Name: カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ、Caenorhabditis elegansにおける脂質補給と遺伝子転写解析の手法。少数のワームや組織切片からRNAを抽出し、神経ペプチド処理遺伝子の発現変化を評価する方法を解説します。

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メンテナンスサポートを提供してくださったP. Svayに感謝します。この研究は、NIH助成金R01AG045183(MCW)、R01AT009050(MCW)、R01AG062257(MCW)、DP1DK113644(MCW)、マーチオブダイムズ財団(MCW)、ウェルチ財団(MCW)、HHMI研究者(M.C.W.)、およびNIH T32 ES027801博士課程前学生フェロー(M.S.)によってサポートされました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。

<ol><li>Fahy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1.</a> Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).</li>
<li>Liebisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+LIPID+MAPS+classification%2C+nomenclature%2C+and+shorthand+notation+for+MS-derived+lipid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures.</a> Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).</li>
<li>Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+lipid+signals+in+aging+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity.</a> Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).</li>
<li>Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+specific+lipid+species+in+the+cell+and+their+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism.</a> Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).</li>
<li>Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuffy%2C+J+%22Ageing%3A+Lessons+from+C.+elegans.+Healthy+Ageing+and+Longevity%22">Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity</a>. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+poly-unsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).</li>
<li>Folick, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+signaling+molecules+regulate+longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 347 (6217), 83-86 (2015).</li>
<li>Ramachandran, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+signaling+promotes+longevity+by+adjusting+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity.</a> Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).</li>
<li>Byrne, E. F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Smoothened+regulation+by+its+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains.</a> Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+window+into+biology%3A+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Nigon, V. M., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+C.+elegans+and+other+free-living+nematodes+as+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms.</a> WormBook. , 1-84 (2017).</li>
<li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook. , 1-26 (2014).</li>
<li>Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+bacterial+diet+on+fat+storage+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans.</a> PloS ONE. 4 (10), 7545(2009).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PloS Genetics. 2 (7), 108(2006).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+poly-unsaturated+fatty+acids+cause+behavioral+and+developmental+defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants.</a> Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+poly-unsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-CoA-specific+%CE%949+fatty+acid+desaturase+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).</li>
<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).</li>
<li>Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+animal+%CE%9412+fatty+acid+desaturase+gene+by+heterologous+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+%CF%89-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+%CE%945-fatty+acid+desaturase+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).</li>
<li>Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+of+polyunsaturated+fatty+acids+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50879(2013).</li>
<li>Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+influence+on+neurodegenerative+disease+progression%3A+is+the+vehicle+as+important+as+the+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695(2021).</li>
<li>Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids+and+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids and cell signaling.</a> Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-unsaturated+fatty+acids+link+H3K4me3+modifiers+to+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan.</a> Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CF%89-6+Poly-unsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).</li>
<li>Steinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+regulation+of+SKN-1%2FNrf+in+response+to+germ+cell+absence%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence.</a> eLife. 4, 07836(2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf%2C+stress+responses%2C+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).</li>
<li>Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+amide+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Fatty acid amide signaling molecules.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CF%89-3+fatty+acid+%CE%B1-linolenic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan+via+NHR-49%2FPPAR%CE%B1+and+oxidation+to+oxylipins%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins.</a> Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).</li>
<li>Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary-induced+signals+that+activate+the+gonadal+longevity+pathway+during+development+regulate+a+proteostasis+switch+in+Caenorhabditis+elegans+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254(2017).</li>
<li>Savini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+lipid+signalling+from+the+periphery+to+neurons+regulates+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity.</a> Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li>
<li>Jacob, T. C., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EGL-21+carboxypeptidase+E+facilitates+acetylcholine+release+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).</li>
<li>Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EGL-3+proprotein+convertase+regulates+mechanosensory+responses+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).</li>
<li>Bael, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+evidence+for+neuropeptide-amidating+enzymes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+metabolic+fingerprinting+of+neutral+lipids+with+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

脂質補給は、健康的な老化に対する特定の脂質種の直接的な影響を解明するための老化研究に採用されています6,7,23,26,27,31。ただし、脂質補給手順は困難な場合があり、実験間の不一致は再現性のない結果を引き起こす可能性があります。ここでは、技術的な不正確さによって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避するために、新しい科学者を導くために、最初の詳細なステップバイステップのプロトコルが文書化されています。このプロトコルの重要な手順については、次の段落で詳しく説明します。脂質研究ツールボックスは、脂質補給後に少数のワームおよび特定のワーム組織からのみRNA単離を導入することによっても拡張されます。転写産物レベルを調べる方法論を検討する場合、いくつか...

脂質 脂質は、有機溶媒に可溶であるが水には不溶性の小さな疎水性または両親媒性分子である1,2。異なる脂質分子は、それらの鎖に含まれる炭素の数、位置、二重結合の数、およびグリセロールまたはリン酸塩を含む結合構造に基づいて互いに区別します。脂質は、膜二重層の構成、エネルギー貯蔵の提供、シグナル伝達分子としての作用など、生物機能を調節するために、異なる細胞内および細胞間で重要な役割を果たします3,4。
まず、脂質は、細胞外環境から内部区画を隔てる原形質膜や細胞内膜を含む生体膜の構造成分である。第二に、脂質は脊椎動物および無脊椎動物のエネルギー貯蔵の主要な形態です。トリアシルグリセロールを含む中性脂質は、脂肪組織を含む様々な組織に長期間貯蔵される。線虫のカエノラブディティスエレガンスでは、腸は主要な代謝脂肪貯蔵器官です。その機能は、栄養素の消化と吸収だけでなく、哺乳類の肝細胞の活動に似た解毒の過程にも関与しています。他の脂肪貯蔵組織には、卵母細胞の発達に脂質が必須である生殖細胞系列、および皮膚様表皮細胞で構成される皮下組織が含まれます3,5。第三に、近年、脂質は、Gタンパク質共役型受容体や核内受容体などのさまざまな受容体に直接作用したり、膜流動性調節や翻訳後修飾を介して間接的に作用したりすることにより、細胞内外のシグナル伝達に関与する強力なシグナル伝達分子であることが示唆されています6,7,8,9。.さらなる研究は、長寿と健康寿命を促進する脂質シグナル伝達の根底にある分子メカニズムを解明し続けます。
モデル生物は、人間で研究するには複雑すぎる特定の生物学的問題に対処するために重要です。たとえば、回虫 C.エレガンスは 、人間の栄養と病気に関連する生物学的プロセスを解剖するための遺伝子分析を行うための優れたモデルです10。ヒトの生理学、複雑な組織、行動パターン、および豊富な遺伝子操作ツールに関連する高度に保存された分子経路により、 C.エレガンスは 注目に値するモデル生物となっています11。たとえば、 C. elegans は、表現型特異的遺伝子を特定するための遺伝子スクリーニングの転送、およびRNA干渉 を介した ゲノム全体の逆遺伝子スクリーニングに優れています12。
実験室では、線虫は大腸菌の芝生を播種した寒天ペトリプレートで成長し、タンパク質、炭水化物、飽和および不飽和脂肪酸などの主要栄養素をエネルギー源およびビルディングブロックとして提供し、補因子やビタミン13などの微量栄養素を提供します。哺乳類と同様に、線虫はパルミチン酸とステアリン酸の両方(それぞれ飽和16炭素分子と18炭素分子)から脂肪酸分子を合成し、順次不飽和不飽和脂肪酸(MUFA)と多価不飽和脂肪酸(PUFA)に伸長します14,15,16,17,18。興味深いことに、C. elegansは、脂肪酸生合成、不飽和化、および伸長に関与する必要なすべての脂肪酸およびコア酵素のde novo合成が可能であり、長鎖PUFAの合成を容易にします19。他の動物種とは異なり、C.エレガンスは、独自のω-3デサチュラーゼ酵素を使用して、18炭素および20炭素のω-6脂肪酸をω-3脂肪酸に変換できます。さらに、ワームはオレイン酸からのリノール酸(LA)の形成を触媒するΔ12デサチュラーゼを持っています(OA、18:1)20,21。ほとんどの動物または植物は、Δ12およびω-3デサチュラーゼの両方を欠いているため、PUFAを得るためにω-6およびω-3の食事摂取に依存しているのに対し、C.エレガンスは食事性脂肪酸を必要としない22。機能的なデサチュラーゼ酵素を欠く単離された変異体は、生殖、成長、寿命、神経伝達などの異なる生物学的プロセスにおける特定の脂肪酸の機能を研究するために使用されています。特定の生物学的経路に対する個々の脂肪酸の影響は、遺伝的アプローチと食事補給の両方を使用して対処できます16,17,23。今日まで、脂質研究は、神経学的および発達的条件における脂質合成、分解、貯蔵、および分解に関与する遺伝子の特性評価に焦点を合わせてきました24。しかし、長寿調節における脂質の役割は明らかになり始めたばかりです。
長寿制御における脂質シグナル伝達 脂質は、異なる組織や細胞型で細胞シグナル伝達カスケードを活性化することにより、長寿調節に重要な役割を果たします。最近の研究では、脂質結合タンパク質を介した転写および細胞間コミュニケーションの調節または膜受容体の認識における脂質の積極的な役割が強調されています25。さらに、食事療法の脂質補給は、脂質代謝がC.エレガンスの寿命にどのように影響するかを分析するための優れたツールを提供します。異なるMUFAおよびPUFAは、転写因子を活性化することによって長寿を促進することが示されている26,27。
インスリン/IGF-1シグナル伝達や生殖細胞前駆細胞のアブレーションなどの長寿モデルは、MUFA生合成経路に関連しており、オレイン酸、パルミトレイン酸、シスバクセン酸などのMUFA補給は、C.エレガンスの寿命を延ばすのに十分です26。MUFA投与によってもたらされた長寿効果はさらなる調査が必要ですが、根底にあるメカニズムは、酸化ストレス応答と長寿調節の重要な活性化因子であるSKN-1 / Nrf2転写因子によって媒介される可能性があります28,29。MUFAの中で、N-アシルエタノールアミン(NAE)と呼ばれる特定のクラスの脂肪酸アシルエタノールアミドは、炎症、アレルギー、学習、記憶、エネルギー代謝などの明確なメカニズムにおいて重要な役割を果たします30。特に、オレオイルエタノールアミド(OEA)として知られる脂質分子は、脂質結合タンパク質8(LBP-8)の核への転座を促進して核ホルモン受容体NHR-49およびNHR-80を活性化することにより、長寿の正の調節因子として同定されている7。OEAアナログKDS-5104の補充は、寿命を延ばすのに十分であり、酸化ストレス応答およびミトコンドリアβ酸化に関与する遺伝子の発現を誘導する7,8。
同時に、PUFAの役割は長寿規制にも関連しています。PUFAのω-3脂肪酸α-リノレン酸(ALA)の投与は、NHR-49 / PPARα、SKN-1 / NRF転写因子を活性化し、ミトコンドリアβ酸化を誘導することにより、長寿を促進します31。興味深いことに、オキシリピンと呼ばれるALAの過酸化生成物はSKN-1 / NRFを活性化し、PUFAとその酸化的誘導体の両方が長寿の利点をもたらす可能性があることを示唆しています23。ω-6脂肪酸アラキドン酸(AA)およびジホモ-γ-リノレン酸(DGLA)の補給は、オートファジー活性化を介して寿命を延ばし、タンパク質品質管理を促進し、無駄で有毒なタンパク質凝集体の分解をもたらす27,32。最近では、脂質結合タンパク質3(LBP-3)とDGLAによって媒介される細胞非自律的なシグナル伝達調節が、末梢信号をニューロンに送ることによって長寿を促進するのに重要であることが示され、全身レベルでの組織間コミュニケーションにおける脂質分子の長期的な役割を示唆しています33。本研究では、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液で脂質補給を行う各ステップを報告する。これらの方法論は、寿命と転写分析を評価するために使用され、全身の内容物またはいくつかのワームに由来する解剖組織を使用します。以下の技術は、さまざまな栄養研究に適応させることができ、脂質代謝が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための有効なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Pestle</td><td>Genesee Scientific</td><td>93-165P15</td><td>Trizol</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9639-500G</td><td></td></tr><tr><td>AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix</td><td>GenDEPOT</td><td>R5600</td><td>For reverse transcription from bulk worm samples</td></tr><tr><td>Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR</td><td>ThermoFisher</td><td>A28567</td><td>For qRT-PCR</td></tr><tr><td>ベンチマークサイエンティフィック StripSpin 12 マイクロ遠心分離機</td><td>ベンチマークサイエンティ</td>フィック <td>C1248</td><td>スピンダウンPCRチューブ用</td></tr><tr><td>ブランソン450デジタルソニファイア、1/8インチチップ付き</td><td>ブランソン超音波株式会社</td><td>100-132-888R</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5424 R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22620444R</td><td>RNA 抽出用</td></tr><tr><td>エッペンドルフ vapo はマスターサイクラー プロ</td><td>エッペンドルフ</td><td>950030010</td><td>逆転写用</td></tr><tr><td>エタノール、絶対 (200 プルーフ)</td> <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>グライナー バイオワン CELLSTAR、12 W プレート</td><td>ネタ サイエンティフィック</td><td>665180</td><td>12 ウェル液状飼料用プレート</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One ペトリ皿、Ps、100 x 20 mm</td><td>ネタサイエンティフィ</td><td>ック664161</td><td>細菌 LB プレートおよびワーム用 10 cm NGM プレート</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One ペトリ皿、Ps、60 x 15 mm</td><td>ネタサイエンティフィ</td><td>ック 628161</td><td>ワーム用 6 cm NGM プレート</td></tr><tr><td>Invitrogen ヌクレアーゼフリー水</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>イソプロアノール</td><td>Sigma</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール塩酸塩</td><td>VWR</td><td>SPCML1054</td><td></td></tr><tr><td>lipl-4Tg</td><td>MCW Lab</td><td>N/A</td><td>トランスジェニック C. elegans</em</td></tr><tr><td>>lipl-4Tg;fat-3(wa22)</td><td>MCW Lab</td><td>N/A</td><td>トランスジェニック C. elegans</td></tr><tr><td>Luria Broth Base</td><td>ThermoFisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode</td><td>ThermoFisher</td><td>4483354</td><td>96-well qPCR plate</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>応用バイオシステム</td><td>4311971</td><td>96ウェルqPCRプレートのシール用</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 浄水システム</td><td>シグマ</td><td>Z00Q0V0WW</td><td>プロトコルでヌクレアーゼフリー水として指定されていない限り、緩衝液や培養培地を含むすべての試薬の製造に使用される脱イオン水</td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N/A</td><td>C. elegans wild isolate</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td>N/A</td><td>RNA濃度の測定用</td></tr><tr><td>OP50</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター</td><td>N/A</td><td>C.エレガンス食品として使用される細菌</td></tr><tr><td>リン酸ジャガイモ二塩基性三水和物 (K2HPO4&middot;3H2O)</td><td>Sigma</td><td>P5504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ポタシウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>P0662-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green cells-to-Ct kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4402953</td><td>少数のワームまたはワーム組織からの逆転写およびqPCR用</td></tr><tr><td>パワーSYBRグリーンマスターミックス</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td>バルクワームサンプルからのqPCR</td></tr><tr><td>Pure Bright 殺菌性超漂白剤&nbsp;</td><td>KIKインターナショナルLLC.</td><td>59647210143</td><td>6% ハウスブリーチ ワームの卵の準備用</td></tr><tr><td>9つのくぼみを持つパイレックススポットプレート</td><td>シグマ</td><td>CLS722085-18EA</td><td>ワームを解剖するための時計ガラス</td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 除染液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>クロライドナトリウム(NaCl)</td><td>シグマ</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>シグマ</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物(Na2HPO4&middot;7H2O)</td><td>Sigma</td><td>S9390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend マッハ 1.6R 遠心分離機</td><td>Thermo</td><td>7500-4337</td><td>バクテリア収集用</td></tr><tr><td>Thermo Sorvall ST 8 遠心分離</td>機 <td>Thermo</td><td>7500-7200</td><td>ワーム卵調製用</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>TheroFisher</td><td>15596018</td><td>RNA抽出試薬</td></tr><tr><td>Turbo DNAフリーキット</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>RNA抽出におけるDNA汚染の除去用</td></tr><tr><td>Vortexer 59</td><td>Denville Scientific INV</td><td>S7030</td><td></td></tr><tr><td>VWR 使い捨てペレットミキサーとコードレスモーター</td><td>VWR</td><td>47747-370</td><td>Trizol</td></tr><tr><td>VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>ワームコレクション用。生産終了モデル、VWRでCat#76269-064</td></tr><tr><td>ウォームピ</td><td>ッカーWormStuff59-AWP</td><td></td><td></td></tr>で利用可能な同様のモデル</tbody></table>

カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

老化は、環境的および遺伝的寄与の両方に起因する進行性の生理学的変化を特徴とする複雑なプロセスです。脂質は、細胞膜の構造成分を構成し、エネルギーを蓄え、シグナル伝達分子として極めて重要です。脂質代謝とシグナル伝達の調節は、明確な長寿経路を活性化するために不可欠です。回虫 Caenorhabditis elegans は、長寿調節における脂質代謝とシグナル伝達の寄与を解剖するための優れた強力な生物です。複数の調査研究により、特定の脂質分子の食事補給がどのように C.エレガンス の寿命を延ばすことができるかが説明されています。ただし、補充条件のわずかな違いは、異なる研究室の科学者間で再現性の問題を引き起こす可能性があります。ここでは、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液のいずれかを用いた脂質補給を採用した C.elegans の2つの詳細な補充方法を報告する。また、全線虫溶解物または少数の線虫由来の解剖組織を用いて生涯脂質補給およびqRT−PCR分析を伴う寿命アッセイを実行するための詳細も本明細書に提供される。脂質補給時の縦断的研究と転写調査を組み合わせて使用 することで、脂質が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための信頼できるアプローチを提供します。この方法論は、少数の解剖組織または少数の動物のいずれかを使用して転写産物のサブセットの変化を評価するための様々な栄養スクリーニングアプローチにも適用することができる。

脂質補給時の数例全線虫を用いた転写変化の検証 いくつかの全線虫からRNAを抽出してcDNAにレトロ転写するプロトコルが再現性があり、バルク線虫からのデータと同等であるかどうかを調べるために、腸内でリソソーム酸リパーゼlipl-4を過剰発現する長寿命の線虫株を採用しました7、8、33、35。以前の研究7、8、33で報告された神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21の転写誘導が検証された(図2A、B)。</sup...

本プロトコルは、 カエノラブディティスエレガンスの液体およびオンプレート培養における脂質補給方法を、バルクまたは少数のワームおよびワーム組織からの縦断的研究および遺伝子転写分析と組み合わせて説明しています。

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

このプロトコルは、モデル生物C.elegansにおける縦断的分析と転写分析を組み合わせた2つの脂質補給戦略について説明しています。この手法では、少数のワームまたは解剖されたワーム組織を使用して転写変化を調べる方法と、バグ集団の液体供給をハイドロ技術と組み合わせる方法について説明します。この技術を実行する個人は、適切な転写分析を達成するために実験を実行するための短い時間枠のために組織解剖を練習しなければならない。はじめに、一晩増殖させた培養物を室温で10分間4, 000 Gで遠心分離することによってOP50細菌を集める。上澄み液を捨てる。ボルテックスにより細菌ペレットを20ミリリットルの細菌希釈、食事制限またはBDRベースに懸濁し、再度、遠心分離を10分間繰り返す。上清を廃棄した後、細菌ペレットをBDR培地に再懸濁し、20X BDR細菌ストックを調製した。使用前にBDR培地を使用して細菌ストックを5倍に希釈してください。エタノールまたはジメチルスルホキシドを溶媒として使用し、新しいオートクレーブ滅菌ガラスバイアルに脂質ストック溶液を調製し、酸化を防ぐためにガラスバイアルにアルゴンまたは窒素を充填します。脂質ストック溶液をBDR細菌溶液に移して、給餌条件で所望の最終濃度を達成する。20秒間ボルテックスして完全に混ぜます。同量の濾過エタノールまたはジメチルスルホキシドをBDR細菌と混合することによって制御されたビヒクルを準備する。所望の量の脂質またはビヒクルコントロールを、各給餌条件に対して3〜4回の反復で12ウェルプレートの各ウェルに移すことによって、脂質補給および液体培養を行う。同期したCaenorrhabditis elegansワーム懸濁液を5倍のBDR細菌と1対1の比率で混合して、1ミリリットルあたり1, 500虫、細菌の最終濃度2.5倍を達成します。次に、2ミリリットルのワーム細菌混合物を12ウェルプレートの各ウェルに移します。完了したら、12ウェルプレートをホイルで包み、摂氏20度のインキュベーター内でプレートを100 RPMMで希望のインキュベーション長に振とうします。プレートへの脂質補給のために、1ミリリットルの脂質コンディショニング細菌を10センチメートルの線虫増殖培地またはNGM寒天プレートの中心に播種します。多数のプレートで作業する場合は、2つのプレートをシードする間に最終的な作業溶液が複数回ボルテックスされていることを確認してください。バイオセーフティフード内の暗闇でプレートを乾燥させます。同期ワーム培養物から3000匹のワームを10センチメートルのプレートに移します。脂質補給プレートの上を泳いでいたワームが這い始めるまで、バイオセーフティフードでプレートを乾燥させます。乾燥したら、脂質調整プレートを摂氏20度のインキュベーター内で所望の時間インキュベートし、多価不飽和脂質を使用する場合はプレートを光から保護します。PCRチューブで0.2マイクロリットルのDNase Iと19.8マイクロリットルの溶解溶液を混合して、各サンプルに20マイクロリットルの最終溶解溶液を調製し、5回上下にピペッティングしてよく混合します。少数の全ワームからRNAを抽出するには、15〜20匹のワームをバクテリアの芝生から播種したばかりのNGMプレートに移して細菌を除去します。播種されていないNGMプレートから、最小数の細菌で新たに調製した最終溶解溶液20マイクロリットルを含むPCRチューブに15〜20匹のワームを移し、室温で5分間溶解反応をインキュベートします。インキュベーションが終了したら、サンプルを素敵な冷水浴に保ち、ワームを4回超音波処理し、超音波処理の各時間の間に30%振幅とパルスで毎回5秒間超音波処理します。チューブを室温で5分間インキュベートしてから、2マイクロリットルの停止液を溶解反応に加え、軽くたたくことで混合します。反応物を室温で2分間インキュベートし、次いでチューブを氷上に置く。ワーム組織からRNAを抽出するには、細菌の芝生から約20匹のワームを選び、それらを新しい播種されていないNGMプレートに入れて、ワームから細菌を除去します。できるだけ少ない細菌を含む20匹のワームを、4マイクロモルのレバミゾールを含む500マイクロリットルのM9溶液を含む時計のグラスに移します。ワームが固定されたら、1ミリリットルの注射器に取り付けることができる25ゲージの針を使用して生殖系列または腸を解剖します。オートクレーブ処理されたガラスピペットを使用して、解剖した組織をPCRチューブに移し、チューブを氷上に2分間沈降させて、底部に材料を堆積させます。PCRチューブから上清を取り除き、20マイクロリットルの最終溶解溶液を加え、軽くたたいてよく混ぜます。溶解反応を5分間インキュベートした後、2マイクロリットルの停止液を加え、チューブを複数回タップします。逆転写に進む前に、チューブを2分間インキュベートします。検証研究では、大規模な集団と少数のワームから抽出されたRNAは、神経ペプチドプロセシング遺伝子egl-3およびegl-21の同様の誘導を示しました。これは、少数のワームからのRNA抽出が、大規模な集団からの標準的なCDNA合成技術の有効な代替手段になり得ることを示唆している。ジホモ - γ-リノレン酸(DGLA)を補充したlipl-4導入遺伝子線虫の解剖された腸では、ニューロン神経ペプチドプロセシング遺伝子は誘導されなかった。異なる濃度でのDGLA補給は、脂肪3ノックダウン時の線虫の寿命延長を救った。脂質補給を施したワームは、RNAシーケンシング、プロテオミクス、メタボロミクス、および行動研究のために処理して、これらの特定の条件下で追加の表現型を特定することもできます。この方法論は、老化研究、脂質生物学、および特定の表現型と栄養因子または代謝物との関係を確立することを目的としたその他の研究分野に適用できます。

lipid-supplementation-for-longevity-gene-transcriptional-analysis

Research

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カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

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