Name: スカッシュにおける種間ハイブリダイゼーションのための胚レスキュープロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶスカッシュの胚レスキュープロトコル。Cucurbita pepoとCucurbita moschataの種間交配による未熟胚の再生法を解説。MS培地と抗生物質を用いた簡便な手法で、育種プログラムにおける遺伝的多様性向上に貢献します。

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この作業は、USDA国立食品農業研究所、NRSプロジェクト番号によってサポートされました。FLA-TRC-006176およびフロリダ大学食品農業科学研究所。

1.植栽と受粉
注:ハイブリダイゼーションが結実と生存可能な胚の生産をもたらす互換性のある遺伝子型を特定することが重要です。
<ol><li>植栽条件とメンテナンス<ol><li>ハイブリダイゼーションのためにスカッシュ遺伝子型(品種/アクセッション)の種子を入手します(表1)。</li>
		<li>50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に、1.38 g / kg N、1.38 g / kg P、および1.38 g / kg Kを含む完全なNPK肥料で修正した培養土を満たします。</li>
		<li>種子をその長さに等しい深さまで播種し、培養土で覆います。立っている水を作らずに干潟に水をまきます。その後、1日1回手で水をやり、メディアを湿らせてください。</li>
		<li>2番目の本葉段階で、苗を直径25cmから30cmの鉢に移植し、大さじ3杯/鉢で完全なNPK肥料で修正します。NPK 20:20:20を含む液体肥料500 mL /ポットを水1ガロンあたり1 gの濃度で添加して、週に1回植物に肥料を与えます。</li>
		<li>自然光の下で22〜28°Cの温度で温室内の植物を維持します。ブドウの遺伝子型については、温室内に支持トレリスを用意します(図1)。</li>
	</ol></li>
	<li>受粉の実行<ol><li>通常、カボチャの開花は、品種によって異なりますが、播種から6〜8週間で始まります(図2A、B)。植物が開花し始めたらすぐに制御された交配(交配)を始めます。温室条件下では、受粉は一年中行うことができます。</li>
		<li>翌日受粉の準備が整うC. ペポ および C.モシャタ 品種の雄花と雌花を特定します。そのような花を識別するには、花びらが黄色の色合いを持っているが開いていない花をチェックします。偶発的な昆虫の受粉を防ぐために、マスキングテープを使用して上部で閉じた花をそっとテープで留めます(図2C、D)。</li>
		<li>翌日の朝、花は受粉する準備ができています。ハイブリダイゼーションの成功率を向上させるために、午前10:00までに受粉を実施します27。</li>
		<li>花びらのテープで留められた上部をそっと取り除き、雌花と雄花を開きます。雄花から花びらを取り除き、雌花の柱頭に葯をそっとこすって花粉を移します(図3A)。</li>
		<li>受粉後、直ちに受粉した雌花をマスキングテープで閉じます。タグを使用して、受粉の日付を記録し、十字架で使用される父方と母方の両親を示します(図3B)。</li>
		<li>交配が成功した場合、卵巣が拡張され、1週間以内に小さな果実がすぐに形成されます(図4A)。その後、植物は受粉28 の45〜55日後に収穫の準備が整います(図4B)。</li>
	</ol></li>
</ol>2.胚救助技術
<ol><li>メディアの準備<ol><li>抗生物質ストックの準備:セフォタキシム(ナトリウム塩)の場合、抗生物質を4 mLの脱イオン水または蒸留水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、0.5 mLのアリコートを作ります。-20°Cで保存してください。 得られたストック溶液の濃度は250 mg/mLになります。</li>
		<li>アンピシリン(ナトリウム塩)の場合は、粉末を10 mLの水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、最終濃度100 mg / mLの1 mLストックに分注します。-20°Cで保存してください。</li>
		<li>1Lボトルに2.45gの培地(濃度4.91g/L)を蒸留水500mLに溶解してムラシゲ・スクーグ(MS)培地を作ります。ジェランガム1.5 gを加え、オートクレーブを121°Cで20分間加えます。ジェランガムはオートクレーブ中に完全に溶解します。</li>
		<li>オートクレーブ処理後、ボトルを50°Cの水浴に入れて培地を冷却する。 冷凍庫から抗生物質ストックを取り出し、層流キャビネットで解凍します。</li>
		<li>ミディアムボトルを層流フードに移します。0.6 mLのセフォタキシムストック溶液(250 mg / mL)と0.25 mLのアンピシリンストック(100 mg / mL)を培地ボトルに加え、よく混ぜます。約7 mLの培地を滅菌ペトリ皿(60 mm x 15 mm)に注ぎます。</li>
		<li>培地をペトリ皿で約15〜20分間固化させます。ペトリ皿をシーリングラップで閉じ、収納ボックスに入れます。室温で保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>胚レスキュー<ol><li>開始する前に、層流キャビネットを70%エチルアルコールで洗浄および滅菌します。</li>
		<li>カボチャの果実をメインのつるから壊したり切り取ったりして収穫し、緩んだ汚れがすべて取り除かれるまで、ラボシンクで液体洗剤(0.3%クロロキシレノールなど)で洗浄して果物の表面を消毒します(図5A)。</li>
		<li>十分な水道水ですすいでください。清潔なペーパータオルで果物を乾かします。果物を層流キャビネットに移動します(図5B)。</li>
		<li>滅菌層流キャビネット内の果物に70%エタノールを噴霧することにより、果物を表面滅菌します。滅菌ナイフで果実を二等分し(図5C)、種子を抽出します。</li>
		<li>滅菌鉗子を使用して種皮を無菌的に開き、未熟な胚を露出させます(図6)。未熟胚を、セフォタキシムとアンピシリンを添加したMS培地を含むシャーレに注意深く入れます(図7A)。ペトリ皿を閉じ、ラッピングフィルムで密封します。 注:胚のサイズに応じて、5つまたは6つの胚をペトリ皿に入れることができます。</li>
		<li>胚の入った密封されたペトリ皿を、25°C、相対湿度70%の16時間日長以下の成長チャンバーに入れます。汚染が発生した場合は、汚染されていない胚をすぐに同じ培地で新しいプレートに継代培養します。</li>
		<li>子葉は4日後に拡大し始め、10日後に緑色に変わります(図7B)。この時点で、必要に応じて、組織増殖を可能にするために、同じ培地を含む新しいプレートに継代培養を実行します。根は14日目に現れ始め(図7C)、21日目に子葉に根と子葉が伸びます(図7D)。 注:プロトコルで使用される培地は、補助的な成長調節剤なしで新芽および根への分化に適しています。</li>
		<li>この段階で、ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水で根から培地をそっと洗い流します(図8)。小植物をプラスチック容器(14 cm x 9 cm x 4 cm)に入れ、根を濡れたペーパータオルで覆います(図9A)。容器を覆い、必要に応じてペーパータオルを再び湿らせます。</li>
		<li>容器を室温(25〜28°C)で16時間の日長で保管してください。このステップは苗を順応させるでしょう。コンテナ内で7〜10日間順応した後、実生の長さは約3〜4になります。この間、必要に応じてペーパータオルを湿らせ直します。</li>
		<li>前述のように肥料で修正した50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に苗を移し、温室に移動します(図9B)。腐敗を防ぐために苗に水をやりすぎないでください。必要に応じて、細胞あたり約10〜20 mLを追加します。.</li>
		<li>2〜3回目の本葉の段階で、前述のように肥料を修正した培養土で満たされた直径30cmの鉢に苗を移植します(図10A)。前述のように、ブドウの木にトレリスサポートを提供し、植物が開花し始めたときに制御されたハイブリダイゼーションを実行します(図10B)。</li>
		<li>温室内の植物を自然光下で22〜28°Cの温度に維持します。果物と種子の特性について植物を評価します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

C. moschataとC. pepoの種間ハイブリダイゼーションを成功させるには、ハイブリッド胚を生成するための遺伝子型応答性によって決定される交差適合性障壁と、正常な種子への雑種胚の発生を妨げる受精後障壁の2つの主要なボトルネックがあります。スカッシュについて以前に報告されたように、現在の研究の相互適合性試験では、ほとんどの果実が単為結実で発達し、ほとんどの種子が生存不能であることが明らかになりました16。親の遺伝子型は、C. moschataとC. pepoの間の種間ハイブリダイゼーションの適合性にかなりの影響を及ぼします。現在の研究でテストされた24の交雑の組み合わせのうち、1つだけ(CとJ)だけが胚救助のための未熟胚を生み出しました。そのため、この研究は、開発されたプロトコルの効率をテストするための生物学的複製の欠如によって制限されていました。しかし、CおよびJ交雑から救出された10個の未熟胚について80%の再生効率が得られた。以前の研究では、C. pepoおよびC. moschat...

ウリ科(2n = 40)は、ウリ科の非常に多様な属であり、27の異なる種を含み、そのうち5種は家畜化されています1。これらの中で、ククルビタモシャタ、C.ペポ、 およびC.マキシマは世界で最も経済的に重要です。米国では、C. moschataとC. pepoが農業生産において最も重要な2つの種です。C. pepoは、クルックネック、ストレートネック、ドングリ、ホタテ、ココゼル、野菜骨髄、ズッキーニ、カボチャの夏と冬のカボチャの両方の品種グループを含む4つの亜種(オビフェラ、ペポ、兄弟、およびグマラ)で構成されています2,3,4,5。C. moschataは主に、バターナッツ、ディキンソン、チーズグループ1などの冬カボチャ市場タイプで構成されています。2種は形態学的にも表現型的にも多様であり、C. pepoは収量、早さ、茂みの成長習慣、果実の形、果実の大きさ、果色、皮の模様などの多様な果実形質が評価されています。一方、C. moschataは、熱と湿度、および病害虫抵抗性への適応で高く評価されています6,7。C. moschataとC. pepoの間の種間交雑は、2つの種間の望ましい特性の導入のための重要な戦略であるだけでなく、育種プログラムにおける遺伝的基盤の拡大も可能にします7,8。
C. moschataとC. pepoの初期の交配は、それらの適合性および/または分類学的障壁を決定するために行われました9,10,11、その後の研究は主に望ましい形質の伝達に焦点を当てていました12,13,14。2つの種間の種間交配は、病害抵抗性、非生物的ストレスへの適応性、およびC. moschataからの活力の増加とともに、ブッシュまたはセミブッシュの成長習慣などの新しい形質の伝達とC.ペポからの収量の改善を標的としています14,15,16。例えば、C. pepo(P5)とC. moschata(MO3)の間の特定の交配は、より高い果実収量をもたらしました13が、C. moschataアクセッション(ナイジェリアローカルおよびメニーナ)は、栽培されたC.ペポ栽培品種のポチウイルスに対する耐性の主要な供給源として広く使用されています17,18。
以前の研究では、C. moschataとC. pepoの間のハイブリダイゼーションは可能であるが困難であることが示された8,15。種間交配は、結実なし(流産)、生存可能な種子のない単為結実の果実(空の種子)、未熟胚が発達しない種なし果実(狭窄精子)、または胚救助によって成熟植物に救助できる未熟胚がほとんどない果実をもたらす可能性があります15,16。例えば、C. pepo(テーブルクイーン、母方)とC. moschata(大きなチーズ、父方)を交配しても生存可能な種子は得られませんでしたが、相互交配は134の受粉から57の生存可能な種子を生み出しました9。早瀬は、10°Cで一晩保存した花粉を用いて、午前4:00に交配を行った場合にのみ、C. moschataおよびC. pepo交配から生存種子を得た19。バゲットは、8つの異なるC. moschata品種をC. pepo(デリカタ)と交配し、103の総受粉のうち、正常に見える83の果実が得られましたが、それらのどれにも生存可能な種子が含まれていなかったと報告しました8。C. pepo (S179) と C. moschata (NK) の交配では、Zhangらは2,994個の種子を含む15個の果実を得たが、そのうち12個のみが生存可能であり、残りは初歩的な発達しか示さなかった。これらの研究は、C. moschataとC. pepoの間の種間交配が非常に有益であるにもかかわらず、交配から生存可能な種子を持つ果実を得ることが要求されていることを示唆しています16。
胚レスキューは、早期流産または発達不良の胚から生じる問題を克服するための適切な方法として提案されており、未熟胚の再生のための最も早く、最も成功した体外培養技術の1つです16,20。胚救助には、未発達/未熟な胚のin vitro培養とそれに続く無菌栄養培地への移植が含まれ、実生の回復を促進し、最終的には成熟した植物21。胚レスキューはスカッシュ育種で一般的に使用されていますが、その日常的な適用を可能にする適切な方法論の詳細な説明は不足しています。Cucurbita種における種間ハイブリダイゼーション障壁を克服するための胚救助技術の使用は、早くも1954年に報告された22。しかし、初期の研究における胚救助の成功は、報告されていないか、非常に低かった。Metwallyらは、C. pepoとC. martinezii23の交配から救出された100個の種間雑種胚のうち、10%の成功率(成熟した植物への再生)を報告した。Siskoらは、異なる交配の組み合わせから得られた胚の間で胚再生の成功率がばらつきがあることを報告しました:C. maxima(Bos. Max)とC. pepo(ゴールドラッシュ)を交配することによって得られた雑種の再生率は15.5%、C. pepo(ズッキーニ)とC. moschata(北海道)は20%、C. pepo(ゴールドラッシュ)とC. moschata(ドルガ)は37.5%でした24。 遺伝子型に加えて、培地およびインビトロ培養条件は、技術の成功のための重要な要素である25,26。本研究では、C. moschataとC. pepoの様々な交雑組み合わせをテストし、スカッシュにおける胚救助技術を利用するための簡単な方法論を開発した。シンプルで容易に再現可能な胚救助技術の開発は、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションと生殖質増強を促進するでしょう。

<table><tbody><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ステリス</td><td>アムスコ LAB 250</td><td></td></tr><tr><td>バランス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セフォタキシム</td><td>シグマ アルフリッヒ</td><td>C 7039</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ (1.5 ml)</td><td>シグマ アルフリッヒ</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>洗剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール、95%</td><td>Decon Labs</td><td>2805HC</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>ジェランガム</td><td>Caisson Laboratories</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>成長チャンバーまたは照明付き棚</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード/バイオセーフティキャビネット</td><td>The Baker Company, Inc</td><td>Edgegard</td><td></td></tr><tr><td>マスキングテープ</td><td>Uline</td><td>S-11735</td><td></td></tr><tr><td>のメディアボトル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>むらしげ &Skoog Medium</td><td>Research Products International</td><td>M10200</td><td></td></tr><tr><td>NPK肥料(20-20-20)</td><td>BWI Companies、Inc</td><td>&nbsp;PR200</td><td></td></tr><tr><td>Osmocote Plus fertilizer</td><td>BWI Companie,s Inc</td><td>OS90590</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma Alfrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (60 x 15 mm)</td><td>USA Scientific, Inc</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>植木鉢</td><td>BWI Companies, Inc</td><td>NP4000BXL</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック食品容器、再利用</td><td>オスカー・メイヤー</td><td>4470003330</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックハングタグ</td><td>アマゾン</td><td>B07QTZRY6T</td><td></td></tr><tr><td>ポッティングミックス</td><td>ジョリーガーデナー</td><td>プロライン C/B</td><td></td></tr><tr><td>苗スタータートレイ</td><td>BWI Companies Inc</td><td>GPPF128S4</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター (0.22 um )</td><td>ExtraGene</td><td>B25CA022-S</td><td></td></tr><tr><td>トレリスサポート</td><td>ホームデポ</td><td>&nbsp;2A060006</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

スカッシュにおける種間ハイブリダイゼーションのための胚レスキュープロトコル

Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

ククルビタ作物(スカッシュ)における種間ハイブリダイゼーションは、遺伝的変異の拡大および有用な対立遺伝子の侵入のために望ましい。これらの広い交配から生成された未熟胚は、適切な胚救助技術を使用して再生する必要があります。この技術は多くの作物で十分に確立されていますが、その日常的な適用を可能にするスカッシュの適切な方法論の詳細な説明は不足しています。ここでは、C. pepoとC. moschataの種間ハイブリダイゼーションに有用な胚レスキュープロトコルについて述べる。胚救助のための実行可能な組み合わせを特定するために、24の種間交雑が実施された。結実は22の交配から得られ、92%の成功率を示した。しかし、得られた果実のほとんどは単為結実であり、種子には胚(空の種子)が含まれていませんでした。1つの交雑組み合わせのみが、基礎植物成長培地を使用して再生できる未熟胚を含んでいました。種間F1果実から合計10個の胚が救出され、胚救助の成功率は80%であった。ここで開発された胚救助プロトコルは、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションに役立ちます。

結実と種子の生存率 さまざまな交配の組み合わせで結実と種子の生存率を決定するために、最初のテストが実施されました。合計15のスカッシュ遺伝子型、4つのC. ペポ と11の C.モシャタが選択されました(表1)。試みられた24の種間交差の組み合わせのうち、22のフルーツセットが得られ(表2)、フルーツセット全体で&gt;92%の成功を表しています。OとMおよびEとJを交配しても成熟した果実は得られなかったが、FとJを交配することによって最も多くの果実(n=6)が得られた(表2)。異なる交配の組み合わせで受粉された花の数は1から11の範囲であり、受粉の成功率は0%から100%の範囲でした。交雑の組み合わせによって受粉された花の数は,花セットの数と雄花と雌花間の開花の同期によって異なりました。2つを除くすべての交配から果実を得たが、それらを切断した後の果実の評価は、ほとんどの果実が生存可能な種子のない胚を流産したことを明らかにした。ほとんどの交配からの果実は正常に見え...

この記事では、 ペポカボチャ と モシャタ菌の種間交配に由来する未熟胚の再生のための胚救助プロトコルについて説明しています。プロトコルは簡単に複製でき、スカッシュ繁殖プログラムの重要なリソースになります。

Interspecific hybridization in Cucurbita crops (squash) is desirable for widening genetic variation and for the introgression of useful alleles. Immature ...

胚救助プロトコルは、異なるククルビタ種間の種間交配に由来する未熟胚の再生に必須です。これは、ククルビタモシャタとククルビタペポの間の交配に最も一般的に使用されます。この手法の主な利点は、その単純さです。このプロトコルは、抗生物質を含むMS培地のみを使用します。したがって、どのラボでも簡単に複製できます。この手法を変更して、種間または属間ハイブリダイゼーションに対するさまざまな障壁を調査することは可能です。すべてのステップで詳細に注意を払うことは、成功する結果に役立ちます。窒素、リン、カリウムをそれぞれ1キログラムあたり1.38グラム含む、完全な窒素、リン、カリウム肥料を添加した培養土を使用して、25 x 50センチメートルの50セル開始フラットを埋めることによって、Cucurbita植物を植えることから始めます。次に、種子をその長さに等しい深さまで播種し、培養土で覆います。溜まった水を作らずにフラットに水をまき、1日1回水をかけて培地を湿らせます。2番目の本葉期の終わりに、鉢ごとに大さじ3杯の完全な肥料を加えた直径30センチメートルの鉢に苗を移植します。7日ごとに、1ガロンの水に加えた1グラムに20、20、20、20の窒素、リン、カリウムを含む500ミリリットルの液体肥料を各ポットに施肥します。自然光環境下で摂氏22〜28度の温度で温室内の植物を維持します。ブドウの遺伝子型については、温室内に支持トレリスを提供します。植物が播種から6〜8週間で開花し始めたらすぐに、制御されたハイブリダイゼーションまたは受粉を実行します。花弁に黄色の色合いを持つ未開封の花を確認し、ククルビタペポとククルビタモシャタ品種の雄花と雌花を特定します。偶発的な昆虫の受粉を防ぐために、マスキングテープを使用して閉じた花の上部をそっとテープで留めます。翌朝、午前10:00までに、雄花と雌花のテープで留められた上部をそっと取り外して受粉を行います。花びらを雄花から分離し、葯を雌花の柱頭にそっとこすって花粉を移します。受粉後、すぐに受粉した雌花をマスキングテープで閉じ、タグを使用して受粉日を記録し、十字架で使用されている父方と母方の両親を示します。拡張した卵巣によって示される成功した交配は、1週間以内に小さな果実を形成します。受粉の45〜55日後に果物を収穫します。セフォタキシムストックを準備します。滅菌済みの0.22ミクロンシリンジフィルターでろ過します。また、摂氏マイナス20度で保管する前に、1ミリリットルセフォタキシムあたり250ミリグラムの0.5ミリリットルアリコートを作ります。同様に、アンピシリンストックを準備します。滅菌済みの0.22ミクロンシリンジフィルターでろ過し、摂氏マイナス20度で保管する前に、1ミリリットルのアンピシリンあたり100ミリグラムの1ミリリットルアリコートを準備します。ムラシゲとスクーグ、またはMS培地を1リットルのボトルに500ミリリットルの蒸留水に2.45グラム溶解して調製します。1.5グラムのジェランガムをMS培地に加え、摂氏121度で20分間オートクレーブします。ボトルを摂氏50度の水浴に入れて培地を冷却します。層流キャビネット内の抗生物質ストックを解凍します。培地ボトルを層流フードに移し、0.6ミリリットルのセフォタキシムストックと0.25ミリリットルのアンピシリンストックを適切な混合で培地に加えます。約7ミリリットルの培地を60 x 15ミリメートルの滅菌ペトリ皿に注ぎます。培地をペトリ皿で約15〜20分間固化させます。ペトリ皿をシーリングラップで閉じ、さらに使用するまで室温で保管ボックスに入れます。カボチャの果実をメインのつるから切り取って収穫し、0.3%クロロキシレノールなどの液体洗剤を使用してラボシンクで表面を洗って果物を消毒します。果物を十分な水道水ですすぎ、清潔なペーパータオルで乾かしてから、果物をラミネートエアフローキャビネットに移します。70%エタノールをスプレーして、キャビネット内の果物の表面を滅菌します。滅菌ナイフで果物を二等分し、種子を抽出します。滅菌鉗子または滅菌手袋を着用した手を使用して種皮を無菌的に開き、未熟な胚を露出させてから、抗生物質を添加したMS培地を含むペトリ皿に入れます。ラッピングフィルムを使用してペトリプレートを密封し、摂氏25度の温度、16時間の写真周期、および70%の相対湿度の成長チャンバーに置きます。汚染された場合は、汚染されていない胚を直ちに同じ培地を有する新しいプレートに継代培養する。根が10〜14日後に発達し、子葉が15〜21日後に発達したら、ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水を使用して根の周りに存在する培地をそっと洗い流します。きれいにした小植物を14 x 9 x 4センチメートルのプラスチック容器に入れ、根を濡れたペーパータオルで覆います。容器を覆い、必要に応じてペーパータオルを再び湿らせます。プラスチック容器を摂氏25〜28度に保ち、16時間の写真撮影期間内に、ペーパータオルの湿った状態を維持しながら小植物を順応させます。7〜10日間の順応後、3〜4センチメートルの長さの苗木を、肥料で修正された市販の培養土を含む50セルフラットに移し、温室に移します。腐敗を防ぐために水やりを避け、必要に応じてセルあたり約10〜20ミリリットルの水を追加します。2〜3番目の本葉段階で、肥料を修正した培養土を満たした直径25センチの鉢に苗を移植し、開花を開始したときに制御された交雑を行います。自然光環境下で温室内の植物を摂氏22〜28度に維持します。そして、果物と種子の特性について植物を評価します。4つのペポカボチャと11のモシャタカボチャが種間ハイブリダイゼーションのために選択されました。試みられた24の種間交雑の組み合わせのうち、22の交配について果実セットが得られ、果実セットの92%以上の成功を表しています。遺伝子型OとM、および遺伝子型EとJを含むククルビタモシャタとペポカボチャの交配は、成熟した果実を生成しませんでした。一方、遺伝子型FとJを含むククルビタモシャタとペポカボチャの交配は、6つの果実を生産しました。異なる交配の組み合わせで受粉された花の数は1から11の範囲でした。そして、受粉の成功率は0%から100%の範囲でしたすべての交配の組み合わせから生産された44の果実のうち、ククルビタモシャタとペポの交配からの1つの果物、遺伝子型CとJは、救助できる未熟な胚を生産しました。これらの発育不良の胚の発生のために、それらは胚レスキュー培地を使用して培養され、その結果、胚レスキューの成功率は80%になりました。最も重要な2つの手順は、2つの種、すなわちモシャタ菌とペポ菌の間の互換性のある交配を特定し、胚再生を成功させることです。胚救助技術は単純で簡単に複製できるため、世界中のスカッシュブリーダーは、異なるククルビタ種間の種間交配に由来する未熟胚を救助するためにこの技術を使用できます。

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学ぶスカッシュの胚レスキュープロトコル。Cucurbita pepoとCucurbita moschataの種間交配による未熟胚の再生法を解説。MS培地と抗生物質を用いた簡便な手法で、育種プログラムにおける遺伝的多様性向上に貢献します。

スカッシュにおける種間ハイブリダイゼーションのための胚レスキュープロトコル

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