Name: がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ 内頸動脈注射によるマウス脳転移モデルの作成法。BT-474細胞を用いて再現性の高い脳腫瘍を誘導し、薬物分布と治療効果を客観的に評価する実験系を確立します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)、助成金番号APP1162560によって資金提供されました。MLは、UQ大学院研究奨学金によって資金提供されました。畜産と動物の 生体内 イメージングにご協力いただいた皆様に感謝いたします。この研究のためにジルコニウムのアリコートを寄付してくれたロイヤルブリスベンアンドウィメンズ病院に感謝します。

すべての研究は、クイーンズランド大学の動物倫理委員会(UQCCR/186/19)のガイドライン、および科学目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアのコードの範囲内で実施されました。
1.注射用癌細胞の調製
注:この研究では、ヒト乳がん細胞株BT-474(BT474)を使用しました。BT474を、10%ウシ胎児血清および1%インスリンを添加したRPMI 1640培地を含む完全増殖培地中で培養した。細胞を空気雰囲気中で5%二酸化炭素を用いて37°Cのインキュベーター内に維持した。サテライトタンデムリピート試験35により細胞株を認証し、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)の発現(例えば、ルシフェラーゼ)があれば確認し、マイコプラズマ感染の有無を調べる。
<ol><li>注射前に、10 mLの完全増殖培地および培養液(37°Cで5%CO2)を使用して、BT474癌細胞を2.0 x 106細胞の播種密度でT75フラスコに播種します。</li>
	<li>注射当日、増殖培地を廃棄し、細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄する。</li>
	<li>5 mLの予温した細胞培養解離試薬( 材料の表を参照)を加え、37°Cで5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。5分後、フラスコを軽くたたいて細胞の剥離を助けます。</li>
	<li>10%ウシ胎児血清を含む5 mLの完全増殖培地を添加して、解離試薬活性を消光します。</li>
	<li>ピペッティングによって細胞を穏やかに再懸濁し、細胞の塊を減らします。</li>
	<li>細胞懸濁液を50 mLチューブに移し、室温で180 x g で3分間遠心分離します。</li>
	<li>上清をデカントし、細胞ペレットをカルシウムとマグネシウムを含まない10 mLのハンクスバランスソルト溶液(HBSS)に再懸濁して、細胞の凝集を最小限に抑えます。</li>
	<li>細胞懸濁液を180 x g で室温で3分間遠心分離します。</li>
	<li>上清をデカントして残留血清/解離試薬を除去し、細胞ペレットを3 mLのHBSSに再懸濁します。</li>
	<li>100 μmのセルストレーナーを新しい50 mLコニカルチューブに置き、細胞懸濁液を通過させて細胞塊を取り除きます。 注:単一細胞懸濁液は、血管の閉塞と注射時の脳卒中のリスクを最小限に抑えるために不可欠です。</li>
	<li>トリパンブルー除外と標準的な方法で血球計算盤を使用して、生細胞の数を計算します。</li>
	<li>細胞懸濁液をHBSSで2.5 x 106 細胞/mLの細胞濃度に希釈します。</li>
	<li>チューブを氷上で水平に保ち、凝集を最小限に抑えるために定期的にチューブを静かに揺り動かします。細胞懸濁液は、氷上で最大6時間保存することができる。 注:ロッキングは手動で行われましたが、これは低回転数のシェーカーを使用して行うこともできます。</li>
</ol>2.手順のためのマウスの準備
注:この研究では、4〜5週齢の雌のNODシッドマウスを使用しました。手順の3日前にソフトダイエット回復食品(ダイエットジェル、ヒドロゲル、マッシュマウスチャウチャウなど)をマウスに導入して、手順後の摂食を促します。
<ol><li>オートクレーブ手術器具。手術部位と機器に表面消毒剤をスプレーして拭き取り、続いて70%エタノールをスプレーします。</li>
	<li>低体温症を防ぐために、手術用ボードの下に動物のヒートマットを置きます。手術の30分前にこれをオンにします。手術用ボードに表面消毒剤をスプレーして拭き取り、続いて70%エタノールをスプレーします。</li>
	<li>回復のために清潔な動物飼育ケージと暖かい加熱パッドを準備します。</li>
	<li>清潔な個人用保護具(ガウン、マスク、ヘアネット、手袋)を着用してください。清潔な試験用手袋と「器具のヒントのみ」のテクニックを使用して、手順全体を通して無菌性を維持します。</li>
	<li>マウスがペダル反射を失うまで、2 L / minの酸素流量で5%イソフルランを使用して麻酔チャンバーでマウスを麻酔します。.</li>
	<li>動物をチャンバーから取り出し、残りの外科的処置のために2 L / minの酸素流で2%イソフルランを供給するノーズコーンに入れます。</li>
	<li>識別のためのイヤーパンチマウスと首の領域から毛皮を剃るために電気バリカンを使用します。テープを使用して露出した皮膚から余分な髪をきれいにします。</li>
	<li>必要な麻酔薬および鎮痛薬の投与量を計算するためにマウスを体重測定する。ブプレノルフィンとメロキシカムをそれぞれ50μg / kgと1mg / kgで皮下注射で投与します。.</li>
	<li>マウスを暖かい手術用ボードに移し、ノーズコーンをテープで固定します。</li>
	<li>乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を目に塗ります。</li>
	<li>最初に外科用ボードにテープで留めた糸を使用して上顎切歯を引っ掛け、次に前足と後脚をテープで留めて、マウスを優しく固定します。このステップは、体を伸ばし、手術中に首をまっすぐに保ちます。</li>
	<li>下記の術前の皮膚調製を行う。<ol><li>局所消毒剤(ポビドンヨード)で首を拭いて、皮膚の微生物叢の負荷を減らし、抜け毛を取り除きます。皮膚の中心からきれいにし、切開部位の再汚染を防ぐために外側に働きます。70%エタノールを使用してこのプロセスを繰り返します。消毒のためにヨウ素とエタノールを交互に3回行います。</li>
		<li>動物の上に外科用ドレープを置きます。これは、滅菌ペーパータオルまたはオートクレーブバッグから切り取られ、作られます。</li>
	</ol></li>
	<li>手術器具用の滅菌ペーパータオルまたはオートクレーブバッグをレイアウトします。</li>
	<li>手順を続行する前に、十分な麻酔を確保するために、「ピンチテスト」 で 反射を確認してください。</li>
</ol>3.内頸動脈注射
注:この実験では、注射手順を容易にするために、31 Gの輸液カニューレと足で作動するシリンジドライバーのセットアップを利用しました(補足図1)。この設定はオプションであり、ユーザーは31 Gインスリン注射器を使用して、手順3.11および3.12をスキップできます。輸液カニューレを調製するには、2対の縫合クランプを使用して、31G針のシリンジフィッティング部分から針部分を引っ張り、分離します。次に、長さ約10cmの細い輸液チューブの一端に針部分を取り付けます。
<ol><li>解剖顕微鏡をマウスの上に置きます。</li>
	<li>はさみを使用して、顎の下5 mmから胸部入口まで、首の領域の正中線に沿って垂直に15 mmの切開を行います。</li>
	<li>2対の角度の付いた鉗子を使用して、皮膚とその下にある唾液腺を分け、気管を露出させ続けるために開創器を適用します。次のステップでは、気管と平行にある頸動脈鞘を露出させます。</li>
	<li>2対の細かい角度の鉗子を使用して、気管に隣接する筋肉と脂肪組織を鈍く解剖し、右頸動脈鞘を露出させます。頸動脈鞘は、総頸動脈、静脈、迷走神経を覆う線維層であり、この束は真っ赤な総頸動脈によって視覚化できます。本研究では右頸動脈に注射を行った。</li>
	<li>周囲の筋膜の頸動脈分岐部までの総頸動脈の尾部の一部を取り除き、迷走神経および静脈から分離します。</li>
	<li>頸動脈分岐部(外頸動脈と内頸動脈を結合する接合部)を周囲の神経や筋膜から隔離して取り除きます。細かい鉗子を外頸動脈の下に配置し、動脈の下に絹縫合糸(厚さ5-0)を通過させます。縫合糸を結びつけて締め、余分な線を切ります。 注:この結紮糸(L1)は、注射液が外頸動脈を通過するのを防ぎます。</li>
	<li>総頸動脈の下に細かい鉗子を配置し、動脈の下に絹縫合糸(5-0の厚さ)を通過させます。結び目を結び、提案された注射部位の近位位置で縫合糸を締めます。余分な縫合糸を切断し、約10 mmの線を残します。 注:この2番目の結紮糸(L2)は、注射後の血流と出血を制限します。また、注射中に頸動脈を配置して保持するためにも使用されます。</li>
	<li>約10 mm x 5 mmの(オートクレーブ処理された)低糸くずの使い捨てワイパー( 材料の表を参照)のストリップをカットして湿らせます。ストリップを4 mm x 5 mm、厚さ2〜3 mmに折り、注射予定部位の頸動脈の下に置きます。これは注入中に血管を支えます。</li>
	<li>提案された注射部位への総頸動脈吻側に、緩い結び目で3番目の結紮(L3)を配置します。これは注射後(ステップ3.16)にのみ締め付けられます。</li>
	<li>細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、200 μLの細胞懸濁液をインスリン注射器(31 G針付き)に引き込みます。</li>
	<li>作動するフットペダルに接続されているシリンジドライバーにシリンジをロードします。</li>
	<li>31 Gの針が付いた細かいカニューレをシリンジに取り付け、ラインを下塗りします。</li>
	<li>頸動脈が適切に配置され、加圧されているかどうかを確認します。</li>
	<li>2つの細かい角度の鉗子を使用して、1つは最初の結紮糸の端にそっと引っ張り、もう1つは31 Gの針を保持し、穴を開けないように注意しながら、ベベルアップで針を血管の内腔にゆっくりと挿入します。</li>
	<li>100 μLの細胞懸濁液(ステップ1.13から)を10 μL/sで総頸動脈にゆっくりと注入します。これにより、2.5 x 105 細胞が血管に送達されます。注射の成功は、頸動脈血管からの血液の除去 によって 視覚化されます。</li>
	<li>針を抜いた直後に緩い結紮糸(L3)をそっと持ち上げて締めます(手順3.9から)逆流と出血を防ぎます。余分な縫合糸をトリミングします。 注意: 針の離脱後に少量の血液が噴出するのを観察するのは正常です。ただし、3番目の結紮糸を締めた後、活発な出血があってはなりません。</li>
	<li>湿らせた糸くずの少ない使い捨てワイパーを取り除きます。</li>
	<li>P200ピペットを使用して、150〜200μLの滅菌水または生理食塩水で手術腔を2回すすぎます。</li>
	<li>出血がないかもう一度確認してから、開創器を取り外します。</li>
	<li>軟部組織、唾液腺、および皮膚を頸動脈と気管の上に再配置します。</li>
	<li>縫合針ホルダー、鉗子、および吸収性または非吸収性の6/0モノフィラメント縫合糸を連続パターンで使用して、切開部の皮膚層を閉じます。</li>
	<li>カニューレ針シリンジを廃棄し、次のマウス用の新しいセットアップを準備します。新しい注射器を使用すると、各マウスに注入される細胞の数が一定になります。 メモ: この手順の代表的なスナップショットを 補足図 2 に示します。注射液の漏れまたは出血によって示される、血管が針によって穿刺または引き裂かれた場合、手順は失敗したと見なされます。これに続いて、針を抜く必要があり、それ以上の出血を防ぐために3番目の結紮糸をすぐに締める必要があります。縫合糸の締め付け後に出血が持続する場合は、動物をペントバルビタールで安楽死させる必要があります。</li>
</ol>4.注射後の回復
<ol><li>術後の痛みの緩和として、ブプレノルフィン(50 μg / kg)とメロキシカム(1 mg / kg)を皮下注射 で 注射します。.</li>
	<li>麻酔から回復するために動物を暖かく清潔なケージに移動します。動物が目覚めた後、活動が抑制される(群がって活動していない、またはゆっくりと動き回っている)のは正常です。</li>
	<li>30〜45分後、マウスを長期保持施設に移す。</li>
	<li>術後少なくとも1週間はマウスにソフトダイエット(ダイエットジェル、ハイドロゲル、マッシュ)を与え、脳卒中、感染、創傷部位周辺の出血の兆候に特に注意を払いながら毎日体調をチェックします。</li>
	<li>手術の2日後、動物の活動が低下し、毛皮が軽度に波立たせられ、術前の体重が15%減少するのが一般的です。痛みを管理し、回復を助けるために、手術後2〜3日間毎日鎮痛薬(メロキシカム)を投与します。.</li>
	<li>3日目以降、動物は活動を取り戻し、給餌とグルーミングの頻度を増やし、体重を取り戻したに違いありません。腹腔内注射 を介して ペントバルビタールナトリウムを200 mg / kgで注射することにより、術後4日後に持続的な体調障害(痛み、群がり、不活性、体重減少)のある動物を安楽死させます。.</li>
	<li>腫瘍の生着と進行は、生物発光イメージング、MRIまたはPET / MRIなどの選択した麻酔およびイメージングモダリティを使用して監視できます。このようなイメージングを実施するための要件と能力は、本質的に個々のプロジェクトの目的とそれが実施される施設に依存し、使用される細胞株のレポータータグの種類に応じて、関連する放射化学および核イメージング施設へのアクセス可能性に依存します36,37 注:一部の動物は、手順が成功したにもかかわらず、うまく反応せず、脳卒中を経験する場合があります。処置後、神経学的苦痛の症状(頭を回して片側に引っ張る、旋回行動、転がる、スラッシングする、運動機能の喪失)を示す動物は直ちに安楽死させなければなりません。</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。資金提供者は研究のデザインに何の役割も果たさなかった。データの収集、分析、または解釈。原稿の執筆、または論文の出版の決定において。

脳転移は、がん細胞が原発部位から脳に広がる複雑なプロセスです。この多段階プロセスの特定の段階を反映したさまざまな動物モデルが利用可能であり、前臨床転移研究を設計するための生理学的および実用的な考慮事項があります41,42。脳転移治療のためのナノメディシンの使用を調査したほとんどの発表された研究は、心臓内43,44および頭蓋内45,46,47,48,49モデルを使用しています。頸動脈を介して癌細胞を移植することは、転移過程および脳転移病理生物学をよりよく再現する可能性...

脳転移は、非常に予後不良に関連する一般的な悪性腫瘍です1,2。脳転移患者の標準治療はマルチモーダルであり、患者の一般的な健康状態、頭蓋外疾患の負担、および脳内の腫瘍の数と位置に応じて、脳神経外科、全脳放射線療法、および/または定位放射線手術で構成されます3,4。最大3つの頭蓋内病変を有する患者は外科的切除または定位放射線手術の対象となりますが、手術関連の感染および浮腫のリスクを回避するために、複数の病変を有する患者には全脳放射線療法が推奨されます5。しかし、全脳放射線療法は放射線感受性の脳構造に損傷を与え、生活の質の低下に寄与する可能性があります6。
全身療法は、複数の病変を持つ患者を治療するための非侵襲的な代替的かつ論理的なアプローチです7。しかし、血流を介した細胞傷害性薬物の受動的送達は安全でない毒性のリスクなしに脳内で治療レベルを達成できないため、全身療法の有効性が低いという長年の考えのために、あまり考慮されていません8。このパラダイムは、最近米国食品医薬品局(FDA)が承認した全身療法(転移性HER2+乳がん脳転移に適応されるトラスツズマブとカペシタビンを含むツカチニブ)9,10,11,12、および脳転移患者に対する全身療法オプションの検討を含む治療ガイドラインの更新によって変化し始めています13,14。
これに関連して、分子標的療法、免疫療法、および標的ナノ薬物キャリアなどの代替薬物送達システムの分野における開発は、脳転移治療の課題を潜在的に克服することができる15、16、17、18。さらに、脳腫瘍関門の透過処理を介して薬物送達を改善するための化学的および機械的アプローチも調査されています19,20。このようなアプローチを研究し、目的に合わせて最適化するには、脳転移の複雑な生理機能を反映するだけでなく、頭蓋内薬物反応の客観的な分析を可能にする前臨床モデルを使用することが重要です。
大まかに言えば、in vivoで脳転移をモデル化するための現在のアプローチには、マウスにおける癌細胞の心臓内(左心室)、静脈内(通常は尾静脈)、頭蓋内、または頸動脈内(総頸動脈)注射が含まれます21、22、23、24、25、26、27.腫瘍生着戦略とは別に、腫瘍抑制遺伝子の除去または癌遺伝子の活性化によって腫瘍形成が引き起こされる遺伝子改変マウスモデルは、腫瘍モデリングに有用である。しかし、二次腫瘍を産生することが報告されている遺伝子操作されたマウスモデルはごくわずかであり、脳転移を確実に産生するマウスモデルはさらに少ない28,29,30。
心臓内(左心室)および静脈内(通常は尾静脈)注射などの生着法は、癌の全身播種を模倣する。これらのモデルは通常、循環器系の「初回通過」中にほとんどの腫瘍細胞をトラップする毛細血管床に応じて、複数の臓器(脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓など)に病変を引き起こします31。ただし、脳の生着率が一貫していない場合は、目的の統計的検出力のサンプルサイズを達成するために、より多くの動物が必要になります。これらの心臓内および静脈内注射法 によって 最終的に脳内に定着する腫瘍細胞の数はさまざまです。したがって、脳転移腫瘍の負荷は動物によって異なる可能性があり、進行の違いにより、実験のタイムラインと結果の解釈を標準化することが困難になる可能性があります。頭蓋外腫瘍の量は、脳以外の転移死亡率につながる可能性があり、これらのモデルは頭蓋内の有効性を評価するのに適していません。脳向性細胞株は、頭蓋外樹立を減少させるために人工クローン選択プロセスを用いて確立されているが、テイク率は一貫しておらず、クローン選択プロセスはヒト腫瘍に通常見られる不均一性を減少させることができる32。
頭蓋内および頸動脈内注射などの脳特異的生着法により、より一貫性のある効率的な脳転移モデリングが可能になります。頭蓋内法33では、癌細胞は典型的には前頭大脳皮質に注入され、これは低い全身的関与で迅速かつ再現性のある腫瘍伸長を生成する。この手順は死亡率が低く忍容性が高いが33、注意点は、脳内に細胞の(局所化された)ボーラスを迅速に導入し、早期脳転移の病因をモデル化しない比較的粗雑なアプローチであるということです。針は脳組織血管系を損傷し、それが局所的な炎症を引き起こします5,34。経験から、腫瘍細胞注入物は針の除去中に逆流する傾向があり、軟髄膜の関与につながります。あるいは、頸動脈内法は、脳微小血管系を最初に遭遇する毛細血管床として、循環、血管外漏出、およびコロニー形成における生存をモデル化して、細胞を総頸動脈に送達する24。他の25と一致して、この方法に関する私たちの経験は、外頸動脈を介してこれらの組織の毛細血管床に癌細胞が意図せずに送達されるため、顔面腫瘍を引き起こす可能性があることがわかりました(未発表データ)。総頚動脈注射の前に外頚動脈を結紮することで顔面腫瘍を予防することができます(図1)。記事の残りの部分では、この方法は「内頸動脈注射」と呼ばれます。経験から、内頸動脈注入法は、全身事象が非常に少ない脳転移を一貫して生成し、異なる原発癌(黒色腫、乳癌、肺癌など)の脳転移モデルを生成することに成功しています(図1)。欠点は、技術的に困難で、時間がかかり、侵襲的であり、細胞数とモニタリングタイムラインの慎重な最適化が必要であることです。要約すると、頭蓋内および内頸動脈注射法の両方が、脳腫瘍関連の生存利益に対する治療的影響を評価するのに適したマウスモデルを生成する。
このプロトコルは、全身的な関与がほとんどない脳転移のマウスモデルを作成するための内頸動脈注射法を説明しているため、薬物分布の前臨床評価と実験的治療法の有効性に適しています。
<img alt="頸動脈注射セットアップによるマウス脳腫瘍転移モデル図。組織学的結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64216/64216fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:脳転移のための内頸動脈注射プロトコルの概略図。 外頸動脈結紮を伴う内頚動脈注射は、様々な原発癌由来の脳転移モデルを確実に作製することができる。このプロトコルでは、3つの結紮糸が頸動脈に配置されています(図ではL1-L3と注釈されています)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64216/64216fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>100&マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>コーニング</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>30G マイクロランス針</td><td>BD</td><td>23748</td><td></td></tr><tr><td>31G ウルトラファインIIインスリンシリンジ</td><td>BD</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>角度付き鉗子</td><td>Proscitech</td><td>T67A-SS</td><td>細かい尖った、鋸歯状のない角度、18mm先端、長さ128mm</td></tr><tr><td>アニマルヒートマット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生物質および抗真菌剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブバッグ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BT-474(HTB-20)乳がん細胞株</td><td>ATCC</td>、<td>HTB-20</td><td></td></tr>、<tr><td>ブプレノルフィン(TEMGESIC)、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カウントスセルカウンター</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10227</td><td></td></tr>、<tr><td>ダイエット-76A</td><td>、クリアH2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イヤーパンチャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動クリッパー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細角鉗子</td><td>Proscitech</td><td>DEF11063-07</td><td>斜め45°C、先端平滑、先端幅:0.4mm、先端寸法:0.4×0.3mm、長さ9cm</td></tr><tr><td>カニューレ用細管、チューブ外径(in)1/32、チューブ内径(in)1/100in</td><td>コールパーマー</td><td>EW-06419-00</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まないハンクのバランスの取れた塩溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14170120</td><td></td></tr><tr><td>ハイドロゲル</td><td>ClearH2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ 低糸くずの使い捨てワイパー</td><td>キンバリー・クラーク - キムワイプ</td><td>Z188964</td><td></td></tr><tr><td>マッシュマウスチャウ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム(METACAM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーズコーン</td><td></td><td></td>マイクロ<td>チューブPAA</td></tr><tr><td>眼潤滑剤(カルボマー2mg / g)</td>から作られました<td>&nbsp;ボシュとロム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード溶液</td><td>ベタジン 2505692</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PPE (手袋、マスク、ガウン、ヘアネット)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リトラクター</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 メディア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>シルク縫合糸 13mm 5-0、P3、45cm</td><td>エチコン</td><td>JJ-640G</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TM4469</td><td></td></tr>スティ<tr><td>ッキーテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカルボード</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ可能なバッグで包まれたまな板。</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Proscitech</td><td>T104</td><td>先端寸法 (LxD): 38x7mm、長さ 115mm</td></tr><tr><td>縫合鉗子/ 湾曲 ブロフィー鉗子</td><td>Proscitech</td><td>T113C</td><td>湾曲、丸みを帯びた狭い 2 mm 先端、セレーション付き、長さ 165 mm</td></tr><tr><td>縫合針ホルダー (オルセン ヘガー針ホルダー)</td><td>Proscitech</td><td>TC1322-180</td><td>長さ 190 mm、ラチェット クランプ</td></tr><tr><td>フット ペダル付きシリンジ ドライバー/ UMP3 ウルトラ マイクロ ポンプ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>UMP3-3</td><td></td></tr><tr><td>T75 組織培養フラスコ</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>スレッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トライジーンII表面消毒剤</td><td>セバ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・トリパン・ブルーおよびセル・カウンティング・チャンバー スライド</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 解離培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12605010</td><td></td></tr></tbody></table>

がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。複雑な神経微小環境や間質細胞相互作用などの転移性疾患の重要な側面は、 in vitro アッセイでは完全に再現できません。したがって、動物モデルは、治療的介入の効果を調査および理解するために重要です。しかし、ほとんどの脳腫瘍異種移植法は、時間枠と腫瘍量の点で一貫して脳転移を引き起こしません。がん細胞の心臓内注射によって生成された脳転移モデルは、意図しない頭蓋外腫瘍の負担をもたらし、非脳転移性の罹患率と死亡率につながる可能性があります。がん細胞の頭蓋内注射は頭蓋外腫瘍の形成を制限する可能性がありますが、注入された細胞が注射部位で特異な腫瘍塊を頻繁に形成する、軟髄膜の関与が高い、針刺し中の脳血管系の損傷など、いくつかの注意点があります。このプロトコルは、内頸動脈注射によって生成された脳転移のマウスモデルを記載する。この方法は、他の臓器を介さずに一貫して頭蓋内腫瘍を作製し、脳転移の治療薬の評価を可能にします。

外頸動脈結紮の有無にかかわらず一般的な頸動脈注射を比較する 外頚動脈24を最初に結紮することなく、総頸動脈を介して癌細胞を注入すると、移植マウスの77.8%(n=7/9匹)に顔面腫瘍が認められた。顔面腫瘍の例を補足図3に示します。このプロトコルに記載される方法は、総頸動脈の前に外頸動脈を結紮することによって意図しない顔面転移を防止する。
2つの方法を比較するために、外頸動脈結紮の有無にかかわらず、淘汰されたマウスの共通頸動脈にレクチンを注射した。次に、顔面組織と脳を固定し、処理し、蛍光顕微鏡で観察しました。外頸動脈を結紮した場合の頬組織における免疫蛍光解析でレクチンの減少が観察された(図2A-B)。結果はまた、外頸動脈結紮を伴う総頸動脈注射を受けたマウスの脳組織にレクチンが観察されるため、外頸動脈結紮が脳送達に影響を与えなかったことを...

脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。ほとんどの脳転移マウスモデルは、死亡率および治療介入結果の交絡分析を混乱させる全身性転移によって複雑になります。ここに提示されるのは、最小限の全身腫瘍で一貫した頭蓋内腫瘍を生成する癌細胞の内部頸動脈注射のためのプロトコルです。

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

では、なぜこのプロトコルが重要なのでしょうか。さて、脳転移は治療が非常に困難であり、このプロトコルは、頭蓋外腫瘍が最小限の臨床的に関連するマウスモデルを生成します。この技術により、頭蓋内腫瘍からの薬物分布と反応を客観的に分析できます。この技術の主な利点は、モデルが再現性が高く、注射後比較的短時間で脳転移が発生することです。病気の進行は動物間で類似しているため、研究者は実験、治療のタイムライン、およびエンドポイントを簡単に標準化できます。初心者への私のアドバイスは、解剖顕微鏡を覗きながら鉗子と注射器の使用を練習し、首の周りの解剖学的ランドマークに慣れ、獣医の前でプロトコルを練習することです。まず、BT-474がん細胞を10ミリリットルの完全増殖培地を使用してT-75フラスコに10倍の2倍の播種密度で播種し、細胞が注入前に70〜80%のコンフルエンシーに達するまで培養します。注射当日、増殖培地を廃棄し、細胞単層をPBSで2回洗浄し、5ミリリットルの予め温めた細胞培養解離試薬を加える。摂氏37度で5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。5分後、フラスコをインキュベーターから取り出し、細胞剥離を助けるためにそっと軽くたたきます。10%FBSを含む5ミリリットルの完全増殖培地を添加して、解離試薬活性を消光します。ピペッティングにより溶液中の細胞を穏やかに再懸濁し、細胞の凝集を減らします。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移し、室温で3分間180Gで遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットをカルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSSに再懸濁して、細胞の凝集を最小限に抑えます。細胞懸濁液を180 Gで室温で3分間遠心分離し、上清をデカントして残留血清または解離試薬を除去し、細胞ペレットを3ミリリットルのHBSSに再懸濁します。100マイクロメートルのセルストレーナーを新しい50ミリリットルのコニカルチューブに置き、セル懸濁液を通過させてセルの塊を取り除きます。トリパンブルーを使用して生細胞数を計算し、HBSSで細胞懸濁液を10〜6細胞/ミリリットルの2.5倍の細胞濃度に希釈します。チューブを氷上で水平に保ち、凝集を最小限に抑えるために定期的にチューブを静かに揺り動かします。細胞懸濁液は、最大6時間氷上に保存することができる。識別のための耳穿刺マウスと首の領域から毛皮を剃るために電気バリカンを使用します。露出した皮膚から余分な髪をテープできれいにします。乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を目に塗ります。外科用ボードにテープで留めた糸を使用して上顎切歯を引っ掛け、続いて前脚と後脚をテーピングして、マウスを優しく固定します。このステップは、体を伸ばし、手術中に首をまっすぐに保ちます。術前の皮膚の準備のために、ポビドンヨードなどの局所消毒剤で首を拭いて、皮膚の微生物叢の負荷を減らし、抜け毛を取り除きます。皮膚の中心からきれいにし、切開部位の再汚染を防ぐために外側に働きます。70%エタノールを使用してこのプロセスを繰り返し、消毒のためにヨウ素とエタノールを交互に3回行います。手順を続行する前に、ピンチテストで反射をチェックして、麻酔による死亡を確認してください。動物の上に滅菌外科用ドレープを置きます。解剖顕微鏡下で、顎下5ミリメートルから胸部入口まで、ハサミを使用してマウスの首領域の正中線に沿って垂直に15ミリメートルの切開を行います。2対の角度の付いた鉗子を使用して、皮膚とその下にある唾液腺を分け、気管を露出させ続けるために開創器を適用します。2対の細かい角度の鉗子を使用して、気管に隣接する筋肉と脂肪組織を鈍く解剖し、右頸動脈鞘を露出させます。頸動脈鞘は、総頸動脈、静脈、迷走神経を覆う線維層であり、この束は真っ赤な総頸動脈によって視覚化できます。周囲の筋膜の頸動脈分岐部までの総頸動脈の尾部の一部を取り除き、迷走神経および静脈から分離します。頸動脈分岐部を周囲の神経や筋膜から隔離して取り除きます。細かい鉗子を外頸動脈の下に配置して、動脈の下に5-0の絹縫合糸を通過させます。縫合糸を結びつけて締め、余分な線を切ります。総頸動脈の下に細かい鉗子を配置し、動脈の下に5-0の絹縫合糸を通過させます。結び目を結び、提案された注射部位の近位位置で縫合糸を締めます。余分な縫合糸を切り取り、約10ミリメートルの線を残します。糸くずの少ない使い捨てワイパーのストリップを約10 x 5ミリメートルカットして湿らせます。ストリップを折り、注射の提案された部位の頸動脈の下に置きます。これは注入中に血管を支えます。提案された注射部位への総頸動脈吻側に、緩い結び目で3番目の結紮を置きます。これは注射後にのみ締め付けられます。細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を31ゲージの針を備えたインスリン注射器に引き込みます。作動するフットペダルに接続されたシリンジドライバーにシリンジをロードします。31ゲージの針が付いた細かいカニューレをシリンジに取り付け、ラインをプライミングします。頸動脈が適切に配置され、加圧されているかどうかを確認します。2つの細かい角度の鉗子を使用して、1つは最初の結紮糸の端にそっと引っ張り、もう1つは31ゲージの針を保持し、ベベルを上にして針を血管の内腔にゆっくりと挿入し、穴を開けないように注意します。先に調製した100マイクロリットルの細胞懸濁液を毎秒10マイクロリットルで総頸動脈にゆっくりと注入します。これにより、10の2.5倍の5番目の細胞が血管に送り込まれます。注射の成功は、頸動脈血管からの血液の除去によって視覚化することができます。針を抜いた直後に緩んだ結紮糸をそっと持ち上げて締め、逆流や出血を防ぎます。余分な縫合糸を切り取り、湿らせた糸くずの少ない使い捨てワイパーを取り除きます。P-200ピペットを使用して、150〜200マイクロリットルの滅菌水または生理食塩水で手術腔を2回すすぎます。出血をチェックした後、軟部組織、唾液腺、および皮膚を頸動脈と気管の上に再配置します。縫合針ホルダー、鉗子、および吸収性または非吸収性の6−0モノフィラメント縫合糸を連続パターンで使用して切開部の皮膚層を閉じる。術後の痛みの緩和として、ブプレノルフィン1キログラムあたり50マイクログラム、メロキシカム1キログラムあたり1ミリグラムを皮下注射で注射します。.麻酔から回復するために動物を暖かく清潔なケージに移動します。レクチンは、外頸動脈結紮の有無にかかわらず、マウスの総頸動脈に注射されました。外頸動脈を結紮すると頬部組織にレクチンの減少が認められた。結果は、結紮が脳送達に影響を与えなかったことを示しました。腫瘍の進行は、ルシフェラーゼ発現HER2増幅乳癌細胞株を用いてモニターした。BT474脳転移モデルは、内頸動脈注射後5週目から生物発光シグナルの増加を示し、その後徐々に成長しました。5週目から8週目にかけて、不均一なシグナル強度は、複雑な体液灌流を伴う頭蓋内腫瘍を示しました。腫瘍領域内のガドリニウム濃度は、血液循環から腫瘍組織に漏出するにつれて増加した。ナノメディシンおよび脳転移の蓄積は、関与していない脳領域と比較して腫瘍領域で検出されたより高いナノメディシンレベルによってBT-474マウスで確認された。BT-474脳転移モデルが進行するにつれて、動物は最大20%体重を失い始め、生存期間の中央値は注射後9週間になりました。組織学の結果、腫瘍は一方的に位置し、腫瘍が主に固体の孤立した腫瘤として現れた頸動脈注射部位と一致していることが示されました。空きスペースのポケットが頻繁に観察され、壊死細胞で構成されていましたが、一部の動物では小さな成長も存在していました。プロトコルを試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、針を挿入する前に頸動脈を正しく準備して配置し、針の挿入中に適切な張力をかけることです。このモデルは、脳への薬物送達と脳転移の治療のための新しい治療法の有効性を探求する研究者にとって有用です。

modeling-brain-metastasis-internal-carotid-artery-injection-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、頭蓋内注射を行うことにより、マウスの脳に腫瘍細胞を移植する方法を示しています。...

頭蓋内同所性モデル:マウス脳にがん細胞を移植する手技

このビデオは、蛍光標識された癌細胞の頸動脈内注射による脳転移マウスモデルの確立を示しています。マウスモデルは、新しい治療法の効果とその基礎となる生理学的メカニズムを研究するために使用できます。...

脳転移マウスモデル:頸動脈内がん細胞注入による脳転移マウスモデル作製法

出典:Lim, M., et al.がん細胞の内部頸動脈注射による脳転移のモデリング。J. Vis.

がん細胞の内部頸動脈注入による脳腫瘍転移のモデリング

乳癌脳転移マウスモデルをMDA-MB231/Br-GFP細胞の超音波画像誘導の心臓内注射で確立される。多焦点頭蓋内転移の発生は、高解像度の9.4 T MRIを用いて長手方向にモニタされた。...

縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

脳転移は、治療の選択肢が緩和的に残っているが、その発生率が増加しているとして緊急に満たされていない医療ニーズとなっています。癌細胞の頸動脈内動脈注射を介して脳転移の実験動物モデルを作成することは、疾患の生物学および新規介入計画の評価の機構研究を容易にします。...

脳転移のマウスモデルを生成するために頸動脈内癌細胞注入

頭蓋内脳転移のモデル化は、腫瘍の大きさと治療に対する反応を正確かつタイムリーな方法で監視できないことによって複雑になる。提示された方法論は、磁気共鳴画像分析と頭蓋内腫瘍注射を組み合わせ、これを組み合わせると、正確で一貫した注射、強化された動物モニタリング、および正確な腫瘍体積測定を育成する。...

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

内因的にHER2増幅された炎症性乳癌細胞株の尾静脈注射によって生成された乳癌脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。...

炎症性乳癌細胞の尾静脈注射による脳転移のモデル化

この原稿は、骨を含む後肢組織にがん細胞を特異的に送達し、実験的な骨転移を確立する技術である腸骨内動脈（IIA）注射の詳細な手順を提供します。当初は乳房腫瘍モデルで確立されましたが、このプロトコルは他の種類のがんにも簡単に拡張できます。...

顕微鏡骨転移の効率的かつ選択的モデリングのためのイントラ腸骨動脈注入

門脈注射を通じてマウスの肝臓に乳腺腫瘍細胞を送達するための外科的処置が開発されました。このモデルでは、腫瘍細胞の血管外漏出、播種、生存、肝臓での転移性伸長など、完全に免疫力のある宿主における肝転移の後期段階の調査が可能になります。...

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs...

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

学ぶ 内頸動脈注射によるマウス脳転移モデルの作成法。BT-474細胞を用いて再現性の高い脳腫瘍を誘導し、薬物分布と治療効果を客観的に評価する実験系を確立します。

がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化

さらに動画を探す