Name: CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学ぶ CRISPR-Cas9を用いたゼブラフィッシュの正確なノックイン編集手法。YFPレポーターによる視覚的検出と心電図表現型解析により、Long QT症候群の遺伝的変異をモデル化し、創薬研究への応用可能性を示す。

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この研究は、カナダ衛生研究所研究プロジェクト助成金(TWC)およびカナダ自然科学工学研究評議会ディスカバリー助成金(TWC)の支援を受けました。

<ol><li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+methods+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Genome editing methods in animal models.</a> Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+genome+editing+technology+in+animal+disease+modeling+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+data%3A+Zebrafish+as+a+model+for+cardiovascular+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kegel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+using+zebrafish+to+identify+new+genes+involved+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Oligodendrocytes%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination.</a> Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>González-Rosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+cardiac+disease%3A+From+fortuitous+mutants+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine.</a> Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).</li>
<li>Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+editing+of+the+Zebrafish+genome+made+simple+and+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient.</a> Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).</li>
<li>Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+CRISPR%2FCas9-based+knock-in+approaches+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish.</a> Methods. 121-122, 77-85 (2017).</li>
<li>Armstrong, G. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+directed+knockin+of+point+mutations+in+the+zebrafish+tardbp+and+fus+genes+in+ALS+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+modification+by+a+long+ssDNA+template+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish.</a> BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+zebrafish+models+for+inherited+disorders+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).</li>
<li>Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+zebrafish+knock-in+reporter+lines+in+the+nefma+gene+by+Cas9-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination.</a> Genesis. 58 (1), 23340(2020).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
<li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels. 10 (2), 101-110 (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+3.+E.15%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+1%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+KCNH2+gene+mutations+of+type+2+long+QT+syndrome+in+larval+zebrafish+using+microscopy+and+electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography.</a> Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).</li>
<li>Dhillon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+embryonic+and+larval+ECG+measurement+in+zebrafish+for+quantifying+the+effect+of+QT+prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs.</a> PLoS One. 8 (4), 60552(2013).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+cardiac+conduction+phenotypes+in+developing+zebrafish+larvae%3A+Implications+to+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity.</a> Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).</li>
<li>Hurst, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+optimization+of+tools+for+embryonic+electrocardiograph+recording+for+heart+dysfunction+in+zebrafish%22">Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish</a>. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).</li>
<li>Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+express+an+orthologue+of+HERG+and+are+sensitive+toward+a+range+of+QT-prolonging+drugs+inducing+severe+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).</li>
<li>MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%3A+In+vivo+screening+in+the+zebrafish+to+overcome+complexity+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

CRISPR-Cas9を使用した正確な遺伝子編集のエンジニアリングは、HDRメカニズムの効率の低さと効率的な検出によって課題となっています。ここでは、CRISPR-Cas9ベースの2sgRNAエクソン置換アプローチについて説明し、ポジティブ編集の簡単な視覚的検出によりゼブラフィッシュで正確な編集を生成します。このアプローチの有効性は、 zkcnh6a 遺伝子の正確な編集を生成することによって実証されます。この論文は、遺伝子編集ゼブラフィッシュ幼虫の心機能を、心拍数、心膜寸法、およびECG形態の非侵襲的表現型測定を使用してどのように評価できるかを示しています。遺伝子編集の導入から表現型評価まで、このアプローチは、開始から終了まで約1週間で完了することができます。
上記の編集および表現型アプローチの利点は、CRISPR修飾設計の容易さ、複数の生理学的システムへの幅広い適用性、大きな遺伝子または遺伝子断片を挿入する能力、および発生および世代を通じてバリアント効果を縦断的に追跡できることです。このアプローチでの正確な編集の成功は、ゼブラフィッシュ<sup class="x...

動物モデルにおけるCRISPRベースの遺伝子編集戦略により、遺伝性疾患、発生、および毒物学を生物全体レベルで研究することができます1,2,3。ゼブラフィッシュは、マウスやヒト由来の細胞モデルよりも多くの生理学的側面でヒトに近い強力なモデルを提供します4。ゼブラフィッシュでは、フォワード5とリバースの両方の遺伝子スクリーニング6に、さまざまな遺伝的ツールと戦略が使用されてきました。ゼブラフィッシュの包括的な遺伝子マッピングとアノテーションは、標的遺伝子ノックアウト(KO)と精密ノックイン(KI)を設計するための主要な技術として、遺伝子編集アプローチを促進しました7。
それにもかかわらず、ゼブラフィッシュで正確なKI編集を生成することは、効率が低く、正確な検出が難しいために制限されています。転写因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)はKI8にうまく使用され最適化されていますが、CRISPRはより単純なsgRNAターゲティングで改善された遺伝子編集戦略を提供します。多くの研究がCRISPRを使用してゼブラフィッシュ9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20で正確なKIを生成していますが、CRISPRを介した相同性指向修復(HDR)によって生成されたこれらの編集は非効率的であり、本質的な成功率が低い傾向があります。一次スクリーニングとしてジェノタイピングを必要とする率9、10、14、21。これは、ゼブラフィッシュにおける効率的なKI CRISPRシステムと、正確な編集を検出するための信頼性の高いハイスループットシステムの必要性を示しています。
この研究の目的は、ゼブラフィッシュの心臓で正確な心臓遺伝子KIを生成するためのプラットフォームを記述し、成功した編集を簡単かつハイスループットに検出することでした。TALENアプローチ8に基づくCRISPR-Cas9ベースの2sgRNAエクソン置換アプローチが記載されている。このアプローチでは、2つのsgRNAガイドを使用して標的配列を切除し、目的のKIと遺伝的にコードされたイントロニックレポーター遺伝子を含む外因性のテンプレート配列で置き換えます(図1)。標的遺伝子のイントロニック配列内に遺伝的にコードされた蛍光レポーターを統合することで、ポジティブ編集の効率的な検出が可能になります。次に、ゼブラフィッシュ幼虫の心臓電気機能を評価するための表現型プラットフォームが説明され、遺伝性LQTS(個人を心臓突然死にかかりやすくする心臓電気障害)に関連する遺伝子変異の非侵襲的特徴付けが行われます。
これらのアプローチは、遺伝性疾患をモデル化し、遺伝子発現パターンのマッピングや発生制御などの生物学的および生理学的問題に対処するためのゼブラフィッシュKI遺伝子編集へのアクセスと使用を強化します。ゼブラフィッシュの心臓は、マウスモデルよりもヒトの心臓電気生理学的特性とよく平行しているので、心臓病モデリングのための遺伝的に扱いやすいシステムとして特に魅力的かもしれません7、22、23。

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>European Bioinformatics Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New EnglandBiolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 カメラ</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5415C</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA ゲル抽出キット</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 インキュベーター</td><td>バーンステッド ラボライン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep キット</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 分光光度計</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A ピコインジェクター</td><td>ハーバード製装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 基本電源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT 電気泳動システム</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec ゼブラフィッシュハウジングシステム</td><td>技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Synthesis</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta;コンピテントセル</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR バッファー</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM ヌクレオチド混合物</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI エンドヌクレアーゼ バッファー付き</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI エンドヌクレアーゼ バッファー付き</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 プラスミド (XL1 ブルー バクテリア寒天 スタブ)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI エンドヌクレアーゼ 緩衝液付き</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ HindIII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エンドヌクレアーゼ 緩衝液付き</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 プラスミド (XL1 ブルー)細菌寒天スタブ)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (トリカイン)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 プラスミド (DH5&α; 細菌寒天スタブ)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI エンドヌクレアーゼ w/ バッファー</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI エンドヌクレアーゼ w/ バッファー</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 リガーゼw/バッファー</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq ポリメラーゼ</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEバッファー</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 塩酸塩</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoIエンドヌクレアーゼ w/バッファー</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>コンポーネント</td><td>サプライヤー</td><td></td></tr><tr><td>アニーリングバッファー (pH 7.5-8.0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 培地 (pH 7.2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mMMgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>注入バッファー (pH 7.5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

動物モデルにおけるクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)は、生理学的現象の研究のための正確な遺伝子操作を可能にします。ゼブラフィッシュは、遺伝性疾患、発生、および毒物学に関連する多くの質問を臓器および生物レベルで研究するための効果的な遺伝子モデルとして使用されてきました。よく注釈されマッピングされたゼブラフィッシュゲノムのために、遺伝子編集のための多数のツールが開発されてきた。ただし、CRISPRを使用して正確なノックイン編集を生成することの有効性と検出の容易さは制限要因です。ここでは、心臓の再分極に関与し、電気障害であるQT延長症候群(LQTS)に関連する遺伝子の正確な編集を簡単に検出するCRISPR-Cas9ベースのノックインアプローチについて説明します。この2つのシングルガイドRNA(sgRNA)アプローチは、標的配列を切除して置換し、遺伝的にコードされたレポーター遺伝子を結合します。このアプローチの有用性は、野生型および遺伝子編集ゼブラフィッシュ幼虫における心臓電気機能の非侵襲的表現型測定を記述することによって実証される。このアプローチにより、生物全体の疾患関連変異の効率的な研究が可能になります。さらに、この戦略は、レポーター遺伝子、オルソログ、遺伝子エディターなどの選択した外因性配列を挿入する可能性を提供します。

この2sgRNAエクソン置換CRISPRアプローチの使用の成功は、ゼブラフィッシュの zkcnh6a 遺伝子におけるLQTS関連変異体R56Qを改変するための正確な編集の導入と簡単な検出によって強調されています。 図6 は、上記のようなCRISPR成分を1細胞胚期に注入した代表的な3dpf幼虫を示す。 図6A は、鋳型統合に成功した陽性レポーターとしての眼レンズにおけるYFP mVenusレポーター遺伝子発現の存在を示す。 図6B、C は、野生型およびレポーター遺伝子陽性魚のテールクリップサンプルから単離されたゲノムDNAから得られたサンガーシーケンシングクロマトグラムをそれぞれ示す。レポーター遺伝子陽性の魚は、R56Q変異体を zkcnh6aに導入する正確な編集GからAを持っていることがわかりました。ジェノタイピングは、YFPレポーター遺伝子発現と正確なR56Q遺伝子編集の存在との間に10...

このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

私たちのプロトコルは、CRISPR編集の正確な統合と簡単な視覚的検出の両方のためのパイプラインと、編集後の表現型の例を提供します。このアプローチの主な利点は、CRISPR編集の検出が容易であり、成功した編集を効率的かつ簡単に識別できることです。このアプローチにより、ゼブラフィッシュの疾患関連変異体の簡単な生成と特性評価が可能になります。ここでは、QT延長症候群について検討しています。その後、薬物療法に関する追跡調査を実施することができます。まず、目的の遺伝子のゼブラフィッシュオルソログを同定することにより、ノックインターゲットサイト配列を切除するための2つのsgRNAガイドを設計します。Ensemblを使用して、テンプレートの作成に使用される2キロ塩基の隣接配列を含む、目的の遺伝子配列内のターゲットサイトを特定します。CRISPORなどの設計ソフトウェアツールを使用して、ダニオレリオ種とCas酵素を選択します。2つのsgRNAアプローチでは、ターゲットエクソンの前に1つのsgRNAを選択し、すぐ下流のイントロン内に2番目のsgRNAを選択します。選択したsgRNAの特異性が高く、予測されるオフターゲット結合が低いことを確認してください。CRISPOR ランキングを使用して、オフターゲットバインディングを最小限に抑えたガイドを特定します。次に、PCRベースのサンガーシーケンシングジェノタイピングの最も可能性の高いオフターゲットサイトを特定します。2つのsgRNAを選択した後、それぞれについて逆相補体、変異に先行する2つの相補的オリゴ、および変異の下流にある2つの相補的オリゴを得る。各オリゴに互換性のある制限部位を追加して、選択したプラスミドにガイドを組み込みます。選択したガイド配列をDR274プラスミドに統合するには、5つのプライムBSA1制限部位を使用してオーバーハングを作成し、ガイドの5つのプライムエンドでBSA1認識サイトを設計します。次に、PKHR5プラスミドに収容されたM静脈YFPレポーター遺伝子に隣接する2つの配列断片を選択することにより、ゼブラフィッシュにおけるHDRの外因性テンプレートを設計します。テンプレートを2つのセグメントに分割して、M静脈YFPレポーター遺伝子の両側に挿入します。コーディングシーケンスが切断されないように、分割サイトがイントロン内にあることを確認してください。原稿に記載されているすべての必要な修飾を組み込んで、PKHR5プラスミドへのクローニングを容易にします。受精後約40分で1細胞期に胚を注入します。3日間の受精後、ゼブラフィッシュの幼虫を0.3%MS222を含む25ミリメートルのペトリ皿に移し、自己回復反射を失うまで麻酔をかけます。麻酔をかけたら、幼虫を24ウェルプレートのウェルに移します。GFPまたはYFPを検出できる顕微鏡を用いて、幼虫の眼におけるレポーター遺伝子蛍光についてスクリーニングする。幼虫の画像を撮影した後、レポーター遺伝子発現の有無を文書化する。正確で正確なHDR遺伝子編集を確認するには、前述のように受精後3日目に幼虫に麻酔をかけ、ホットショット法を使用してテールクリップからゲノムDNAを分離することにより、ジェノタイピングを実行します。切除したテールクリップを15マイクロリットルの25ミリモル水酸化ナトリウムに加え、摂氏95度で20分間インキュベートし、次に1.5マイクロリットルのトリス塩酸で中和します。13, 800倍Gで30秒間遠心分離し、抽出したゲノムDNAを含む上清を保持する。E3培地で幼虫を回収し、さらなる研究が意図されている場合はそれを住宅システムに戻す。抽出したゲノムDNAを鋳型として使用して、オンターゲット部位とオフターゲット部位のPCRベースのサンガーシーケンシングを実行します。オンターゲットプライマーデザインが変異部位と最も近いsgRNA結合部位を捕捉していることを確認します。挿入された相同性アームと標的遺伝子からの移行を検出するための別のシーケンシングプライマーを設計し、目的の遺伝子への組み込みを確認する。プライマーを設計して、上位3つの潜在的なオフターゲット部位を配列決定します。オンターゲットおよびオフターゲットのジェノタイピング、心拍数、心膜寸法、ECG表現型、および各ゼブラフィッシュについて識別可能なレポーター遺伝子データをコンパイルします。YFP M静脈レポーター遺伝子発現が島で観察され、テンプレート統合の成功のポジティブレポーターとして機能しました。レポーター遺伝子陽性魚は、R56Q変異体をZKCNH6Aに導入する正確な編集G2Aを有することが判明した。眼面積の比率としての心膜寸法の測定がここに示されている。ゼブラフィッシュの心臓再分極障害に関連する心膜浮腫の増加を伴う徐脈の傾向は、R56Q遺伝子編集幼虫で観察されました。受精後3日目のゼブラフィッシュ幼虫の心臓からのECG記録がここに示されています。このアプローチの最も重要な側面は、CRISPR手順でよくあるように、ガイド設計です。効果的なガイドは、CRISPR編集を成功させるために不可欠です。代替のCRISPRメソッドに従うことができ、より高い精度やその他の機能が可能になります。さらに、in vivo誘導編集システムを提供するプライム編集複合体などの大きな遺伝子を挿入することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

CRISPR/Cas9 システムを用いたチャネル ナマズ胚の遺伝子を編集するための簡単かつ効率的なマイクロインジェクション プロトコルが表示されます。このプロトコルでは Rna、ガイドし、Cas9 蛋白質は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。このプロトコルは、2 つのチャネル...

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノムノックアウト電気魚を製造し、後部するためのプロトコルが提示される。詳細に概説するのは、ジムノチフォームとモルミリドの両方に必要な分子生物学、繁殖、および夫の要件、およびCas9誘発インデルF0幼虫を産生するための注射技術である。...

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。...

母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

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zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

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ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

学ぶ CRISPR-Cas9を用いたゼブラフィッシュの正確なノックイン編集手法。YFPレポーターによる視覚的検出と心電図表現型解析により、Long QT症候群の遺伝的変異をモデル化し、創薬研究への応用可能性を示す。

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

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