の個体の経時的な成長を正確に測定することで、これらの問題を回避しました。このような研究は、これらの小さなモデル生物の成長における著しく不変な細胞系譜挙動を明らかにしました11、12、13、14、15、16、17。しかし、すべての脊椎動物を含む多くの動物は、不確定な細胞系譜を持ち、遺伝的にコードされた成長プログラムを、そのすべての構成組織と器官が適切に一致する機能的な3次元生物に変えるのに役立つ神秘的なフィードバックプロセスによって組織の成長を制御します。これらの複雑な成長過程を理解するためには、選択した時点で遺伝的、薬理学的または他の介入によって実験的に操作され、その後効果を分析できる単一の個体において、組織全体または臓器全体を経時的に画像化することが望ましい。
各脊椎動物の骨格筋は、定義されたサイズ、形状、機能、および骨、腱、神経などの隣接組織との十分に特徴付けられた相互作用を持っています。一部の筋肉は小さく、皮膚のすぐ下にあるため、高解像度の画像検査に適しています。ほとんどの臓器と同様に、各筋肉は、安定した成人のサイズに達する前に、胎児、出生後、および若年期を通じて成長します。しかし、筋肉には、使用と栄養に応じて、成人期にサイズを変える独自の能力もあり18、この特性は、生物のフィットネス、スポーツパフォーマンス、および自立生活に大きな影響を与えます。老年期の筋肉量と機能の低下であるサルコペニアは、人口の高齢化に直面している社会にとってますます懸念されている問題です19,20,21。
私たちらは、ゼブラフィッシュ幼虫のセグメント的に繰り返される体における骨格筋組織の定義されたブロックの成長に、組織の成長、維持、および修復を観察および操作できる数百の細胞を含む明らかに閉じたシステムとして焦点を当てました22,23,24,25,26。いくつかの定量的研究は以前に報告されていますが25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、個々の脊椎動物生物の細胞の詳細で筋肉成長を経時的に測定する詳細で検証された方法は利用できません。ここでは、そのような繰り返し測定を実行する方法のための効率的なプロトコルが検証とともに説明され、変化した電気的活動に応答して肥大および過形成成長の両方の変化を分析するためのその使用例が提供される。

<table><tbody><tr><td>接着剤、Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-エアロゾル真空&nbsp;</td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>-</td></tr><tr><td>アガロース、低ゲル化温度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>溶けたら、ブロックヒーターで37oCに保ち、液体の形で繰り返し使用します。</td></tr><tr><td>ブロックヒーター</td><td>コールパーマー</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-セラミド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>D3521</td><td>魚水で希釈して 5 & マイクロで使用します。Mは一晩のインキュベーション用です。</td></tr><tr><td>クロコダイルクリップとワイヤー</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-フィジー/imageJ</td><td>国立衛生研究所、NIH</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>魚媒体、魚の水</td><td>-</td><td>-</td><td>魚の施設から収集された循環システムの水。</td></tr><tr><td>魚用培地、E3培地</td><td>-</td><td>-</td><td>E3は、ゼブラフィッシュブックに記載されています。http://zfin.org(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4 蒸留水中)。</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライ</td><td>カ ライカ MZ16F</td><td>他の種類の蛍光顕微鏡も適していると期待されています。</td></tr><tr><td>ガラス針</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)</td><td>1B100-6</td><td>操作中の胚の損傷を防ぐために、ファイヤーポリッシュすること。</td></tr><tr><td>グラススティミュレーター</td><td>グラスインスツルメンツ</td><td>S88</td><td>他の種類のスティミュレーターも適していると期待されています。</td></tr><tr><td>Kimwipes, Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td></td> <td>13258179-Laser</td></tr> <tr><td>scanning microscope (LSM)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880</td><td>LSM 他の種類のLSMも適していると予想されます。</td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Treated、6ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>140675-Objective</td></tr><tr><td>、20回;/1.0W 水浸Zeiss</td><td></td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>パスツールピペット、目盛り付き 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100</td><td>-</td></tr><tr><td>パスツールピペット、Micro Fine Tip 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100</td><td>-</td></tr><tr><td>ペトリ皿、60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>プラスミド、CMV-Cerulean</td><td>Christina L. Hammond(ブリストル大学)</td><td></td><td>pCS2+_cerulean_kanRプラスミドを1細胞期に25-75 pgで注入。引用:Bussman J、およびSchulte-Merker S.(2011)開発138:4327-4332。土井:10.1242 / dev.068080。</td></tr><tr><td>プラスミド、pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (University of Sheffield)</td><td>-</td><td>SP6プロモーターを用いたin vitro転写用(他の膜標識マーカーを含むプラスミドを使用可能)。 合成されたキャップ付きmRNAを1細胞期に100-200 pgで注入します。</td></tr><tr><td>パルスコントローラ&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750</td><td>-</td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/MS-222; 魚の水に溶解し、0.6 mMで使用すること。</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>時計メーカーの鉗子、No.5</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤー、プラチナ</td><td>グッドフェロー</td><td>PT005142/12</td>、<td>直径0.40mm、銀の高価な代替品。</td></tr><tr><td>ワイヤー、シルバー</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>、直径317730010</td><td>0.25mm(直径0.25〜0.5mmの範囲がテストされ、同様の結果が得られました)。</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ、myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Massachusetts General Hospital;ハーバード幹細胞研究所)</td><td>-</td><td>ZFIN正式名称:Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp;引用:Tang Q、Moore JC、Ignatius MS、Tenente IM、Hayes MN、Garcia EG、Torres Yord&aacute;n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. 光学的に透明な免疫不全ゼブラフィッシュへの細胞移植後の腫瘍細胞の不均一性のイメージング.ナット・コミュニケート。2016年1月21日;7:10358。土井:10.1038 / ncomms10358。</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ, &alpha;-actin:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN 正式名称: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 引用: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. ゼブラフィッシュ変異体 tr&auml におけるトロポモジュリン4の喪失;GEは、ネマリンミオパチーを彷彿とさせる細胞質桿体形成と筋力低下を引き起こします。Dis Model Mech. 2014年12月;7(12):1407-15.土井:10.1242 / dmm.017376。</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ、&beta;-actin:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN正式名称:Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)、vu119Tg。 http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp;引用:Cooper MS、Szeto DP、Sommers-Herivel G、Topczewski J、Solnica-Krezel L、Kang HC、Johnson I、およびKimelman D.GFPの重要な対比染色としてBODIPY TRメチルエステル色素を使用したトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の形態形成の視覚化。開発Dyn。2005年2月;232(2):359-68.土井:10.1002 / dvdy.20252。</td></tr><tr><td>ZENソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

生きた胚、幼虫または幼体のゼブラフィッシュの体全体の個々の細胞を視覚化するために、いくつかの方法を用いることができる。蛍光マークされた原形質膜を持つ生きた魚を共焦点レーザー走査顕微鏡でスキャンして、筋肉組織の体積と存在する筋線維の数を決定できることを示しています。生きた動物の細胞数とサイズを経時的に測定するための効率的なアプローチが説明され、より困難なセグメンテーション法に対して検証されています。筋肉の電気的、したがって収縮性の活動の制御を可能にする方法が記載されている。骨格筋収縮活動の喪失は、筋肉の成長を大幅に減少させました。幼虫では、パターン化された電気的誘発収縮活性の再導入を可能にするプロトコルが記載されている。記載された方法は、個体間変動の影響を最小限に抑え、生物の状況における様々な細胞および生理学的成長パラメータに対する電気的、遺伝的、薬物的、または環境刺激の効果の分析を可能にするであろう。その後、個人に対する定義された早期介入の測定された効果の長期フォローアップを行うことができます。

体節体積の迅速かつ正確な測定 ゼブラフィッシュ幼虫の筋肉成長の迅速な測定を可能にするサンプル調製、データ収集、および体積分析の方法が記載されている。筋肉サイズは、膜標的GFP(β-アクチン:HRAS-EGFP) またはmCherry(α-アクチン:mCherry-CAAX )で原形質膜に標識された魚を使用して、生きた動物で測定できます。幼虫をトリカインを用いて一過性麻酔し、低融点アガロースに装着し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化した。ソマイト17は、体幹尾界面31でのアクセス可能性を考慮して、筋肉サイズの分析のために選択された。実際には、理論と同様に、筋腫体積は、筋腫長(L)と3つの断面積測定値(CSA)の平均の積として計算できます(図2A、これは4スライス法と呼ばれます)。
この方法を検証するために、生きたゼブラフィッシュ幼虫の全筋腫共焦点Zスタック(<strong class="...

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

私たちのプロトコルは、骨格筋などの組織がどのようにそのサイズを調節するかを研究することを可能にし、これは重要な生理学的および医学的意味を持つ細胞および発生生物学の重要な問題であり続けています。私たちの技術の主な利点は、生体内の生きた動物において、高度な空間的および時間的精度で細胞増殖を観察および測定できることです。初期の筋肉成長に関する基本的な理解の進歩は、初期の筋肉の問題の発達的起源を浮き彫りにし、高齢者や筋肉消耗障害のある患者の筋肉喪失から保護するためのノボセラピューティクスの発見につながる可能性があります。1.5ミリリットルのチューブに1%LMAを準備し、繰り返し使用するために摂氏37度のヒートブロックに保管してください。マウントする魚を選択し、各魚を一過性に麻酔します。ヒートショックを避けるために、ヒートブロックからLMAアリコートを取り外し、設定のすぐ上まで冷まします。1%LMAの層でコーティングされた60ミリリットルのペトリ皿を取り、解剖顕微鏡のステージに置きます。幼虫を1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットで60ミリメートルコーティングされたペトリ皿に移し、できるだけ多くの移した培地を取り除きます。次に、パスツールピペットを使用して、LMAを数滴魚の上に置き、LMAが固まる前に、鉗子または火で磨かれた細かいガラス針を使用して、前後軸と背腹軸を水平から10度以内にして、LMAの上面近くに幼虫をすばやく向けます。または、1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用してください。最小限の魚の培地で幼虫を収集し、幼虫を冷却されたLMAのアリコートに移します。幼虫を5秒間沈めて、LMAに完全に囲まれます。次に、幼虫を回収し、LMAを一滴入れてアガロースでコーティングしたペトリ皿に移します。前に示したように幼虫をすばやく配置します。幼虫がアガロースドロップの表面近くに水平に正しく取り付けられていない場合は、取り外して再埋め込み、1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用して穏やかに吸引することで幼虫を簡単に回収でき、LMAはケムワイプを使用して穏やかに除去できます。LMA が設定されるまで約 10 分間待ちます。約10ミリリットルのトリカイン含有魚培地で皿をあふれさせます。共焦点スタックをキャプチャするには、アガロースの腫れが発生するため、スキャンする前にマウントされた魚を少なくとも10分間休ませます。サンプルディッシュを共焦点システムのステージにロードします。幼虫を見つけて、目的の体節に焦点を合わせます。Somite 17は、肛門ベント付近の局在化が容易で、イメージングが容易であるため、選択することができる。前部から体節を数えて確認してください。YZ画像をキャプチャするには、Zスタックをキャプチャするように設定します。魚の上点と

real-time-repeated-measurement-skeletal-muscle-growth-individual-live

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Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、麻痺したゼブラフィッシュの幼生の求心性ニューロンからの電気信号の記録を、側線神経節の近くにマイクロピペットを配置し、信号捕捉のための緩いシールを形成する方法を示しています。細胞外溶液は、この過程でニューロンの生存率を維持します。...

動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供...

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

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解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

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ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

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複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

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無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

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&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚をin...

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ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

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