Name: 根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶルシファーイエローを用いた根尖腸管モデルでの腸透過性評価法。壊死性腸炎などの炎症性腸疾患のメカニズム解明に有用な定量的・定性的解析技術です。

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ロチェスター大学医療センターのアシュリーネルソンが腸内モデルに役立ったことに感謝します。また、オクラホマ大学の小児外科部門にも、このプロジェクトを支援してくださったことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所[NIHグラントR03 DK117216-01A1]、オクラホマ成人幹細胞研究センター、および長老派健康財団助成金#20180587によってオクラホマ大学健康科学センターの外科に授与されました。

本研究は、オクラホマ大学の治験審査委員会の承認(IRB、#11610、11611)に準拠して実施されました。IRB仕様に従って人間の手術検体を収集する前に、保護者の同意が必要でした。IRBの承認と親の同意に続いて、ヒト小腸組織は、NECまたはストーマ切除や閉鎖修復などの他の腸切除の手術を受けている乳児(サンプル収集時に36〜41週の範囲の矯正妊娠期間(GA)であり、すべて推定GA25〜34週、2:1 M:Fの早産の病歴がある)から取得されました。エンテロイドは、空腸または回腸のいずれかから得られた組織から生成した。
1.ヒト乳児由来の腸管培養:全組織からの陰窩分離とメッキ
<ol><li>前回の報告4に続いて、培養培地、キレートバッファー#1、およびキレートバッファー#2(表1)を準備します。キレートバッファーは4°Cで保存し、48時間以内に使用します。</li>
	<li>ヒトミニガット培地を準備します(表1)。使用前にストックを-20°Cで保管し、37°Cの水浴で温めてください。</li>
	<li>50%L-WRNコンディショニング培地(CM)を準備します(表1)。ストックを4°Cで最大1週間保管します。 注:馴化培地の100%L-WRN塩基は、Miyoshiらによるプロトコルに記載されています12。</li>
	<li>前回の報告4に続く手術標本から得られた小腸組織サンプルからエンテロイドを作製する。腸組織0.75〜2.5g片から24ウェルプレートにエンテロイドの4ウェルをプレート化する。 注:エンテロイドは、30 mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地に50 mLのコニカルチューブで4°Cで最大48時間保存した組織から正常に生成できます。</li>
	<li>24ウェルプレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに逆さまに15〜20分間入れて、BMMドーム4の重合を可能にします。</li>
	<li>500 μLの50%L-WRN CM(ステップ1.3に記載)と0.5 μLのY-27632、ROCK阻害剤(RI、 材料の表を参照)を各ウェルに追加します。2〜3日後、RIを含まない50%L-WRN CMと交換します。</li>
</ol>2. AOエンテロイドの創製
<ol><li>BMMに埋め込まれたエンテロイドを50%L-WRNCM 4で7〜10日間成長させます。</li>
	<li>培地を取り出し、500 μLの細胞回収溶液(CRS、 材料表を参照)を1つのウェルに加えます。ドームをこすり、ピペットで上下に数回動かしてから、CRS /エンテロイド/ BMM溶液を次のウェルに追加します。</li>
	<li>ドームをこすり、ピペットで上下に数回動かし、溶液をマイクロ遠心チューブに入れます。500 μLのCRSを2番目のウェルに加え、ピペットで上下に動かしてから、最初のウェルに追加します。この溶液を同じ1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>手順2.3を繰り返し、すべてのウェル内容物がCRSになるまで、2つのウェルを1つの微量遠心チューブにプールします。 注:大量のAOエンテロイドを生成する場合は、2つ以上のウェルを1つの大きな15 mLコニカルチューブにプールできます。ウェルあたり500 μLのCRS比を維持することは、BMMの完全な可溶化を確実にするために重要です。</li>
	<li>プールされたCRS /エンテロイド/ BMM溶液を含む微量遠心チューブ(ステップ2.3)をローテーターに4°Cで1時間置き、BMMを可溶化します。</li>
	<li>溶液を200 x g で4°Cで3分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去し、ペレットを残します。</li>
	<li>腸管ペレットをマイクロ遠心チューブあたり1 mLの50%L-WRN CM(ステップ1.3で調製)に再懸濁します。.再懸濁したエンテロイド/培地溶液500 μLを、超低接着24ウェル組織培養プレートの各ウェルに静かにピペットで移します(材料の表を参照)。</li>
	<li>実験の前に、5%CO2 で37°Cで3日間インキュベートします。</li>
</ol>3. ホールマウント免疫蛍光染色 による AO腸状立体構造の検証
<ol><li>培地懸濁液中のエンテロイドを3日間インキュベートした後、エンテロイド/培地懸濁液を1つのウェルからマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。</li>
	<li>エンテロイド/培地懸濁液を200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 マイクロピペットで上清を除去します。</li>
	<li>エンテロイドを20 μLのBMMに再懸濁します。10 μLの腸内懸濁液を顕微鏡スライド上にピペットで移し、約1 cm x 1 cm角の薄層に広げます。残りの10 μLの腸内懸濁液を同じスライドの別の部分に繰り返して、エンテロイド/ BMM懸濁液の塗抹標本が2つあるようにします。</li>
	<li>エンテロイド/ BMM塗抹標本を室温(RT)で15分間固化させます。</li>
	<li>ヒュームフード内で作業し、スライドを染色ジャーに入れ、エンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで4%パラホルムアルデヒドを充填します(スライド容量10のガラス染色ジャーを使用する場合は、1スライドで~30 mL)。固定が行われるまで30分(室温)待ちます。 注意: 4%パラホルムアルデヒドは危険であり、目の損傷/刺激、皮膚の炎症、および癌を引き起こす可能性があります。使用するときは、常にヒュームフードの下で作業してください。取り扱うときは、保護手袋と個人用保護具を着用してください。承認された廃棄物処理容器に廃棄してください。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒドを適切な廃棄物容器に捨ててください。30 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を染色ジャーに加えるか、PBSがエンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで加えます。RTで3分間放置してから、PBSをパラホルムアルデヒド廃棄物ボトルに廃棄します。この手順をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。</li>
	<li>新しい染色ジャーに、PBSで希釈した0.5%トリトンX-10030 mLを入れます。エンテロイド/BMM塗抹標本を含むスライドをトリトン溶液に入れ、RTで20分間透過させます。</li>
	<li>PBSで希釈した0.5%トリトンX-100を廃棄します。30 mLのPBSを染色ジャーに加え、3分間放置します。デカントしてPBSを廃棄します。</li>
	<li>エンテロイド/ BMM塗抹標本の周りのスライドをそっと拭き、邪魔しないように注意してください。疎水性バリアペン(バリアPAPペン、 材料表を参照)を使用して、各エンテロイド/ BMM塗抹標本の周りに円を描きます。二次抗体を産生した動物に特異的な20%血清を作ります( 材料の表を参照)。</li>
	<li>顕微鏡スライドを実験台に平らに置きます。ステップ3.9の特定の20%血清100 μLを疎水性バリアペンで囲んだ各エンテロイド/BMM塗抹標本にピペッティングすることにより、4°Cで1時間スライドをブロックします。</li>
	<li>PBSで希釈したβ-カテニンおよびZO-1一次抗体のそれぞれ1:100および1:200希釈を含む100 μL溶液を調製します。 注:各一次抗体は、画像化されたときに異なる免疫蛍光チャネルを持つことを保証するために、異なる動物からのものでなければなりません。本研究では、マウスβ-カテニン抗体とウサギZO-1抗体を利用します( 資料表を参照)。</li>
	<li>カウンターのスライドをタップして20%の血清を取り除き、エンテロイド/ BMM塗抹標本を乱さないように注意しながら、そっと拭いて乾かします。100 μLのβ-カテニン/ZO-1一次抗体溶液をエンテロイド/BMM塗抹標本の1つにピペットで貼り付けます。一次抗体を含まないPBS100 μLを、ネガティブコントロールとして他のエンテロイド/BMM塗抹標本にピペットで移します。</li>
	<li>プラスチック容器の底を濡れたペーパータオルで裏打ちして、加湿容器を作ります。スライドを容器に入れ、エンテロイド/ BMM塗抹標本を覆う溶液を乱さないように注意します。密封する容器に蓋を置き、4°Cで一晩平らに保管します。 注意: スライドを乾かさないでください。乾燥を避けるために、容器が閉じていることを確認してください。</li>
	<li>続行する準備ができたら、カウンターのスライドをタップして、エンテロイド/ BMM塗抹標本から一次抗体とPBSを除去します。</li>
	<li>スライドを染色ジャーに入れ、30 mLのPBSを充填するか、PBSがエンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで洗浄ステップを実行します。室温で3分間放置します。PBSを廃棄し、この手順をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。</li>
	<li>2つの異なる免疫蛍光チャネルに対して200 μLの二次抗体を調製し、各抗体はPBSで1:1000に希釈します( 材料の表を参照)。溶液を光から遠ざけてください。</li>
	<li>100 μLの二次抗体溶液を各エンテロイド/BMM塗抹標本にピペットで貼り付けます。それを暗闇に置き、RTで1時間放置します。</li>
	<li>カウンターのスライドをタップして、二次抗体を除去します。手順3.15で概説した洗浄手順を繰り返し、すべての洗浄が暗闇で行われるようにします。</li>
	<li>4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI付きフルオロシールド、 材料表を参照)封入剤を各エンテロイド/ BMM塗抹標本に一滴加え、カバーガラスを塗布して、両方の塗抹標本が適切に覆われていることを確認します。カバーガラスの下に気泡を閉じ込めないでください。顕微鏡で見る準備ができるまで、スライドを暗所に置いてください。 注意: スライドをすぐにイメージングすると、最適な結果が得られます。ただし、スライドは4°Cの加湿容器に平らに保管し、DAPIの追加後最大1週間画像化することができます。</li>
</ol>4. NEC実験の導入
<ol><li>AOエンテロイドが使用前に少なくとも72時間懸濁されていることを確認してください。</li>
	<li>各ウェルからのすべてのエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。 注:大量のウェルを処理する場合は、複数のウェルを1つの15 mLコニカルチューブにプールできます。このプロトコルでは、治療グループごとに最低3つのウェルが推奨されます。</li>
	<li>300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>1ウェルあたり500 μLの50%LWRN CM(最終濃度100 μg/mL LPS)に5 mg/mLのリポ多糖(LPS、 材料表を参照)10 μLを加えます。</li>
	<li>治療群として指定されたAOエンテロイドを50%LWRN + LPSに再懸濁し、500 μLの懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートに分注します。未処理コントロールとして指定されたAOエンテロイドを、ウェルあたり500 μLの50%LWRN CMに再懸濁します。この懸濁液500 μLを別の24ウェル超低アポレーションプレートに分注します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、1%O 2、5%CO2、および94%N2を含むモジュラーインキュベーターチャンバー(MIC)を介して、LPS処理AOエンテロイドに低酸素症を誘発します(材料の表を参照)。エンテロイドを低酸素症とLPSで24時間治療します。</li>
	<li>未処理およびLPS+低酸素処理培養物を、まだMICチャンバー内に、37°C、5%CO2 インキュベーター中で24時間置く。</li>
</ol>5. LYを利用した傍細胞透過性の測定
<ol><li>各ウェルからエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。DPBSと50%LRWN CMを37°Cの水浴中で温めます。</li>
	<li>エンテロイド/培地懸濁液を300 x g でRTで3分間遠心分離します。</li>
	<li>メディアを取り出します。エンテロイドを温かい500 μL DPBSで洗浄します。</li>
	<li>300 x g でRTで3分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を取り除きます。</li>
	<li>手順5.3〜5.4をもう一度繰り返して、合計2回繰り返します。</li>
	<li>洗浄後、450 μLの温かい50%LWRN CMを追加します(ステップ1.3で調製)。</li>
	<li>50 μLの2.5 mg/mL LY(最終濃度は0.25 μg/μL、 材料表を参照)を各ウェルに加え、穏やかに旋回させて混合します。37°C、5%CO2 インキュベーターに2時間入れます。</li>
	<li>各ウェルからエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。</li>
	<li>300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を除去して腸内ペレットを残します。</li>
	<li>エンテロイドを500μLの温かいDPBSで洗浄します。</li>
	<li>300 x g でRTで3分間遠心分離し、腸内ペレットを残して上清を除去します。</li>
	<li>手順5.10〜5.11をさらに3回繰り返して、合計4回の洗浄を行います。</li>
	<li>各ペレットを1,000 μLのコールドDPBSで再懸濁し、激しくピペットで上下させてエンテロイドを解離させます。</li>
	<li>DPBSで希釈したLY標準曲線の標準物質を準備します(100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12.5 ng/mL; 6.25 ng/mL; 3.13 ng/mL; 1.57 ng/mL; 0 ng/mL)。</li>
	<li>各サンプル150 μLを96ウェルプレート上で3連で1ウェルあたりピペットします。</li>
	<li>蛍光を読み取ることができるプレートリーダーで428 nmの励起ピークと536 nmの発光ピークの蛍光を測定します( 材料の表を参照)。統計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、検量線を補間し、4パラメータ曲線を使用して濃度を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、この記事で説明されている製品または概念に対する所有権または商業的関心を報告していません。

腸透過性は複雑であり、上皮バリア機能を反映しています。腸管バリアは、経細胞および傍細胞輸送を媒介する上皮細胞の単層を含む14。傍細胞透過性は、上皮細胞14間の空間を封鎖するタイトジャンクションタンパク質に依存する。この傍細胞輸送には、分子が通過できる3つの異なる経路があります:細孔、漏れ、および無制限の15。細孔経路は小さな荷電イオンへの透過性を可能にし、リーク経路は15を超えるより大きな非荷電分子を可能にします。第3の無制限経路は、上皮損傷または死亡に続発する透過性を反映している16。傍細胞透過性を評価するために多くの分子が使用されますが、分子の種類とサイズは、調査される透過経路に影響します。
小さな親水性分子として、LYは3つの傍細胞経路すべてを通過できるため、傍細胞透過性の研究に最適なツールになります。対照的に、4 kDaのFITC-デキス...

エンテロイドは、臓器制限ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)構造である1,2。それらは完全に上皮系譜で構成されており、分化した腸上皮細胞タイプ2をすべて含んでいます。エンテロイドはまた、内部コンパートメントを形成する頂端管腔表面と周囲の媒体に面する基底外側表面からなる細胞極性を維持する。エンテロイドは、それらが生成された宿主の特性を保持するという点でユニークなモデルです3。したがって、未熟児のヒト乳児から生成されたエンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)など、主にこの集団に影響を与える疾患の調査に役立つモデルを表しています。
従来の腸管モデルは、基底外側(BO)コンフォメーションで成長し、腸管は基底膜マトリックス(BMM)のドームに包まれています。BMMは、基底外側表面が外側にある3D構造を維持するように腸管を誘導します。BOエンテロイドは、2次元(2D)初代ヒト細胞株とin vivo動物モデルの間のギャップを埋めるNECに適したモデルです2,4。NECは、LPSや細菌などの病原体をエンテロイド周囲の培地に入れ、続いて低酸素条件に曝露することによってエンテロイドに誘導されます2,3。BO腸内NECモデルの課題は、in vivoで頂端表面で発生する宿主と病原体の相互作用の効果的な研究を可能にしないことです。腸透過性の変化は、これらの宿主 - 病原体相互作用によるものである。透過性が疾患の病態生理学的根拠にどのように影響するかをよりよく理解するためには、頂端表面の治療を含むモデルを作成する必要があります。
Coらは、 成熟したBOエンテロイドがBMMドームを除去し、それらを培地5に再懸濁することによって頂端アウト(AO)コンフォメーションを形成するように誘導され得ることを最初に実証した。この記事は、AOエンテロイドが正しい上皮極性を維持し、すべての腸細胞タイプを含み、腸上皮バリアを支持し、頂端表面へのアクセスを可能にすることを実証しました5。AOエンテロイドをNECモデルとして使用することで、疾患プロセスの生理学的再現と宿主-病原体相互作用の研究を実現します。
NECの病態生理学への主要な寄与の1つは、腸透過性の増加です6。インビトロ7で腸透過性を試験する方法として、いくつかの分子が提案されている。これらのうち、ルシファーイエロー(LY)は、それぞれ428nmおよび540nmに励起および発光ピークを有する親水性色素である8。すべての主要な傍細胞経路を通過するため、血液脳および腸上皮バリアを含むさまざまなアプリケーションで傍細胞透過性を評価するために使用されてきました8,9。LYの伝統的な用途は、半透性表面10上で単層で増殖した細胞を使用する。LYは頂端表面に塗布され、傍細胞タイトジャンクションタンパク質を交差して基底外側に集まります。基底外側コンパートメントにおけるより高いLY濃度は、タイトジャンクションタンパク質の減少とそれに続く腸上皮細胞バリアの破壊および透過性の増加を示しています10。また、LYを培地に追加し、個々のエンテロイドを内腔11へのLYの取り込みのために画像化した3D BO腸内モデルでも説明されています。これにより、LY取り込みの可視化による定性分析は可能になりますが、定量分析は限られています。このプロトコルは、3D配向を維持しながら、AOエンテロイドのin vitroNEC腸内モデルを使用して傍細胞透過性を評価するためにLYを使用する独自の技術を概説します。この方法は、透過性の定性的および定量的分析の両方に使用できます。

<table><tbody><tr><td>[LEU] 15-ガストリン1</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>100&マイクロ;m 滅菌細胞ストレーナー</td><td>コーニング</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>100% LWRN コンディショニング培地</td><td>自社製 三好らに倣って 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル ブラック、クリアボトムプレート</td><td>グライナー バイオワン</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R&D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ二次抗体, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウス二次抗体, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15290026</td><td></td></tr>抗<tr><td>ゾヌラオクルーデンス-1ウサギ一次抗体, 1:200</td><td>細胞シグナル伝達</td> <td>#D6L1E</td><td></td></tr><tr><td>抗β-カテニンマウス一次抗体、1:100</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>#14-2567-82</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメントマイナスビタミンA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>バリアPAPペン</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>BMM(マトリゲル)</td><td>コーニング</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収ソリューション</td><td>コーニング</td><td>354270</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>GF144</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸酸性 (EDTA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>EVOS m7000 イメージングシステム</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ジェミニ バイオプロダクツ</td><td>100-525</td><td></td></tr><tr><td>フルオロシールド DAPI</td><td>ミリポアシグマ</td><td>F6057-20mL</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-750-060</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 9</td><td>ドットマティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖 (LPS)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ルシファーイエロー CH、リチウムソルト</td><td>Invitrogen</td><td>L453</td><td></td></tr><tr><td>モジュール式インキュベーターチャンバー</td><td>Billups Rothenberg, Inc.</td><td>MIC101</td><td></td></tr><tr><td>N-2サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵スイングバケット遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵卓上微量遠心機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 中型</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>ミリポア シグマ</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ リボルバー ローテーター</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>超低アタッチメント 24ウェル組織培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, ROCK 阻害剤 (RI)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

エンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)などの炎症性腸疾患の研究における新たな研究ツールです。それらは伝統的に、上皮細胞の頂端表面が内腔に面する基底外側外側(BO)立体配座で成長しています。このモデルでは、治療と実験のためにエンテロイドの管腔表面にアクセスすることは困難であり、宿主と病原体の相互作用を研究する能力が制限されています。これを回避するために、壊死性腸炎の新生児頂端アウト(AO)モデルが作成されました。腸管上皮細胞透過性の変化はNECにとって病的であるため、このプロトコルでは、細胞透過性のマーカーとしてルシファーイエロー(LY)を使用することを概説しています。LYは、3つの主要な傍細胞経路(孔、漏れ、および無制限) すべてを介して 腸上皮バリアを通過します。AOモデルでLYを使用すると、NECの透過性をより広く研究できます。IRBの承認と親の同意に続いて、腸組織の外科的サンプルがヒトの早産児から収集されました。腸幹細胞は陰窩分離 によって 採取され、エンテロイドの増殖に使用されました。エンテロイドは成熟するまで成長した後、AOを形質転換するか、BOコンフォメーションのままにしました。これらは、処理されていない(対照)か、リポ多糖(LPS)で処理され、 in vitro NECの誘導のために低酸素条件にかけられた。LYは透過性を評価するために使用されました。頂端タンパク質帯閉塞-1および基底外側タンパク質β-カテニンの免疫蛍光染色により、AO立体構造が確認された。LPSおよび低酸素で処理されたAOおよびBOエンテロイドは、対照と比較して有意に増加した傍細胞透過性を示した。AOエンテロイドとBOエンテロイドの両方が、対照と比較して、処理されたエンテロイドの内腔へのLYの取り込みの増加を示しました。AO腸様モデルにおけるLYの利用は、傍細胞透過性の3つの主要な経路すべての研究を可能にする。さらに、宿主と病原体の相互作用の調査と、これがBO腸介類モデルと比較して透過性にどのように影響するかを調べることができます。

AOコンフォメーション 50%LWRN培地に72時間懸濁したエンテロイドは、AOコンフォメーションを示します(図1)。これは、頂端タンパク質であるオクラヌラ-1(ZO-1)と基底外側タンパク質であるβ-カテニンの腸内全マウントを利用した免疫蛍光染色 によって 確認されました(図1)。AOエンテロイドは、エンテロイドの外側の頂端面にZO-1(緑)を示し、β-カテニン(赤色)は内側の基底外側表面にあります(図1A)。BOエンテロイドは、外面にβ-カテニン(赤)、内腔表面にZO-1(緑)という逆を示します(図1B)。これらの結果は、実験前にエンテロイドがAOであることを確認するために予想される極性反転を示しています。
LYアッセイ結果 NEC<sup cl...

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

ルシファーイエローを頂端エンテロイドの培地に適用することで、3Dモデルで3つの主要な傍細胞腸透過性経路すべてを定量的および定性的に分析するための簡単な方法が提供されます。これは比較的簡単な手法であり、腸内モデルを使用して透過性を評価することができます。私たちは壊死性腸炎の研究にこの技術を使用しています。しかしながら、この技術は、腸管モデルを利用して、あらゆるヒト腸疾患の研究において有用であり得る。今日の手順のデモンストレーションは、ポスドク研究員のタイラー・レイバ博士とアレナ・ゴルブコワ博士、そして私たちの研究室の研究助手であるカミーユ・シュレーゲルです。まず、BMMに埋め込まれたアンドロイドを、頂端またはAO腸管生成用の50%LWRN馴化培地で7〜10日間成長させます。BMMドームの周囲から培地を取り出し、500マイクロリットルの細胞回収溶液またはCRSを1つのウェルに追加します。ドームをこすり、上下に数回ピペットで動かして、BMMドームに埋め込まれたエンテロイドでCRSを均質化し、この溶液を次のウェルに追加します。繰り返しになりますが、ドームをこすり、ピペットで数回上下に動かしてから、溶液をマイクロ遠心チューブに移します。500マイクロリットルのCRSを2番目のウェルに加え、ピペットを上下に動かしてよく混合し、最初のウェルに移します。最初のウェルから、CRS腸内BMM溶液を同じ1.5ミリリットルの微量遠心チューブにプールし、すべてのウェルの内容物がCRSになるまで残りのウェルに対してこのプールを繰り返します。プールされたCRS溶液を含むマイクロ遠心チューブをローテーターに摂氏4度で1時間置きます。次に、上清を除去する前に、マイクロ遠心チューブを摂氏4度で200 X gで3分間遠心分離し、腸管ペレットを1ミリリットルの50%LWRN馴化培地に再懸濁します。再懸濁した腸管または培地溶液500マイクロリットルを超低付着24ウェル組織培養プレートの各ウェルに静かに移す。実験の前に、プレートを摂氏37度で5%CO2で3日間インキュベートします。使用前にAOエンテロイドが少なくとも72時間中断されていることを確認してください。培地に懸濁したすべてのエンテロイドを各ウェルからマイクロ遠心チューブに静かに移します。室温で300 X gで3分間遠心分離し、上清を除去します。リポ多糖1ミリリットルあたり5ミリグラムの10マイクロリットル、またはLPSをウェルあたり500マイクロリットルの50%LWRN馴化培地に加えてマスターミックスを調製し、治療群のAOエンテロイドペレットを500マイクロリットルのLPSと50%LWRN馴化培地に再懸濁します。ピペットを上下に動かして完全に混ぜます。500マイクロリットルの懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルに分注します。同様に、未処理対照群からのAOエンテロイドをウェル当たり500マイクロリットルの50%LWRN馴化培地に再懸濁し、この懸濁液500マイクロリットルを別個の24ウェル超低付着プレートの各ウェルに分注する。1%酸素、5%二酸化炭素、および94%窒素を備えたモジュラーインキュベーターチャンバーを使用してLPS処理AOエンテロイドに低酸素を誘発し、低酸素およびLPSで24時間インキュベートします。未処理およびLPSと低酸素処理の培養物を5%二酸化炭素インキュベーターに24時間入れます。ルシファーイエローまたはLYを使用して傍細胞透過性を測定するには、腸管または培地懸濁液を各ウェルから微量遠心チューブに静かに移します。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBS、および50%LWRN馴化培地を摂氏37度の水浴中で温めます。懸濁液を300 X gで室温で3分間遠心分離します。培地を取り出し、腸内ペレットを500マイクロリットルの温かいDPBSで洗浄してから、300 X gで3分間遠心分離します。マイクロピペットで上清を取り除き、DPBS洗浄ステップをもう一度繰り返します。DPBS洗浄後、450マイクロリットルの温かい50%LWRNコンディショニング培地を加え、懸濁液を24ウェルプレートに加えます。次に、各ウェルに50マイクロリットルの2.5ミリグラム/ミリリットルLYを追加します。プレートを穏やかに回転させて混合し、5%二酸化炭素インキュベーターに2時間置きます。各ウェルから腸管懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。それを遠心分離し、腸内ペレットを残して上清を取り除きます。500マイクロリットルの温かいDPBSを使用してペレットを洗浄し、遠心分離します。ペレットを残して上清を取り除きます。ペレットを1000マイクロリットルの冷たいDPBSで再懸濁する前に、DPBSの洗浄を3回繰り返し、ピペットを使用して激しく混合してエンテロイドを解離します。ルシファーイエローの検量線については、本文の説明に従ってDPBSで希釈した標準を準備します。各サンプル150マイクロリットルを96ウェルプレート上で3連で1ウェルにピペットする。蛍光プレートリーダーで428ナノメートルの励起ピークと536ナノメートルの発光ピークの蛍光を測定します。統計ソフトウェアと検量線を補間する4つのパラメータ曲線を使用して濃度を計算します。50%LWRN培地に懸濁したエンテロイドを72時間免疫蛍光染色したところ、エンテロイドの外側頂端表面にZo-1が見られ、基底外側表面にベータカテニンが見られました。これは、エンテロイドのAO立体配座を確認するエンテロイドの予想される極性反転を示した。LPSおよび低酸素で処理された基底外側アウト、またはBOエンテロイドは、未処理の対照と比較して、腸内腔へのLY色素の取り込みの増加によってルシファーイエローまたはLYアッセイで実証された有意な透過性の増加を示しました。Lucifer Yellowアッセイはまた、未処理の対照と比較して、処理されたAOエンテロイドの内腔におけるLYの取り込みの増加を示しました。LPSおよび低酸素で処理されたAOエンテロイドの透過性の増加を、未処理の対照と比較して確認した。腸内ペレットを徹底的に洗浄して、すべての管腔外LYを確実に除去することが重要です。これにより、透過性を計算する際に残っている管腔内LYを正確に定量化できます。定性分析のために、エンテロイドを蛍光顕微鏡で可視化し、内腔へのLY取り込みを行うことができます。LYインキュベーションとその後の洗浄ステップを経て、マイクロプレートの読み取りから解離します。

determining-intestinal-permeability-using-lucifer-yellow-an-apical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

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赤血球凝集は、抗体が赤血球に結合凝集の形式です。赤血球は、両方とも容易に入手可能であり、結果は容易に肉眼を使って観測している。このビデオでは、結果を解釈し、力価を決定する、赤血球凝集アッセイに必要な手順を示しています。...

赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

学ぶルシファーイエローを用いた根尖腸管モデルでの腸透過性評価法。壊死性腸炎などの炎症性腸疾患のメカニズム解明に有用な定量的・定性的解析技術です。

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

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