Name: 微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぼう マイクロ流体法によるミクロゲルビルディングブロックの高通量合成を用いた再生医療用足場の作製法。単分散粒子の均一サイズ制御と組織統合性向上の手法を解説します。

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著者らは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のJoe de RutteとDi Carlo Labが、報告されたデバイスの開発元となるオリジナルのマイクロ流体デバイス設計、およびPDMSデバイスの製造とトラブルシューティングにおける初期のガイダンスを支援してくれたことに感謝したい。図の回路図は Biorender.com で作成した。

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルは、微多孔性アニール粒子(MAP)足場のビルディングブロックとして機能するミクロゲルを合成および特徴付けるための方法を記載している。このプロトコルは、ハイスループットマイクロ流体アプローチを使用して大量の均一なミクロゲルを生成するが、これは、フロー集束マイクロフルイディクス1,4,7,9 (高単二性、低収率)、バッチエマルジョン6,10、およびエレクトロスプレー5,12などの他の方法では達成できない。 (低単分散性、高収率)。本明細書に記載の方法を用いて、単分散ミクロゲルを、様々な再生医療用途(例えば、細胞送達、創傷治癒)に使用することができるMAP足場での使用のために作製することができる。
このプロトコルの重要なステップは、PDMSマイクロ流体デバイスの作成です。デバイスが正しく作られていない場合、これはミクロゲルの形成と単分散性にマイナスの下流に影響を与える可能性があります。PDMSが硬化する前に、PDMSにアーチファクト(気泡、ほこり)が入らないようにすることが重要です。これをできるだけ軽減するには、テープを使用してほこりを取り除き、デバイスをほこりのない容器に保管し、可能であればほこりのないフードで作業する必要があります。また、表面処理で最良の結果を得るために、デバイスを60°Cで保管することも推奨されます。
PDMS装置を注ぐ場合、生検パンチの長さとほぼ等しいかそれ以下の均一な厚さを維持することが重要です。装置が厚すぎると、生検パンチは最後まで貫通することができません。また、生検パンチでパンチしたり、チューブを挿入したりしている間に、PDMSデバイスの入口/出口を引き裂かないことも重要です。PDMSデバイスの裂け目は、入口/出口からの漏れを引き起こし、ゲル前駆体溶液の損失を引き起こす可能性があります。PDMSデバイスに漏れがある場合、最善の解決策は、できるだけ早く新しいデバイスと交換することです。
装置をプラズマ処理する場合、純酸素の使用と30秒間のプラズマ処理は、PDMSをスライドガラスに接着するための最良の結果をもたらしました。デバイスが正しく接着しない場合(つまり、プラズマ処理後にPDMSをスライドガラスから持ち上げることができる場合)、プラズマ処理器が正しく動作していること、およびデバイスとスライドが完全に洗浄されていることを再確認する必要があります。また、正しいシラン表面処理を使用することも重要であり、最良の結果を得るには、PDMSデバイスを使用前に直接表面処理する必要があります。化学蒸着などの他の表面処理方法も使用することができる。
もう1つの重要なステップは、PDMSマイクロ流体デバイスを使用してマイクロゲル形成に正しく使用することです。少なくとも2:1の流量比(このプロトコルは6mL/hのオイル流量と3mL/hの水性流量を使用します)を使用することをお勧めしますが、これは所望のミクロゲルサイズを達成するために調整することができます。ミクロゲル前駆体溶液のpHはまた、装置の目詰まりを防止するために最適化するための重要な測定基準でもある。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、マイケル型付加化学におけるチオレート形成を促進し、このプロトコルで使用されるPBS濃度は、マイクロ流体デバイスにおけるミクロゲルゲル化に最良の結果をもたらす。シリンジポンプが開始されると、マイクロ流体チャネルに気泡が存在する可能性がありますが、これは数分後に平衡化するはずです。顕微鏡でミクロゲル形成を監視することをお勧めします。流れがこのビデオのように似ていない場合、および/または大きな粒子を生成するチャネルがいくつかある場合は、表面処理ステップの問題が原因である可能性があります。最善の解決策は、デバイスを新しく表面処理されたものに交換することです。
ミクロゲルが合体しているように見える場合、これはフッ素系界面活性剤の濃度が不十分であることが原因である可能性があります。推奨される解決策は、油相中の界面活性剤の重量%を増加させることである。しかしながら、高濃度の界面活性剤を使用することに対する1つの制限は、精製工程中に除去することがより困難であり得ることである。マイクロ流体デバイスを一度だけ使用することをお勧めしますが、使用直後にNovecオイルで洗い流して、デバイス内でゲル化してチャネルを詰まらせる可能性のある水溶液を除去すると、デバイスを再利用できます。1つのマイクロ流体デバイスは高スループット量のマイクロゲル(mL/h)を生成できますが、この生産速度は、複数のマイクロ流体デバイスを並行して使用することによってスケーリングできます。
MAP足場アセンブリのアニーリング工程は、ラジカル重合の光活性化光開始剤の使用に依存しており、光開始剤は、所望の用途に基づいて選択することができる。例えば、LAP光開始剤は、長波UV光を使用する場合に速いアニーリング時間(<30秒)を有し、これはインビトロでの細胞生存率への影響を最小限に抑えます14。しかしながら、この波長は組織16によって高度に吸収され、インビトロほど高いアニーリング有効性をインビボで有さない可能性がある。
Eosin Yは、可視波長(505nm)によって活性化される別の光開始剤であり、組織へのより深い浸透を有し、これはMAP足場が組織の下でアニーリングされる能力を高める。しかしながら、Eosin Yアニーリングに必要な長い光曝露時間は、フリーラジカルへの細胞曝露を延長し、インビトロでの細胞生存率に影響を与える可能性がある14。これらの方法をハイスループットで均一性の高いミクロゲルビルディングブロックを生成することで、MAP足場に重点を置いた研究が加速し、再生医療用の注射用多孔質材料の分野における知識が進歩します。

MAP足場プラットフォームは、架橋時に細胞スケールのマイクロ多孔性を提供するヒドロゲル微粒子(ミクロゲル)で完全に構成された注射可能な生体材料であり、分解に依存しない細胞遊走およびバルク組織集積を可能にする1。MAP足場プラットフォームは、宿主組織と迅速に統合する能力と本質的に低い免疫原性により、真皮創傷治癒の加速を含む多種多様な再生医療療法2、3、4、5、6、7、8、9、10の前臨床適用性を実証しています1,3,11,血管再生脳脳卒中空洞7,間葉系幹細胞2の送達,及び血餅不全を治療するための組織増量の提供6。MAPはまた、M2マクロファージ3の動員を介して宿主組織に抗炎症効果を伝えることが示されており、Th2「組織修復」免疫応答を促進するように調整することさえできる8。MAP足場プラットフォームのこれらの好ましい特性により、多様な臨床用途に拡張することができます。
MAP足場形成のためのミクロゲルを生成するための以前に公表された方法には、フロー集束液滴マイクロフルイディクス1、4、7、9、エレクトロスプレー5,12、およびバッチエマルジョン6,10によるオーバーヘッドスピニングが含まれる。液滴マイクロ流体法は、高い単分散性の粒子を生成することができるが、粒子の収率(μL/h)が低い非常に遅い流速を使用する。あるいは、エレクトロスプレー法およびバッチエマルジョン法は、大量の粒子を、高い粒子多分散性で製造することができる。このプロトコルは、de Rutte et al13による研究に基づいて、ハイスループットマイクロ流体法を使用して、単分散集団を有するミクロゲルを製造する。この方法は、ソフトリソグラフィー技術を利用して、フォトマスクからポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを作成し、それをスライドガラスに接着する。装置設計は、大量のミクロゲル粒子(mL/h)を生成するために段階乳化に依存しています。この方法で達成できる単分散性は、単分散ミクロゲルがより均一な細孔径を有する足場を形成することができるので、他の技術と比較して空隙率の優れた制御を提供する2。
MAP足場のビルディングブロックとして作用することができる個々のミクロゲルを合成し、特徴付けるための方法は、特に、ミクロゲルゲル化のためのチオール官能化架橋剤による効率的なマイケル型付加に容易に関与する、マレイミド(MAL)基を有するPEG骨格からなるミクロゲルを作成するという点で、この原稿内で概説されている。マイクロゲルゲル化をMAP足場アニーリングから切り離すために、この論文では、ヘテロ官能性メタクリルアミド/マレイミド4アームPEGマクロマーである、公開されている14 カスタムアニーリングマクロマーMethMALを合成する方法についても説明します。メタクリルアミド官能基は、フリーラジカル光重合(ミクロゲルアニーリング用)に容易に関与し、MAL官能基に対するマイケル型付加を促進する条件に対して比較的不活性なままである。
さらに、この論文では、PDMSマイクロ流体デバイスの作成、マイクロゲルゲル化速度の決定、およびミクロゲルサイズの特性評価のためのプロトコルの概要を説明します。原稿の最後の部分は、MAP足場アニーリングを詳述しています.これは、ミクロゲルの表面を共有結合で結合する二次的な光開始架橋ステップを経て、ミクロゲルがその場 で バルク足場に移行するときです。前述のように、酵素媒介アニーリングなどの光ベースの化学に依存しないMAPスキャフォールドシステムで実装できる他のアニーリング方法があることに注意することが重要です1。全体として、これらの方法は、直接使用することも、異なるヒドロゲル製剤化学(例えば、ヒアルロン酸ベース)と共に使用して、任意の用途のためのMAP足場を生成することもできる。

<table><tbody><tr><td>2-アミノエタンチオール塩酸塩</td><td>Acros Organics AC153770250</td><td></td><td>MethMal Synthesis MW: 113.61 Da</td></tr><tr><td>35 mm プレート ローター</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>ジオメトリ HAAKE 粘度計用</td></tr><tr><td>4 アーム PEG-マレイミド (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>マイクロゲル前駆体溶液用</td></tr><tr><td>4 アーム PEG-マレイミド (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA株式会社</td><td>サンブライトPTE-200MA</td><td>メスマル合成用 各バッチBDシリンジに特異的な分子量</td></tr>ル<tr><td>アーロックチップ</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td></td><td>使い捨てプラスチックシリンジ生</td></tr><tr><td>検パンチ</td>マイ<td>テックス</td><td>MLTX33-31A-P / 25</td><td>1.5ミリメートル直径</td></tr>クロ<tr><td>ロホルム-d</td><td>アクロス有機化合物</td><td>AC209561000</td><td>メスマル合成</td></tr><tr><td>コリメーションLEDライト用出典</td>:<td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>培養皿 (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチル-モルホリニウム塩化物)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>151882</td><td>For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>008- の 5 重量パーセントHFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad 凍結乾燥システム</td><td>Labconco</td><td>7400000 Series</td><td>For MethMal Synthesis 凍結乾燥機</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-A3</td><td>プレーンガラススライド、コーティングされていない</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin 粘度計</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>バージョン 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 デュアルプロングシリンジポンプ</td><td>KDサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEDドライバ</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸(LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>光開始剤</td></tr>メタ<tr><td>クリル酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>MethMal Synthesis MW:86.09 Da 密度:1.015g/mL</td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイスSU8-Siマスターウェーハ</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>カスタムメイド、シラン化</td></tr><tr><td>MMP-2分解性架橋剤</td>付き <td>FlowJem</td><td></td><td>シーケンスAc-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>針 (25G、面取り)</td> <td>BD</td><td>305122</td><td>長さ:15.88 mm ゲージ:0.5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td></td><td>7100025016 フッ素化油</td></tr><tr><td>酸素</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>圧縮</td></tr><tr><td>ピークチューブ</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" 外径; 0.02" 内径; 長さ 10'</td></tr><tr><td>PFOCTS (トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>表面処理用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>超純水で 1x に希釈、pH = 7.4</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD 細胞接着ペプチド</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>配列: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin ソフトウェア</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>HAAKE粘度計と互換性のあるソフトウェア</td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>バードパー</td><td>カー371210</td><td>サイズ:#10</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>バードパー</td><td>カー371030</td><td>サイズ:#3</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-1</td>メス<td>マル合成用 MW:58.44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>DOW化学</td><td>2065622</td><td>ベースと硬化剤</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O4884-100</td>メス<td>マル合成用 MW:101.19 Da 密度:0.73g / mL</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>サンゴバンパフォーマンスプラスチック</td><td>AAD04103</td><td>ID:0.51 mm OD:1.52 mm</td></tr><tr><td>Varian Inova 500分光計</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR UVA生体分子磁気共鳴施設にあります</td></tr></tbody></table>

微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

微多孔性アニール粒子(MAP)足場プラットフォームは、粒状ヒドロゲルのサブクラスである。これは、二次光ベースの化学架橋工程(すなわち、アニーリング)に続いて、その場で細胞スケールの空隙率を有する構造的に安定な足 場 を形成することができるミクロゲルの注入可能なスラリーからなる。MAP足場は、皮膚創傷治癒、声帯増強、幹細胞送達など、さまざまな再生医療用途で成功を収めています。この論文では、MAPスキャフォールドを形成するためのビルディングブロックとして、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ミクロゲルの合成および特性評価の方法について説明します。これらの方法には、カスタムアニーリングマクロマー(MethMAL)の合成、ミクロゲル前駆体ゲル化速度論の決定、マイクロ流体デバイス作製、ミクロゲルのマイクロ流体生成、ミクロゲル精製、およびミクロゲルサイジングおよびスキャフォールドアニーリングを含む基本的なスキャフォールド特性評価が含まれる。具体的には、本明細書に記載されるハイスループットマイクロ流体法は、特に再生医療の分野において、任意の所望の用途のためのMAP足場を生成するために使用することができる大量のミクロゲルを生成することができる。

このプロトコルの目的は、MAPスキャフォールドで使用されるミクロゲルビルディングブロックを合成するために必要なすべてのステップを概説することです。MethMALアニーリングマクロマーは、非常に選択的かつ効率的であり、複数のポリマー主鎖14と適合性がある。高いアニーリング効率を確保するためには、20kDaPEG-マレイミドの少なくとも67%〜75%がメタクリルアミド官能基で修飾されていることが重要です。修飾パーセントは、図1に示すように、1H-NMRスペクトルピークを分析することによって最も容易に決定することができる。粘度計によって決定されるゲル化速度論は、各ゲル製剤について考慮すべき重要な測定基準である。このプロトコルは、ミクロゲルゲル化のためにチオール官能化架橋剤と効率的に反応するMAL基を有するPEG骨格からなるゲル前駆体溶液を使用する。しかしながら、多くのヒドロゲル化学は、本明細書に記載されるハイスループットマイクロ流体法を介してミクロゲルを作製するために使用することができる。ゲル化の開始までの時間は、マイクロ流体ミクロゲル生成の持続時間に関する洞察を提供する。ゲル化を開始できるゲル前駆体pHを30分(図2)から2時間の間で選択することをお勧めします。
ゲル化時間が速すぎると、ゲル前駆体溶液はマイクロ流体デバイス内で重合し始め、チャネルを詰まらせます。さらに、チオル化リガンド濃度(RGDなど)の変化は、ゲル化中のネットワーク形成に影響を与える可能性があり、製剤を調整することによって考慮する必要があるかもしれないことに注意することが重要です。マイクロ流体デバイスの製造手順は面倒な作業ですが、正常に接着されたデバイスの代表的な結果を図3に示します。このプロトコルは、de Rutte et al.13の設計から適応された高スループット、並列化、ステップ乳化マイクロ流体デバイスを使用し、シリコンウェーハ製造はマイクロ流体技術会社に委託されました。ただし、このプロトコルで概説されている手順は、SU-8シリコンウェーハフォトマスクにエッチングされた任意のデバイス設計で使用できます。フォトマスク上のチャネルのステップサイズは、ミクロゲル粒子のサイズに影響を与えるため、デバイス製造中に最適化する必要があることに注意することが重要です。
マイクロ流体によるミクロゲル生成の流量は、ゲル化時間、所望の粒子サイズ、マイクロ流体デバイス設計などの要因に基づいて、ゲル製剤ごとに最適化する必要があります。ハイスループットデバイスを使用する場合、水相の流量は5 mL/hまで高くなることがあります。 図4B は、このプロトコルで使用されるハイスループットデバイスのセットアップを示しています。デバイスが正しく動作している場合、ミクロゲルの形成は 図4Dに示すものと類似しているはずです。精製前に、ミクロゲルは不透明になります。さまざまなオイル、PBS、およびヘキサン洗浄を完了した後、ゲルは 図5の代表画像のように鮮明に見えるはずです。蛍光色素分子をミクロゲルに組み込む場合、精製物はわずかに着色された色合いを有するかもしれないが、依然として半透明に近いはずである。精製および膨潤後、ミクロゲルのサイズは非常に均一で、 図 6 に示すように 1.00 ~ 1.05 の PDI を持つ必要があります。種々の光開始剤が、MAP足場のフォトアニールに使用され得る。本明細書に記載されるLAPの代替物を使用する場合、先に記載したようにアニーリング動力学を決定しなければならない14。さらに、光源が光開始剤と対応する限り、様々な光源をフォトアニーリングに用いてもよい。光源を校正して焦点を合わせる必要があります。アニーリング時間および光強度は、ゲル製剤および光開始剤濃度に基づいて最適化される必要があるかもしれない。このプロトコールで概説されているアニーリング方法は、 インビトロ および インビボ研究に 使用することができる。アニーリング後、ミクロゲルは、2光子顕微鏡で可視化できる多孔質足場を形成する(図7B−C)。

このプロトコルは、様々な再生医療用途に使用することができる微多孔性アニール粒子足場のためのミクロゲルビルディングブロックを合成するための一連の方法を記載している。

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

微多孔性アニール粒子足場用の単分散ミクロゲルビルディングブロックのハイスループット製造は、足場の多孔性の制御を強化します。これは、細孔サイズとその後の組織統合の結果に影響を与える可能性があります。このプロトコルは、ハイスループットマイクロ流体アプローチを使用して、フローフォーカシングマイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレーなどの他の方法では達成できない大量の単分散ミクロゲルを生成します。生成されたミクロゲルは、迅速な組織と成長を可能にする細胞スケールの多孔性により、再生医療用途に有利な微多孔性アニール粒子足場に形成することができます。まず、PDMSマイクロ流体デバイスごとに1枚のスライドガラスを準備します。テープ、ろ過された空気、またはイソプロピルアルコール洗浄を使用して、スライドからほこりを取り除きます。PDMSデバイスのデザインスライドにスライドガラスを96ウェルプレートの蓋の上に並べて置き、プラズマクリーナーに入れます。ドアとエアフローバルブを閉じ、真空ポンプをオンにします。少なくとも30秒間実行してから、オフにします。酸素タンクガスチューブをエアフローバルブに接続します。プラズマチャンバーを30秒間酸素で満たしてから、酸素をオフにして気流バルブを閉じます。真空ポンプをオンにし、無線周波数レベルを高に設定します。チャンバーが紫色に変わるまで待ち、30秒が経過します。タイマーが鳴ったら、プラズマと真空をオフにしてから、エアフローバルブをゆっくりと開いて真空を解放します。プラズマクリーナーからトレイを取り外します。PDMSデバイスをスライドガラスにそっと裏返して接着します。ボンディングが発生すると、PDMSの透明度のわずかな違いが観察されます。最良の結果を得るには、ボンディングされたデバイスを使用する直前まで摂氏60度で保管してください。PFOCTSとNovecオイルを希釈して表面処理を準備し、3〜4台のデバイスに1ミリリットルを使用します。容量を1ミリリットルのシリンジに移し、25ゲージの針を取り付けます。デバイスごとに10〜12センチメートルのタイゴンチューブを切り取ります。長さ約1インチのPEEKチューブを切り取ります。数ミリメートルのPEEKチューブをタイゴンチューブの端に挿入して、針がタイゴンチューブの入口に穴を開けないようにします。加熱チャンバーからデバイスを取り出し、タイゴンチューブの非PEEK端を水性入口穴に挿入します。表面処理シリンジの針をPEEKチューブに挿入し、オイルチャンバーの出口穴を覆います。トリートメントをゆっくりと注入し、気泡なしでデバイスを満たすことを確認します。最初に水性チャンバーが充填され、次に小さなチャネル、次にオイルチャンバーが充填されるのを待ちます。デバイスからタイゴンチューブを取り外します。デバイスがいっぱいになったら、室温で10分間休ませます。5ミリリットルの注射器にオイルのみを入れ、25ゲージの針を取り付けます。入口と出口からデバイスから表面処理を吸引します。タイゴンチューブを水性入口に挿入します。オイルを入れたシリンジをPEEKチューブに挿入し、各デバイスをオイルで洗い流します。デバイスからオイルを吸引します。オイルフラッシュを2回繰り返し、タイゴンチューブを取り外します。タイゴンチューブの非PEEK端をマイクロ流体デバイスの入口に挿入します。端にPEEKチューブがないタイゴンチューブの残りの部分をマイクロ流体デバイスの出口に挿入します。5ミリリットルのプラスチックシリンジに少なくとも3ミリリットルのオイルを加え、25ゲージの針に取り付けます。タイゴンインレットの1つにあるPEEKチューブに針を慎重に挿入します。チューブとデバイスをオイルで静かに洗い流します。円錐形のチューブの出口からオイルを集めます。もう一方のタイゴンインレットでオイルフラッシュを繰り返します。シリンジポンプを希望の流量に設定します。界面活性剤を含むシリンジを25ゲージの針を介してオイルインレットに接続し、マイクロ流体デバイスのチューブとオイルチャネルをプライミングするのに十分なオイルを静かに分配します。デバイスとオイルインレットをセットアップしたら、ゲル前駆体を含む新しい5ミリリットルのシリンジに0.5ミリリットルのオイルを追加します。この少量のオイルを使用して、マイクロ流体デバイスを通して前駆体溶液を洗い流すのに役立ちます。円錐管に、1.5ミリリットルのPEG骨格溶液と1.5ミリリットルの架橋剤溶液を混ぜ合わせます。30秒間ボルテックスし、組み合わせたゲル前駆体溶液を5ミリリットルのシリンジに素早く移します。ゲル前駆体溶液を含むシリンジを25ゲージの針を介して水性入口に接続します。チューブと水性チャネルをプライミングするのに十分な溶液を静かに分配します。シリンジをシリンジポンプにクランプし、実行を押します。チャネルから均一なサイズの粒子を探します。ミクロゲルをコニカルチューブの出口から集める。ゲル化が完了したら、ピペットを使用してチューブの底から油相を慎重に取り除きます。これをフッ素化廃棄物用の適切な廃棄物容器に入れます。マイクロゲル収集チューブにオイルを追加します。収集チューブを静かに反転させて混合します。収集チューブを5分間沈降させて、相を分離させます。下部の油相と上部の水性ミクロゲル相を探します。オイル洗浄を少なくとも2回以上繰り返します。前に示したように、ゲルにオイルを追加してから、PBSをゲルに追加します。反転して数回混ぜます。層を分離するには、チューブを2, 000 RCFで約30秒間遠心分離します。チューブの下部にある油相、中央にゲル、上部にPBSを探します。ピペットで油相を取り除き、廃棄物容器に捨てます。オイルとPBS洗浄を2回繰り返します。最終洗浄までに不透明から透明に移行するゲルを探します。すべてのオイルを取り除きます。円錐管からPBSを取り外さないでください。化学ヒュームフードで、ガラスピペットを使用して、PBSに等しい容量でヘキサンをチューブに追加します。円錐管を30秒間、または完全に混合するまで渦巻きます。4, 696 RCFで5分間遠心分離します。分離後、最上層にヘキサン、中央にPBS、最下層にゲルを探します。ヘキサン層を取り除き、有機廃棄物用の容器に捨てます。PBSを吸引します。PBS洗浄でヘキサンを少なくとも2回、またはゲルがほぼ半透明になるまで繰り返します。ゲルをもう一度PBSで洗浄して、残っているヘキサン残留物を取り除きます。4, 696 RCFで5分間遠心分離し、PBS層を吸引します。20キロダルトンのPEGマレイミドの約67〜75%がメタクリルアミド官能基で修飾され、高いアニーリング効率を確保した。修飾率は、1H NMRスペクトルピークを分析することによって決定した。ゲル化の開始は、マイクロ流体ミクロゲル生成の持続時間に関する洞察を提供しました。30分から2時間の間にゲル化を開始できるゲル前駆体pHを選択することをお勧めします。精製および膨潤後、ミクロゲルは、単分散集団として定義される1.00〜1.02の間の均一なサイズおよび多分散指数を有した。アニーリング後、ミクロゲルは、2光子顕微鏡で可視化された多孔質足場を形成した。PDMSデバイスをスライドガラスに正しく接着し、デバイスを正しく表面処理することは、マイクロ流体デバイスに最適な性能を発揮するために重要です。この技術により、均一なミクロゲルビルディングブロックを迅速に製造してマップ足場を形成し、創傷治癒を含むさまざまなin vivo再生アプリケーションに使用できます。

microfluidic-synthesis-microgel-building-blocks-for-microporous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

私たちは、過飽和NIPAAmモノマー溶液の相分離に基づいて明確に区画化された構造を持つ、完全に同じ基材であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)で構成されるヤヌスマイクロハイドロゲルを合成するためのプロトコルを提示します。合成されたヤヌスマイクロヒドロゲルは、異方性熱応答性、有機親和性/親水性ローディング能力などのユニークな特性を示します。...

ポリの合成（<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide）異方性熱応答性および有機性/親水性ローディング機能のためのヤヌスMicrohydrogels

ポリジメチルシロキサン(PDMS)の2つのマイクロチャネル間にナノ流体接合を作成するためのシリカコロイドナノ粒子の簡単な自己組織化技術を提案します。この技術を使用して、細孔径が~45...

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

ここでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られた二重層マイクロ流体システムの製造と操作について説明します。このデバイスのトラップ、結晶性分子材料の配位経路の誘導、およびオンチップトラップ構造への化学反応の制御の可能性を実証します。...

マイクロ流体空気圧ケージ：インチップクリスタルトラッピング、操作のための新しいアプローチと管理化学治療

分解性感温ハイドロゲル ヒドラゾン架橋高分子オリゴマー バルク スケール、マイクロ スケール、およびナノスケール、ゲル粒子・...

自己組織化反応押出、マイクロフルイディクス, 経由で複数の長さスケールでの分解性感温ハイドロゲルを加工・ エレクトロスピニング

ハイドロゲルを用いたマイクロ磁気応答性の高いコンポーネントとの容易な迅速な製造のための製造技術の添加剤

油中水滴アッセイは、分析化学、酵素進化、単一細胞分析に有用であるが、通常は液滴を形成するためにマイクロ流体が必要である。ここでは、液滴アッセイを行うマイクロ流体フリーアプローチである粒子鋳型乳化について述べている。...

粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

この研究は、押出断片化を伴うミクロゲルを製造し、ミクロゲルを注射可能な顆粒状ヒドロゲルに加工し、顆粒状ヒドロゲルを生物医学的用途のための押出印刷インクとして適用するための、簡単で適応性のある低コストの方法を記述している。...

バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工

相補的な反応性基を有するミクロゲルロッドは、水溶液中で相互連結する能力を有するマイクロフルイディクスを介して製造される。異方性ミクロゲルは、球形ベースのシステムと比較して、より大きな細孔を有する安定した構築物に詰まりそして相互連結する。GRGDS-PCで修飾されたミクロゲルは、細胞培養に使用できるマクロポーラス3Dコンストラクトを形成します。...

ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場

粒状足場内の粒子画分のばらつきを最小限に抑えることで、再現性のある実験が容易になります。この研究では、 in vitro...

3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

本プロトコルは、高解像度顕微鏡イメージングと同時圧力差測定を組み合わせることにより、...

多孔質媒体中のバイオクラッシングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

この記事では、マイクロ流体デバイスを使用したハイスループットゼラチンメタクリロイルミクロゲル製造、ミクロゲルの再懸濁可能な粉末(マイクロエアロゲル)への変換、粒状ヒドロゲル足場を形成するためのミクロゲルの化学集合、および3Dバイオプリンティング用のマイクロ多孔性が保存された粒状ヒドロゲルバイオインクの開発のプロトコルについて説明します。...

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

学ぼう マイクロ流体法によるミクロゲルビルディングブロックの高通量合成を用いた再生医療用足場の作製法。単分散粒子の均一サイズ制御と組織統合性向上の手法を解説します。

微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成

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