Name: 口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットにおける神経損傷誘発性機械的過敏症の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶ口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットの神経損傷誘発性機械的過敏症の評価法。自動化されたOPAD装置により拘束ストレスを排除し、舐め行動と接触試行を測定することで、神経障害性疼痛の機序解明に貢献する信頼性の高い疼痛評価を実現します。

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この研究は、顔面痛研究財団によって資金提供されています。

すべての実験手順は、フロリダ大学施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所ガイドに記載されている基準に準拠していました。ここでは、OPADを用いた機械的過敏症の評価を、神経因性口腔顔面痛のラットモデルを用いて説明する。研究で使用されたタイムラインの概略図を 図1に示します。すべての行動評価は女性実験者によって行われた。
1.動物
<ol><li>雌のSprague-Dawleyラット(n = 8 /グループ、150-200 g)を、温度管理された部屋(22°C±1°C)で12時間:12時間の明暗サイクルでペアで飼育します。食料と水を 自由に提供します。実験前に、ラットを馴化のために施設に5日間保管してください。</li>
	<li>オペラント疼痛アッセイを同じ曜日と時間(午前9時から午前11時)に実行します。</li>
	<li>実験の終わりに、イソフルラン麻酔後の断頭によってラットを安楽死させる。</li>
</ol>2. OPAD のセットアップ
<ol><li>ミルクドリップトレイ、プレキシグラスケージ、および金属製のフローリング格子をOPADに置きます。ケージに配線を取り付けます。ボトルホルダーをデバイスの背面にある金属製のポールに滑り込ませます。</li>
	<li>報酬溶液として、甘くしたコンデンスミルクの缶を開けて1Lのビーカーに注ぐことにより、水と加糖コンデンスミルクの比率を2:1で準備します。300 mLの牛乳に~600 mLの水道水を加えます。最初にスプーンを使用して溶液を攪拌し、次に攪拌子とホットプレートスターラーを使用します。次に、報酬ボトルにミルク溶液を入れ、ストックミルク溶液を4°Cに保ちます。 注意: ストックミルク溶液をプラスチック製のフードラップで覆います。毎回使用する前にミルク溶液を温めてください。冷蔵庫の中のストックミルク溶液は一週間後に凝固することがあります。凝固すると、リックチューブを閉塞する可能性があります。したがって、それを破棄して新しいストック溶液を準備してください。</li>
	<li>報酬ミルクボトルをボトルホルダーに置き、動物が注ぎ口に到達できるように調整します。ホルダーの左側のノブを締めて、ボトルを所定の位置に固定します。</li>
	<li>フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を入れます。</li>
</ol>3. プロトコルの設定と実験ファイルの作成
注: まず、実験を実行するためのプロトコルを設定します。プロトコルは、ANY-mazeソフトウェアが実験を実行する方法を記述します。
<ol><li>ソフトウェアを開きます。パスワードを入力します。[ ログオン ] をクリックするか 、Enter キーを押します。</li>
	<li>[ 新しい空のテスト] をクリックします|プロトコル メニュー。<ol><li>このプロトコルが使用する モード を選択し、プロトコルに名前を付けます。 [装置] で [ 名前のないプロトコル] をクリックし、[ このプロトコルで使用するモードを選択する ] セクションをクリックし、[ 装置固有のモード] で OPAD メカニカル ケージ モードを選択して [OK] をクリックします。次に、プロトコルに名前を付けます(例:OPADメカニカル)。</li>
		<li>OPADケージを追加します。<ol><li>「装置」で、「装置」をクリックします|[プロトコル] ウィンドウの上部にある項目を追加します|新しいOPADケージ|接続されているすべてのOPADケージを追加します。 注意: ケージを追加する前に、すべてのケージがオンになっていることを確認してください。</li>
		</ol></li>
		<li>実験テスト ステージを追加します。<ol><li>[テスト] で、[ステージ] をクリックします|最初のステージと名前ステージ(例:ベースライン1日目)。テスト期間として「10 分」と入力します。さらにステージを追加するには、[プロトコル] ウィンドウの上部にある [項目の追加] をクリックします|新しいステージ。 注:各段階は、アッセイが実行されるときのセッションを指します。たとえば、10日間のトレーニングの場合、10のステージが必要です。試験時間は、実験計画に基づいて増減することができます。</li>
		</ol></li>
		<li>処理グループを割り当てます。<ol><li>[ 追加情報] で、[ 治療グループ] をクリックします。[ 治療グループの使用] |にチェックを入れます。ユーザーは手動で動物をグループに割り当てます。 注意: 参照されているソフトウェア( 材料の表を参照)では、動物をランダムまたは特定の順序で割り当てることもできます。実験はブラインドで実行できます。割り当てられた治療グループを表示するには、[ ブラインドで実験を実行] チェックボックスをオフにします。</li>
		</ol></li>
		<li>動物識別情報(ID)を割り当てます。<ol><li>[プロトコル] メニューをクリックします。[追加情報] で [動物 ID] をクリックし、[自分の ID を使用して動物を参照する] をオンにします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>[テスト] メニューをクリックします。<ol><li>実験のタイトルを入力します。</li>
		<li>[ 処理の表示] をクリックして処理に名前を付け、処理名を入力します (例: 処理 1: CCI-ION、処理 2: 偽)。</li>
		<li>動物を追加し、処理と動物IDを割り当てるには、[ 動物を表示]をクリックします|動物を追加し、テストする動物の数を入力して、[ OK] をクリックします。動物のリストが表示されるのを待ち、各ラットの動物IDと治療法を追加します。 注意: 動物IDの横に表示される ステータスリストは 、研究の開始時に 正常 に設定されます。動物は、ステータスを [廃止済み ] または [削除済み] に変更することで、後でテスト スケジュールから削除できます。</li>
	</ol></li>
	<li>[プロトコル] メニューをクリックしてプロトコルを保存します|[プロトコル] ペインの上部にある [プロトコルの保存] をクリックします。ファイル名とソフトウェア(ANY-maze)パスワードを入力し、[保存]をクリックします。 注:保存したプロトコルは、新しい実験に再利用できます。</li>
	<li>[ ファイル] をクリックして実験ファイルを保存します|保存し、ソフトウェアパスワードを入力して、[ 保存]をクリックします。</li>
</ol>4.トレーニングとベースラインテストセッション
注:行動試験室が同じ動物飼育施設にある場合は、試験の少なくとも15分前にラットを部屋に連れて行ってください。動物施設外の試験室に搬送する場合は、ラットに1時間与えて部屋に順応させます。
<ol><li>ベースライン記録の前に、OPADでラットを2週間(5日/週、10分/日)訓練して、金属のスパイクバーに顔を押し付けてミルク溶液を受け取ります。 注:スパイクバーとアッセイを実行するラットの代表的な画像を 図2に示します。</li>
	<li>OPAD機器をセットアップします。</li>
	<li>フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を入れます。ケージの緑色のライトを探します。これは、ケージをテストする準備ができていることを意味します。</li>
	<li>保存した実験ファイルをダブルクリックして開きます。パスワードを入力します。[ ログオン ] をクリックするか 、Enter キーを押します。</li>
	<li>[テスト] メニューが表示されるのを待ちます。画面の左側で、動物の数と対応するケージ(たとえば、動物1はケージ1でテストされます)、その日に実行されるステージ、およびテストステータス(「準備完了」)をメモします。画面の右側で、なめと接触の数を示す各動物のチャートを観察します。</li>
	<li>テストする動物のIDを表示するケージの画面を観察します。各ラットを対応するケージに入れ、ケージのボタンを2回押します。テストが開始されると緑色のライトがオレンジ色のライトに変わり、テストセッションが終了すると警告音が鳴ることに注意してください。</li>
	<li>トレーニングの最初の2日間は、牛乳瓶を完全にケージに入れて、ラットが刺激に接触せずに牛乳を飲むことができるようにします。</li>
	<li>トレーニングの3〜8日目に、動物が飲み始めたら、ボトルを徐々に後方に動かして、ラットがスパイクバーに顔を押すように促します。</li>
	<li>トレーニングの9〜10日目に、動物がスパイクバーを完全に押し、舐めの数が一定になったら(500分間のテストセッション中に最低10回舐めます)、各動物の牛乳瓶の位置をメモし、この距離をベースライン記録に使用します。</li>
	<li>2週間のトレーニングの後、ベースラインとして5日間(10分/日)、記載された牛乳瓶の距離からデータを収集します。</li>
</ol>5.口腔顔面神経障害性疼痛の誘導と機械的過敏症の評価
注:ベースライン測定に続いて、ラットは、前述のように、IONの両側結紮を伴うCCI-ION手術を受けました20。対照ラットは偽手術を受けた。術前または術後の鎮痛は、神経障害の時間経過を変える可能性があるため、手順では使用されませんでした。注意: 廃イソフルランは、チャコールキャニスターを通して清掃する必要があります。.メスの刃と針はバイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。
<ol><li>O2 (1 L / min)と4%イソフルランの混合物で誘導チャンバー内のラットを麻酔し、手術期間中、特殊なノーズコーンで麻酔状態を維持します。</li>
	<li>麻酔をかけたラットを手術用の作業台に置き、拘束します。加熱パッドを使用して体温を37°Cに維持します。眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、つま先の離脱反射が観察されなくなったら手順を開始します。</li>
	<li>実体顕微鏡下で外科的処置を行う。開創器を使用して口を開き、小さなクリップを使用して唇を引っ込めます。</li>
	<li>メスの刃(#15)を使用して背側歯茎と唇の間に小さな切開を行います。メスの刃の先端を使用して軟組織をそっと切り取り、IONの枝を明らかにします。</li>
	<li>鈍く曲がった注射針を使用して、IONの周りに2つのクロミックガット(#5-0)結紮糸を配置します。</li>
	<li>組織接着剤を使用して傷を閉じます。</li>
	<li>偽の手術では、同じ手順を使用してIONを露出させますが、神経を結紮しないでください。</li>
	<li>手術後、ミルクで柔らかくしたげっ歯類の固形飼料を2日間提供して、食事を促し、脱水症状を防ぎます。</li>
	<li>手術の翌日にOPADでラットを3日間連続してテストし、次に3日/週(たとえば、毎週火曜日、木曜日、金曜日)を、なめ数がベースライン値に達するまで次の数週間テストします。 注:CCI-ION誘発の機械的感受性の持続時間は、性別、使用するげっ歯類のひずみ、および実験者のパフォーマンスに依存する可能性があります。したがって、動物をテストするための特定の期間を示すことは正確ではないかもしれません。したがって、リック数がベースライン値に達するまでテストする方が正確です。</li>
</ol>6.デバイスのクリーンアップ
<ol><li>テストが終了したら、右上隅にあるxアイコンをクリックしてソフトウェアを終了し、データが自動的に保存されるのを待ちます。</li>
	<li>フロントパネルのスイッチを使用してケージの電源を切ります。</li>
	<li>金属製の床格子からワイヤーを外します。ミルクドリップトレイ、プレキシグラスケージ、金属製の床格子、ボトルホルダーを食器用洗剤で取り外して洗います。すべてを物干しラックに置きます。</li>
	<li>金属製のスパイクバー、テストデバイス、およびラボベンチを70%イソプロピルアルコールで拭きます。 注意: 機器の取り扱いには注意が必要です。牛乳瓶や舐めチューブを掃除するときは、柔らかいブラシを使用してください。汚れた機器はバクテリアの蓄積につながる可能性があります。</li>
</ol>7.データ分析
<ol><li>実験ファイルをダブルクリックして開きます。</li>
	<li>[結果] メニューをクリックします。表示するメジャー(つまり、なめる、接触する)またはテスト日を選択します。</li>
	<li>[結果] パネルの上部にある [テキストまたはグラフ] または [統計] をクリックして、テキスト、グラフ、または統計分析レポートを表示します。</li>
	<li>生データを表示するには、[ データ ] メニューをクリックします。[データ] パネルの上部にある [保存] をクリックしてデータをスプレッドシートとして 保存 するか、[ 送信 ] をクリックして電子メールで受信します。</li>
	<li>表示する変数を変更または追加するには、[ データの選択] をクリックし、メジャーを選択して、[ スプレッドシートの表示] をクリックします。</li>
	<li>統計解析<ol><li>ソフトウェアからリックとコンタクトの数と最初のリックまでの待ち時間を自動的に導き出し、ソフトウェアからスプレッドシートにデータをエクスポートします。</li>
		<li>舐めの数を接触の数21,22,23で割ることにより、過敏症の指標としてL / F比を計算します。 注:この研究では、偽グループのラットの1人は、手術前の舐め数が少ない(<500舐め)ため、研究から除外されました。</li>
		<li>L/Fの差の統計的有意性、舐めと接触の数、および最初の舐めまでの待ち時間を、双方向反復測定ANOVAとそれに続くDunnettの多重比較またはŠídákの多重比較検定(必要に応じて)によって分析します。 注:P < 0.05は統計的に有意であると考えられた。データは、平均の標準誤差(SEM)±平均値として提示した。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

ジョン・K・ノイベールとロバート・M・コードルはOPADの発明者です。Stoelting Co.はOPADの製造業者であり、Richard MillsはStoeltingの従業員です。出版料はStoelting Co.リチャード・ミルズ、ジョン・K・ノイバート、ロバート・M・コードルが、オペラント疼痛アッセイを使用したサービスごとの行動検査を提供する会社であるVelocity Laboratoriesの前の所有者です。

顔面および口腔内粘膜の無害な機械的刺激によって引き起こされる痛みは、三叉神経痛および顎関節障害を含む口腔顔面痛状態の顕著な特徴である24,25。三叉神経因性疼痛は臨床的によく説明されていますが、げっ歯類の神経因性侵害受容行動の評価は困難です。反射行動を測定する疼痛アッセイは、前臨床疼痛研究で最も頻繁に使用される方法です。しかしながら、試験装置関連のストレス、情動状態を評価することができないこと、および実験者のバイアスは、反射アッセイ26の有用性および妥当性に関する懸念を提起する。
この研究では、ラットの口腔顔面領域における機械的感受性の評価を紹介し、オペラントベースの疼痛アッセイを使用してCCI-IONに対する感受性を実証します。同じオペラントシステムを使用して、マウスの機械的感受性をテストすることもできます。マウスおよびラット系統は、CCI-IONに対するそれらの応答において変動を示す可能性があり、したがって、機械的過敏症のレベルは異なり得ることに留意すべきである。私たちの経験に基づくと、Sprague-Dawleyラットは通常、CCI-IONの2週間後に安定した機械的過敏症を発症し、CCI-IONの4週間後に回復を開始し、CCI-IONの6週間後に手術からの回復が見られます。 
このプロトコルでは、機械的過敏症は、舐めの数と接触、L / F、および最初の舐めまでの潜時を測定することによって定量化されました。データは、CCI-IONがL / Fと舐め反応の数の減少をもたらし、最初の舐め反応までの潜時の増加をもたらし、動物が口腔顔面痛感受性の増加のためにスパイクバーに顔を押し付けたくないことを示しています。 
OPADは、動物が口当たりの良い報酬にアクセスするために侵害受容刺激に耐えなければならない報酬競合アッセイです。アッセイにおける舐め行動は、食欲をそそる行動によって影響を受ける可能性があります。また、本研究では、顔の毛のあるラットを使用しました。オペラント疼痛アッセイの以前の経験に基づくと、げっ歯類の中で、無毛株は顔の接触を検出するのに適しています16;しかし、公表時点では、ヘアレスラット系統はもはや市販されていなかった。これは研究の限界と見なすことができます。また、雌のSprague-Dawleyラットのみを使用したため、痛みの反応における性別および系統に関連する違いが予想されます。 
アッセイで最適な結果を得るための重要なステップもいくつかあります。正確な舐めと接触のデータは、参照先のソフトウェアでは、それぞれ赤と白の実線のブロックとして表示される必要があります ( 図 3 を参照)。スパイクと牛乳瓶の間の距離は、実験の成功にとって非常に重要です。牛乳瓶の先端が前方に遠すぎると、動物はスパイクと接触せず、ソフトウェアは連絡先を正しく登録したり、番号をなめたりしません。逆に、牛乳瓶が後ろに離れすぎると、連絡先は登録されますが、動物は牛乳に到達できません。トレーニングセッション中、牛乳瓶の先端が前方に遠すぎるため、なめのデータが白いブロックとして表示される場合があります。牛乳瓶を後ろに押すと、赤い固体ブロックに変わります。何らかの理由で、舐めのデータが記録された距離から白いブロックとして表示され始めた場合は、ボトルを少し押して、ミルクホルダーをわずかに下/上に動かすと役立つ場合があります。 
いくつかの点は、ここで説明する口腔顔面オペラント疼痛システムの限界としても考えられるかもしれません。げっ歯類の訓練は必要であり、数週間かかります。各テストセッションの前に、マウスでは食物制限が必要ですが、ラットでは必要ありません。絶食していないマウスは、絶食マウスと比較して舐め回数が少なく、一貫性がないことが示されています27。OPADシステムは報酬競合モデルであるため、動物の食欲をそそる行動や食欲に影響を与える薬物の影響を受ける可能性があります。複数の装置を有することは、動物を試験するための全体的な時間を短縮するのにも有利であり、これはコストを増加させる可能性がある。ただし、口腔顔面オペラント疼痛アッセイは、複数の動物を同時にテストでき、動物と実験者の相互作用を制限するため、従来の反射ベースのアッセイよりも依然として有利です。
疼痛状態の間のオペラント条件付けは、その結果に応じて人間と動物の行動を変更します28。したがって、報酬競合モデルを使用することは、動物がオペラント応答を実行することを可能にするため、痛みの状態を評価するのに有利です。オペラント行動の特徴は意図、動機、そして典型的には皮質処理を含むので、これはより臨床的に関連性がある29。動物が自発的に報酬ボトルに近づき、いつでもスパイクバーから自由に撤退できるため、これは脳のより高い中心を統合し、痛みに関連する感情的動機付け状態の評価を可能にします10。したがって、オペラント疼痛アッセイは、 in vivoで疼痛および鎮痛薬を評価する際に優れたデータを提供します。それらはまた、三叉神経系における侵害受容プロセスを理解するのに役立ち、それによって口腔顔面痛分野の進歩に貢献します。

慢性疼痛は毎年何百万人ものアメリカ人に影響を及ぼします1。残念ながら、既存の治療法は慢性疼痛の緩和に比較的効果がなく、長期使用では望ましくない副作用が生じることが多いため、慢性疼痛の治療は困難です2,3,4。von Freyアッセイなどの従来の前臨床疼痛アッセイは、反射的な結果または痛み刺激反応に依存しています5。von Freyアッセイは、機械的異痛症を測定するために何十年にもわたって使用されてきましたが、いくつかの交絡因子、特に実験者バイアスの影響を受けやすい6。口腔顔面痛を評価するためのフォン・フレイ検査の使用は、顔面領域を正常に検査するために動物の頭を固定するために必要な拘束の程度のためにも問題があり、痛みの増強や逆にストレス誘発性鎮痛などの望ましくないストレス効果を引き起こす可能性があります。
痛みを刺激する行動は、偽陽性の結果7の影響を受けやすく、人間の痛みの経験に不可欠な痛みの感情的要素を考慮していません8。したがって、前臨床試験の内容と予測的妥当性を改善するために、痛みの感覚的要素と感情的要素の両方を含む痛み抑うつ行動を評価するオペラント疼痛モデルを使用することへの関心が高まっています。ここで説明するオペラント口腔顔面疼痛評価アッセイは、報酬-葛藤パラダイム9,10,11に基づいている。このアッセイでは、げっ歯類は、正の強化剤を受けて侵害受容刺激を受けるか、報酬を放棄して侵害受容刺激を回避し、それによって経験する痛みの量を制御するかを選択できます。従来の疼痛アッセイとは異なり、オペラントベースのアッセイは実験者に依存せず、好ましくない鎮静効果による偽陽性の結果の影響を受けません。
頭と顔からの有害な感覚は、三叉神経の眼、上顎、および下顎の枝によって運ばれます。三叉神経の損傷または炎症は、熱的または機械的刺激に対する感覚ニューロンの感受性を増加させる12、13、14、15。オペラントベースの口腔顔面痛アッセイは、げっ歯類11、12、16、17、18において三叉神経によって伝達される熱的または機械的口腔顔面痛の自動測定を提供する。非侵害性および有害な刺激による刺激は、OPADを使用して口腔顔面領域の熱的および機械的異痛症および痛覚過敏をテストすることの重要な違いであり、それらは異なる根本的なメカニズムの発現を表す可能性があるためです。
口腔顔面熱アッセイでは、動物は滑らかなサーモデスに顔を押して報酬にアクセスします。サーモデスは、さまざまな低温、高温、高温に設定できるため、中性または侵害受容条件下での行動の評価が可能になります。口腔顔面の機械的アッセイでは、動物はオペラントテスト中にスパイクバーに顔を押し付けます。これらのスパイクはある程度の不快感を引き起こすため、げっ歯類は、顔がサーモデスの滑らかな表面ではなくスパイクに触れると、飲酒量が少なくなる可能性があります。したがって、オペラント口腔顔面機械的アッセイは、様々な程度の機械的侵害受容刺激の効果を評価することができる。我々は以前、OPADが急性熱9、急性機械的19、侵害受容および痛覚過敏を評価するための有用で信頼性の高い方法であることを実証した。
この論文では、機械的侵害受容と過敏症を評価するために、新しく開発されたバージョンのOPADの使用について報告しています。さらに、検証として、OPADで予測可能な反応をもたらす慢性ニューロパチーを誘発するCCI-IONの能力を実証します。また、OPADとその関連ソフトウェアを使用して、げっ歯類の行動データを迅速に取得および分析する方法についても詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>ANY-迷路ビデオ追跡ソフトウェア</td><td>Stoelting</td><td>60000</td><td></td></tr><tr><td>ボトルクリーニングブラシ</td><td>ANY ANY</td><td>ボトル</td><td>とチューブ用の異なるサイズのブラシ</td></tr><tr><td>クロミック腸縫合サイズ 5-0</td><td>Ethicon</td><td>687-G</td><td></td></tr><tr><td>食器用洗剤</td><td>ANY</td><td>Any</td><td>液体</td></tr><tr><td>皿スポンジ</td><td>ANY</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズムバージョン9.3.1&nbsp;</td><td>GraphPadソフトウェア、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>サンディエゴ</tr><tr><td>ホットプレートマグネチックスターラー</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>H4000-HS</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-893-8440</td><td>ピベタル</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>60-001-56</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>Dechra</td><td></td><td>Puralube 獣医軟膏、ワセリン眼科軟膏</td></tr><tr><td>オペラント疼痛評価装置(OPAD)システム</td><td>ストールティング</td><td>67500</td><td></td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td></td><td></td><td>医療用</td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>ANY</td><td>ANY</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックフードラップ</td><td>ANY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Any ポリゴン攪拌棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-512-124</td><td></td></tr><tr><td>再利用可能なガラス ベルゼリウスビーカー (1 L)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック</td><td></td>FB1021000</tr><tr><td>メスブレード#15</td><td>FST</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>小動物麻酔システム</td><td>VetFlo</td><td>VetFlo-1205S</td><td></td></tr><tr><td>スプーン</td><td>任意の</td><td></td>Sprague-Dawley<td></td></tr><tr><td>ラット、雌</td><td>チャールズリバー研究所、&nbsp;USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステレオブーム顕微鏡</td><td>Omano</td><td>OM2300S-GX4</td><td></td></tr><tr><td>加糖練乳</td><td>Borden&nbsp;</td><td></td><td>イーグル ブランド</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>水循環加熱パッドとポンプ</td><td>Gaymar</td><td>モデル TP-500</td><td></td></tr></tbody></table>

口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットにおける神経損傷誘発性機械的過敏症の評価

Assessment of Nerve Injury-Induced Mechanical Hypersensitivity in Rats Using an Orofacial Operant Pain Assay

痛みには感覚的および感情的な要素があります。従来の反射ベースの疼痛アッセイとは異なり、オペラント疼痛アッセイは、げっ歯類の痛みの認知的および動機付けの側面に対処することにより、より臨床的に関連性のある結果を生み出すことができます。この論文は、口腔顔面オペラント疼痛システムを使用してラットの眼窩下神経の慢性狭窄損傷(CCI-ION)後の機械的過敏症を評価するためのプロトコルを提示します。CCI-ION手術の前に、ラットは口腔顔面痛評価装置(OPAD)で訓練され、金属製のスパイクバーとリックチューブと顔面接触しながら加糖練乳を飲むように訓練されました。
このアッセイでは、ラットは、正の強化剤としてミルクを受け取るか、報酬アクセスホールの両側にある小さなピラミッド型のスパイクの垂直列によって生成される嫌悪的な機械的刺激から逃れるかを選択できます。OPADでの2週間のトレーニング後、CCI-ION手術の前に、10分間のテストセッション中に各ラットのベースライン機械的感受性データを5日間記録しました。セッション中、オペラントシステムは、報酬ボトルのアクティブ化(リック)の数と顔の接触、接触時間、最初のリックまでの待ち時間などを自動的に記録します。
ベースライン測定に続いて、ラットはCCI-IONまたは偽手術のいずれかを受けました。このプロトコルでは、機械的過敏症は、舐めの数、最初の舐めまでの潜時、接触の数、および顔の接触に対する舐めの比率(L / F)を測定することによって定量化されました。データは、CCI-IONが舐め回数とL/F比の有意な減少をもたらし、最初の舐めまでの潜時間の増加をもたらし、機械的過敏症を示すことを示した。これらのデータは、前臨床疼痛研究における機械的疼痛感受性を評価するためのオペラントベースの疼痛アッセイの使用を支持しています。

ベースライン時および手術後2週間、4週間、および6週間で、1匹のラットが報酬ボトルをなめ、金属スパイクバーと接触した例を 図3に示します。非侵害期間中、ラットは一般に長時間の飲酒セッション(例えば、ベースライン時およびCCI-ION後の回復時:画像の6週目)を持ち、CCI-ION後、スパイクバーとの顔面接触を長時間維持できないため、舐め回数が減少し(図3A)、偽群の飲酒期間に有意な変化はありません(図3B)。
CCI-IONのラットは、ベースラインと比較して、手術後4週間まで舐め回数が有意に減少し、手術週(0週目)および手術後1週間の最初の舐めまでの潜時が増加しました。偽群に有意な変化はなかった(図4A、B)。CCI-IONは接触数の減少をもたらしましたが、この差は有意ではありませんでした(図4C)。CCI-IONもL/Fの有意な減少を引き起こし、CCI-ION群の減少は偽群の減少よりも大きかった(図4D)。
これらの結果は、CCI-IONに続いて、ラットは報酬ミルクの飲酒行動が少なく、最初の舐めに時間がかかることを示し、侵害行動を示しています。ただし、CCI-IONはミルクに到達したいという欲求に影響を与えません。さらに、CCI-IONのラットのL / Fの減少は、L / Fが非痛みを伴う状態で高いため、機械的過敏症を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig01.jpg"> 図1:試験デザインの概略図。略語:OPAD =口腔顔面疼痛評価装置;CCI-ION = 眼窩下神経の慢性狭窄損傷。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig02.jpg"> 図2:アッセイを行うスパイクバーとラットの代表画像。 スパイクバーはステンレス鋼の金属でできています。バー全体の長さは7 cmです。スパイクの高さは0.3 cmです。スパイク間の距離は0.5 cmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig03.jpg"> 図3:ベースライン時の標準的な10分間のテストセッション中および手術後2週間、4週間、および6週間での、単一のCCI-IONおよび偽手術ラットの代表的な接触試行および舐めデータ。 略語:CCI-ION =眼窩下神経の慢性狭窄損傷;AS =手術後。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig04.jpg"> 図4:スプレイグ・ドーリーラットにおけるCCI-ION後の機械的過敏症の発症 。 (A)CCI-IONを有するラット(n = 8)は、術後4週間まで舐め回数が有意に減少し、(B)手術週(0週目)および術後1週間で最初の舐めまでの潜時が増加した(**p &lt; 0.01、*p &lt; 0.05:手術後数週間対ベースライン。 #p &lt; 0.05: CCI-ION対偽)。偽群では有意な減少は認められなかった(n = 7, p &gt; 0.05)。(C)CCI-IONまたは偽手術は、接触数に有意な変化をもたらさなかった。(D)CCI-IONを投与されたラットは、手術週と3週間後にL/Fの有意な減少を示し、手術後2週間で減少傾向を示した。偽群ラットと比較して、この減少はCCI-IONラットで有意に高く、手術の1週間後に始まり、手術後3週間まで続いた。偽群に有意差はなかった(**p &lt; 0.01、*p &lt; 0.05:術後週対ベースライン、#p &lt; 0.05:CCI-ION対偽)。グラフでは、赤い線は CCI-ION グループを表し、青い線は偽グループを表します。データはSEM±平均値として提示され、有意差は二元配置反復測定ANOVAとそれに続くŠídákまたはDunnettの多重比較検定によって分析されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、オペラントベースの口腔顔面疼痛評価装置を使用した神経因性口腔顔面痛のラットモデルにおける機械的過敏症の評価を記載する。

Pain has sensory and affective components. Unlike traditional, reflex-based pain assays, operant pain assays can produce more clinically relevant results ...

口腔顔面疼痛評価装置(OPAD)は、オペラント報酬競合パラダイムを使用するため、前臨床疼痛研究にとって貴重なツールです。これには、侵害受容、学習、および動機付けが含まれ、これらは人間の痛みの経験と翻訳の有効性の向上において重要です。従来の反射ベースのアッセイに対するOPADの大きな利点は、完全に自動化されているため、関連するストレスの影響を防ぐ動物を拘束する必要がなくなり、実験者のバイアスも減少することです。眼窩下神経のCCI手術を実証するのは、私の研究室の検査技師であるダリス・モンゴメリーです。ミルクドリップトレイ、プレキシガラスケージ、および金属製の床格子を配置することにより、口腔顔面痛評価装置(OPAD)のセットアップから始めます。ケージに配線を取り付け、ボトルホルダーをデバイスの背面にある金属製のポールに滑り込ませます。次に、動物が注ぎ口に到達できるように、報酬ミルクボトルをボトルホルダーに置きます。ホルダーの左側のノブを締めて、ボトルを所定の位置に固定します。次に、フロントパネルのスイッチを入れ、ケージの電源を入れます。プロトコルを設定するには、ソフトウェアを開き、パスワードを入力して、[ログオン]をクリックするか、Enterキーを押します。 [新しい空の実験] をクリックし、[プロトコル] メニューをクリックします。[装置] で [名前のないプロトコル] をクリックし、このプロトコルが使用するモードを選択します。[機器固有のモード]で、[OPADメカニカルケージモード]を選択し、プロトコルに名前を付けます。すべてのケージがオンになっていることを確認したら、プロトコルペインの上部にある[装置]と[アイテムの追加]をクリックしてOPADケージを追加し、[新しいOPADケージ]と[接続されているすべてのOPADケージの追加]を選択して追加します。実験テスト ステージを追加するには、[テスト] タブに移動してステージを選択し、[最初のステージ] タブに移動してステージに名前を付けます。テスト期間として 10 分を追加します。ステージを追加するには、[アイテム タブの追加]、[新しいステージ] の順にクリックします。次に、[追加情報と治療グループ]をクリックしてグループを割り当てます。使用済みの治療グループを確認してから、オプションを選択します ユーザーは手動で動物をグループに割り当てます。プロトコルメニューをクリックして、動物の識別を割り当てます。[追加情報]で[動物ID]をクリックし、[マイIDを使用して動物を参照する]オプションをオンにします。[処理の表示] をクリックして処理名を入力する前に、実験のタイトルを入力して実験を設定します。動物を追加し、[動物の表示] と [動物の追加] をクリックして、処理と動物 ID を割り当てます。テストする動物の数を入力し、その後に[OK]を入力します。動物リストが表示されたら、各ラットの動物IDと治療法を追加します。[プロトコル] メニューに続いて [プロトコルの保存] をクリックして、プロトコルを保存します。ファイル名とソフトウェアパスワードを入力し、[保存]をクリックします。次に、ファイルをクリックして実験ファイルを保存し、[保存](Save)をクリックしてソフトウェアパスワードを入力し、[保存]タブをクリックします。ケージの電源を入れた後、ケージのテストの準備ができていることを示すケージの緑色のライトを探します。保存した実験ファイルをダブルクリックで開きます。パスワードを入力するか、[ログオン] をクリックするか、Enter キーを押します。画面の左側には、動物の数と対応するケージ、その日に実行されているステージ、およびテストステータスが記録されます。ケージの画面で試験動物のIDを観察します。ラットをケージに入れ、対応するケージのボタンを押します。テストが開始されると、緑色のライトがオレンジ色のライトに変わることに注意してください。動物が機械的なスパイクと十分に接触しながら報酬ボトルにアクセスできることを確認してください。画面の右側で、なめと接触の数を示す各動物のチャートを観察します。テストセッションが終了すると、警告音が鳴ります。麻酔をかけたラットを手術用の作業台に置き、拘束します。加熱パッドを使用して体温を摂氏37度に維持します。眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。メスの刃15を使用して、背歯茎と唇の間に小さな切開を行います。メスの刃を使用して軟部組織を取り除き、眼窩下神経の枝、またはIONを明らかにします。鈍く曲がった注射針の助けを借りて、IONの周りに2つの5-Oクロミック腸結紮糸を配置し、組織接着剤を使用して創傷を閉じます。ベースライン時の標準的な10分間のテストセッション中、および手術後2週間、4週間、および6週間中の単一のCCI IONおよびSham操作ラットの接触試行および舐めデータをここに提示する。モデルは、非有害な期間中にラットが長時間の飲酒セッションを持っていることを明らかにしました。怪我の後、動物はスパイクバーとの顔の接触を長期間維持することができず、舐め回数が減少します。シャム群では、飲酒期間に有意な変化は認められなかった。ベースラインでのCCI IONとSham手術ラットの間の平均舐め数は有意差を示さなかった。しかし、CCI IONは術後4週間まで舐め回数を有意に減少させ、術後1週間と神経損傷後1週間の最初の舐めの潜時を増加させ、機械的痛覚過敏を示しました。シャム手術ラットに有意な変化はなかった。OPADを使用している間、牛乳瓶の距離とスパイクの幅を最適化します。データ収集中のエラーを減らすために、この一貫性を保つことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

免れる神経損傷の動物モデルは、残りの腓腹神経はそのままに、脛骨と総腓骨神経の枝をlesioningによって坐骨神経の部分的除神経以下の末梢神経因性疼痛のマウスモデルとしてここで説明されています。機械的異痛症に起因する行動修正は、von...

マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル

手術のシンプルかつ堅牢な行動の結果により、坐骨神経の慢性収縮は、神経因性疼痛の卓越した動物モデルの一つです。手術後24時間以内に、疼痛過敏症は、von...

ラットの坐骨神経と疼痛過敏テストの慢性的なくびれ

このビデオでは、ラットモデルでの手術プロトコルを示し、麻酔の準備から顔面神経損傷の誘導までの手順を詳しく説明しています。このプロトコルは、医学研究における神経再生や外科的技術の研究に役立ちます。...

ラットモデルにおける顔面神経損傷の誘発

このビデオは、ラットモデルで眼窩下神経を結紮することにより、口腔顔面神経障害性疼痛を誘発する方法を示しています。これにより、神経の損傷や炎症が起こり、異常な疼痛シグナル伝達を引き起こし、慢性疼痛の状態を模倣します。これは、口腔顔面疼痛アッセイの研究に使用できます。...

眼窩下神経結紮によるラットモデルにおける口腔顔面神経障害性疼痛の誘発

我々は目を覚まし、意識げっ歯の痛み行動の評価のためのユーザーフレンドリーな、高スループットオペラントシステムを提示する。口腔顔面疼痛評価デバイス（OPAD）はテストのより人道的な方法を提供するため、報酬/紛争パラダイムを通して痛みを評価することができます。このプロトコルは、げっ歯類から、より臨床的に関連すると翻訳データが得られます。...

侵害受容性行動の変化を測定するためにオペラント口腔顔面疼痛評価デバイス（OPAD）の使用

食事の持続時間の延長は、顔面痛を有するヒトの保護行動と同様のげっ歯類における顔面のノシシブ行動を表す。食べることは、訓練や動物操作を必要とせず、皮質の参加を必要とし、他の実験的に誘発された行動と競合せず、このアッセイを代替反射またはオペラの測定と区別する行動である。...

げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間

この原稿は、三叉神経障害性疼痛を研究するためのげっ歯類のモデルについて説明しています。記載されている方法には、ラットの眼窩下神経の慢性狭窄損傷を行う外科的処置、および持続的な痛みおよび異痛症を示す自発的および誘発的な行動の変化を測定するための術後行動試験が含まれます。...

三叉神経因性疼痛を研究するためにラットの眼窩下神経の慢性狭窄傷害（ION-CCI）

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マウスの神経因性疼痛の改良温存神経損傷手術モデル

部分的な坐骨神経結紮は、熱的および機械的刺激に対する誇張された反応を特徴とする、長期にわたる慢性神経因性疼痛を誘発する。神経因性疼痛のこのマウスモデルは、疼痛管理のための革新的な治療法を研究するために一般的に使用されています。この記事では、標準化と再現性を向上させるための外科的手順について詳しく説明します。...

坐骨神経部分結紮術:新規治療法の抗侵害受容効果を研究するための慢性神経因性疼痛のマウスモデル

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三叉神経障害性疼痛を研究するためのマウスにおける遠位眼窩下神経の慢性狭窄損傷(DIoN-CCI)

学ぶ口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットの神経損傷誘発性機械的過敏症の評価法。自動化されたOPAD装置により拘束ストレスを排除し、舐め行動と接触試行を測定することで、神経障害性疼痛の機序解明に貢献する信頼性の高い疼痛評価を実現します。

口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットにおける神経損傷誘発性機械的過敏症の評価

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