Name: ゼブラフィッシュの幼生を潜在的な放射線増感剤またはプロテクターを評価するためのモデルとして (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚を用いた放射線ベースの薬物スクリーニング法。放射線増感剤やプロテクターの評価、放射線毒性の測定、がん放射線治療への応用可能性を探索する実験手順を解説します。

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SSの研究室とRKSの研究室は、インドのDBTとSERBからの助成金によって資金提供されています。APMは、インド政府のICMRフェローシップの受賞者です。DPは、インド政府のCSIRフェローシップの受賞者です。国連は、インド政府であるDST-Inspireフェローシップの受賞者です。 図 2 は Biorender (https://biorender.com) を使用して生成しました。

本研究は、ブバネシュワールの生命科学研究所の動物倫理委員会のガイドラインに従って事前承認を得て実施されました。ゼブラフィッシュの維持と繁殖はすべて28.5°Cの常温魚養殖施設で行い、胚は28.5°Cの生物学的酸素要求量(BOD)インキュベーターで維持しました。 ここでは、ゼブラフィッシュAB株を用い、病期分類はKimmel et al.54に従って行った。X線照射は6 hpf(遮蔽期)で行われ、120 hpfまで異なる表現型が観察された。
1. 繁殖のセットアップと胚の採取
<ol><li>飼育タンク(ポリカーボネート製、容量1L、 材料表参照)をセットします。システム水(pH、6.8-7.5、導電率、500μS、温度、28.5°C)を、その体積の約40%をカバーする飼育タンクに注ぎます。仕切りをタンクに入れて、女性用と男性用の2つのチャンバーを作成します。</li>
	<li>親水槽から、網の助けを借りて健康な雌2匹と健康な雄1匹を慎重に集め、それぞれ半分に分け、28.5°Cで一晩(最低10時間)暗所に保管します。</li>
	<li>翌朝、仕切りを取り外し、繁殖水槽を乱さずに魚を交配させます。 注:女性は産卵を開始し、魚が56,57,58交尾を許可された後、10〜15分以内に卵が水槽の底に横たわっているのが見られます。</li>
	<li>産卵後、魚を水槽に戻し、ストレーナーを使用して繁殖水槽から胚を回収し、システム水で適切に洗浄し、収集した卵をE-3培地(4.94 mMのNaCl、0.17 mMのKCl、0.43 mM CaCl 2、0.85 mMのMgCl2塩、1%w/vのメチレンブルー、 材料表を参照)。</li>
	<li>卵子を解剖顕微鏡で観察し、パスツールピペットを使用して未受精胚または死死胚を取り除き、受精卵を含むペトリプレートをE-3培地中の28.5°Cのインキュベーターで適切に増殖および維持するために保管します。 注:未受精卵は、凝固した絨毛膜または絨毛膜内の破裂した細胞を伴う乳白色の外観で識別できます。未受精卵とともに、卵割を受けていない卵子や、卵割中の不規則性、例えば非対称性、小胞の形成、絨毛膜の損傷などの奇形のある卵子、または活発に発育していない卵は、採取された胚を健康に保ち、培地を清潔に保つために廃棄する必要があります7,56。</li>
</ol>2. 放射線実験のための胚のモニタリングと選抜
<ol><li>解剖顕微鏡で成長する胚を監視し、適切なステージ7,54を特定し、死んだ胚や不健康な胚を取り除きます。放射線と薬物の投与量は特定の原腸形成段階で投与されるため、適切な胚の病期分類を確保します。 注:培養皿の培地のレベルと品質を毎日確認してください。死んだ胚を取り除くとともに、24時間ごとに培地を交換します。パスツールピペットは、胚の摘出や培地の交換に好まれます。</li>
	<li>実験を開始する前に、パスツールピペットの助けを借りて、実験プレートに健康な胚を慎重に分配します。実験グループごとに、15〜20個の胚を採取します。 注:望ましい発生段階の健康な胚のみを実験プレートに入れます。薬物治療を6 hpfの胚で行わなければならないと仮定し、少なくとも30〜60分前に実験プレートに播種を開始します。</li>
</ol>3.薬物治療
<ol><li>ゼブラフィッシュの胚に所望の濃度の薬剤を加えます。薬物含有E-3培地は、事前に十分に準備してください。ゼブラフィッシュの胚を治療するための作業培地を調製する前に、薬剤の原液に未溶解の薬剤が含まれていないことを確認してください。</li>
	<li>放射線スクリーニングのために培地に薬物を添加する前に、薬物の濃度のグレードで薬物の細胞毒性効果を確認してください。OECDガイドラインに従って、評価中の医薬品のLC50を評価します59、60、61。 注意: 照射時間中や観察時間中にプレートや皿を動かすときは注意してください。この処理中にプレートが乱れ、培地がウェルから漏れたり、胚がそれぞれのウェルからこぼれたりして、近くのウェルを汚染して実験を台無しにする可能性があります。</li>
</ol>4. X線照射
<ol><li>放射線実験を設定する際には、対照群/非照射群と放射線のみのグループを含めます。同様に、薬物スクリーニングを実施する際に、スクリーニング実験で投与されたものと同じ濃度の薬物を放射線とともに投与する別のグループを含めます。 注意: ウェルプレートまたは培養皿の蓋と底の両方にラベルを付けて、蓋の位置を間違えないようにします。</li>
	<li>放射線遮蔽体が余分なウェルを覆い、放射線から保護できる場合、他のウェルが特定の放射線量に曝露されている場合は、ウェルプレートに胚を分配します。それ以外の場合は、個々のプレートまたはディスクを使用して、放射線量ごとに胚を播種します。</li>
	<li>X線照射装置( 材料表参照)の電源を入れ、装置の初期化とウォームアップを開始します。 注意: ソースから被写体までの距離(SSD)の値は50cmである必要があります。異なるSSDを再び使用することができるため、標準化が必要です。</li>
	<li>実験プレートを装置内部の照射器の下に中央に置き、プレートがX線源の真下にあることを確認してから、線量(例:5GY)を設定してX線を開始します。 注:プレートをパラフィンフィルムで密封して、インキュベーターから照射器へ、および照射器から照射器に戻るプレートの輸送中に不要なこぼれや汚染を防ぎます。</li>
	<li>照射終了後、プレートを取り出し、マシンプログラムをシャットダウンし、マシンの電源を切り、照射直後に顕微鏡でプレートを確認してください。死んだ胚を取り除き、プレートを28.5°Cのインキュベーターに戻します。 解剖顕微鏡で評価した後、死んだ胚の数を記録します。 (注)発育段階の違いにより放射線の影響が大きく影響する可能性があるため、個々のグループ間で指定線量を照射する。 注意: X線装置を操作するときは、適切な保護対策を講じてください。</li>
</ol>5. データ収集、イメージング、分析
<ol><li>放射線照射後24時間ごとなど、所定の時間間隔でデータを収集します。生存率、孵化効率、発達段階、心拍数、体と尾の湾曲、心膜浮腫、卵黄嚢の伸展、小頭症、水泳膀胱の発達、一般的な運動性または活動など、考えられるすべての観察を記録します62,63,64。</li>
	<li>画像をキャプチャするには、きれいなスライドで代表的な胚を選択し、顕微鏡で胚を確認し、特定の方向に向け、 画像をクリックします。グループと時間に応じて画像ファイルの名前を変更します。 注意: 異なる時間間隔で写真をキャプチャする場合は、同じ倍率と照明を使用する必要があります。</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。

ゼブラフィッシュは、数種類のがん研究を含む多くの研究で貴重なモデルとして使用されています。このモデルは、大規模な薬物スクリーニングのための有用なプラットフォームを提供する67,68。他の毒性評価法と同様に、放射線および/または薬物治療時の主要な生物学的変化の定量的評価は、このプロトコルの最も重要な部分です。この種の研究では、生存が毒性を観察するための唯一の基準であってはなりません。それは、適切なスコアリングシステムによる身体的または発達的欠陥の評価でサポートされる必要があります。この場合も、72 hpfまでは、胚が5 GY、10 GY、および20 GYのX線被曝線量に曝露されたグループ間で胚の生存率に大きな違いはありません。しかし、これらの特定の線量で胚の全体的な形態と表現型をチェックすると、X線毒性は生存グラフで表示されるよりも深刻であることは明らかです。これらの用量での胚の形態学的奇形の重症度は、全体的な体のサイズの変化、発達の欠陥、重要な臓器の奇形、および全体的な活動の変化を反映して非常に高くなっています。.15 ...

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、過去30年間にわたって研究で広く使用されてきた有名な動物モデルです。実験室の条件下で飼育や繁殖が簡単な小型の淡水魚です。ゼブラフィッシュは、さまざまな発生および毒物学的研究に広く使用されています1,2,3,4,5,6,7,8。ゼブラフィッシュは繁殖力が高く、胚発生が短いです。胚は、さまざまな発生段階の追跡に適しており、視覚的に透明であり、さまざまな遺伝子操作およびハイスループットスクリーニングプラットフォーム9,10,11,12,13,14に適しています。さらに、ゼブラフィッシュは、その発生過程とさまざまな有毒物質または因子の存在下でのさまざまな奇形を実体顕微鏡または蛍光顕微鏡法を使用して簡単に研究できるトトおよびライブイメージングを提供します7,15,16。
放射線療法は、がんの治療に使用される主要な治療法の1つです17、18、19、20、21、22、23、24。しかし、がん放射線治療では、悪性細胞を殺しながら正常な健康な細胞を死滅から守ったり、高エネルギー放射線を含む治療中に人間の健康を保護したりするための潜在的な放射線防護剤が必要です25,26,27,28,29。逆に、強力な放射線増感剤は、特に標的療法や精密治療において、悪性細胞を殺すための放射線の効率を高めるために研究されています30,31,32,33。したがって、強力な放射線防護剤と増感剤を検証するために、セミハイスループットの薬物スクリーニングに適しており、放射線効果を測定可能に示すモデルが強く求められています。いくつかの利用可能なモデルは、放射線研究で使用され、薬物スクリーニング実験に関与しています。しかし、高等脊椎動物や、最も一般的に使用されているin vivoモデルであるマウスでさえ、これらのモデルを用いたスクリーニング実験の設計には時間とコストがかかり、困難であるため、大規模な薬物スクリーニングには適していません。同様に、細胞培養モデルは、さまざまなハイスループット薬物スクリーニング実験に理想的です34,35。しかし、細胞培養を含む実験は、培養中の細胞が増殖条件や動態に応じて挙動を著しく変化させる可能性があるため、必ずしも実用的、再現性が高く、信頼性が高いとは限りません。また、さまざまな種類の細胞が差動放射線感作を示します。特に、2Dおよび3D細胞培養システムは生物全体のシナリオを表していないため、得られた結果は実際の放射毒性のレベルを再現していない可能性があります36,37。この点で、ゼブラフィッシュは、新規の放射線増感剤および放射線防護剤のスクリーニングにおいていくつかの利点を提供します。取り扱いの容易さ、大きなクラッチサイズ、短い寿命、急速な胚発生、胚の透明性、および小さな体サイズにより、ゼブラフィッシュは大規模な薬物スクリーニングに適したモデルになっています。以上の利点により、実験を短時間で容易に繰り返すことができ、マルチウェルプレートの解剖顕微鏡下で容易に効果を観察することができる。したがって、ゼブラフィッシュは放射線研究を含む薬物スクリーニング研究で人気を集めています38,39。
放射線修飾剤をスクリーニングするための正真正銘のモデルとしてのゼブラフィッシュの可能性は、さまざまな研究で実証されています40,41,42,43,44,45。ゼブラフィッシュモデルでは、ナノ粒子DF1、アミフォスチン(WR-2721)、DNA修復タンパク質KU80、ATM、移植造血幹細胞などの潜在的な放射線修飾剤の放射線防護効果、およびフラボピリドールやAG1478などの放射線増感剤の効果が報告されています19,41,42,43,44,45,46.同じシステムを用いて、DF-1(フラーレンナノ粒子)の放射線防護効果を全身レベルと臓器特異的レベルの両方で評価し、放射線防護体スクリーニングのためのゼブラフィッシュ胚の使用もさらに調査された47。最近、ケルルート蜂蜜はゼブラフィッシュの胚の放射線防護剤として報告され、胚の生存率を高め、臓器特異的な損傷、細胞DNAの損傷、およびアポトーシスを防ぐことがわかった48。
同様に、ハンチの反応によって生成されたポリマーの放射線防護効果は、ゼブラフィッシュの胚でハイスループットスクリーニングでチェックされ、その保護は主に細胞をDNA損傷から保護することによって与えられた49。以前の研究の1つでは、親油性スタチンフルバスタチンが、このアプローチでゼブラフィッシュモデルを使用して潜在的な放射線増感剤として発見されました50。同様に、金ナノ粒子は理想的な放射線増感剤であると考えられており、多くの研究で使用されています51,52。
ゼブラフィッシュの胚発生は、単細胞の受精卵が分裂して2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、32細胞、64細胞を形成する最初の3時間での切断を伴い、実体顕微鏡で容易に識別できます。その後、128個の細胞(受精後2.25時間、hpf)で胞胚期に達し、細胞は15分ごとに倍増し、256細胞(2.5hpf)、512細胞(2.75hpf)、わずか3時間で1,000+細胞に達します(図1)。4時間で、卵は球の段階に達し、続いて胚の塊7,53,54にドーム形状が形成されます。ゼブラフィッシュの原腸形成は5.25 hpf54から始まり、そこでシールド段階に達します。シールドは、生殖輪の片側への細胞の急速な収束移動を明確に示しており(図1)、容易に識別できるガスtrulate胚の顕著で明確な段階です53,54。胚への放射線被曝は発生のどの段階でも起こりうるが、原腸形成中の放射線被曝は、より明瞭な形態学的変化を有し、放射線誘発毒性のより良い読み出しを容易にする可能性がある55。同様に、胚への薬物投与は、早ければ2HPF54から開始することができる。

<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3335</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>B.O.Dインキュベーター</td><td>Oswald</td><td>JRIC-10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>10101-41-4</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>1.0 Lの外部タンク</td><td>増殖タンク Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td>ポリカーボネート</td></tr><tr><td>ガラスペトリプレート</td><td>Borosil</td><td>3165A75</td><td>ガラス</td></tr><tr><td>グラフパッドプリズム</td><td>グラフパッドソフトウェア株式会社</td><td></td><td>バージョン5.01</td></tr>ク<tr><td>ライン凹面スライドHimedia</td><td></td><td>GW092-1PK</td><td>ガラス</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr>メ<tr><td>チレンブルー水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66720-100G</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ターソン380020</td><td></td><td>パラフィンフィルム</td></tr><tr><td>パスツールピペットHimedia</td><td></td><td>PW1212-1X500NO</td><td>ポリエチレン</td></tr><tr><td>1.0 Lの飼育タンク用のプラスチック穴あき内部タンク</td><td>1.0</td> Lの飼育タンク用<td>ZB10BTI</td><td>ポリカーボネート</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製ディバイダー</td><td>1.0</td> Lの飼育タンク用<td>ポリカーボネート製ポリカーボネー</td>ト製<td>ZB10BTD</td> ポリカーボ</tr><tr><td>ネート製蓋</td><td>ZB10BTL</td>ポリ<td>カーボネー</td>ト製塩化<td></td></tr><tr><td>カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット</td><td>SRL</td><td>1949181</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 ライカ M205FA</td><td>ライカ</td><td>モデル/PN MDG35/10 450 125</td><td></td></tr><tr><td>X-RAD 225 精密X線</td> 精密<td>X線</td>X<td>線 X-RAD 225XL</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの幼生を潜在的な放射線増感剤またはプロテクターを評価するためのモデルとして

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデルとしては維持が容易であり、ユニークで便利なモデルシステムの特徴を示すため、さまざまな研究に広く利用されています。増殖性の高い細胞は放射線によるDNA損傷を受けやすいため、ゼブラフィッシュの胚は放射線研究の最前線の in vivo モデルです。さらに、このモデルは、主要な生物学的事象と関連する応答とともに、放射線とさまざまな薬物の影響を短時間で予測します。いくつかのがん研究でゼブラフィッシュが使用されており、このプロトコルは、放射線療法とがんの文脈での放射線修飾剤の使用に基づいています。この方法は、放射線照射された胚と対照胚(非照射)に対するさまざまな薬物の効果を検証するために容易に使用でき、したがって、薬物を放射線増感薬または保護薬として識別します。この手法は、ほとんどの薬物スクリーニング実験で用いられていますが、実験の詳細やX線被曝を背景とした毒性評価は、限定的であるか、短時間しか取り上げられていないため、実施が困難でした。このプロトコルでは、この問題に対処し、手順と毒性評価について詳細な図で説明します。この手順では、ゼブラフィッシュの胚を放射線研究や放射線ベースの薬物スクリーニングに使用し、高い信頼性と再現性を実現するための簡単なアプローチを説明しています。

プロトコルの全体的なレイアウトを図 2 に示します。放射線の影響と線量依存的な特性評価は、以下の分析で評価されました。
X線誘発毒性評価 実体顕微鏡を用いて、薬物治療および/または放射線照射後の以下の異常を評価し、特徴付けた。OECDガイドライン61によると、魚類の毒性評価では、胚の凝固、体節形成の奇形、卵黄嚢からの尾の非剥離、心拍の減少または欠如を含む4つの主要な頂端評価項目を含め、全体的な毒性を分析した61。急性毒性は、上記の異常のいずれかで陽性の結果に基づいて決定されました。これら4つの主要評価項目に加え、脊椎・尾尾の屈曲、頭部奇形、小頭症、発達障害、心膜浮腫、卵黄嚢変形、水泳膀胱変形、眼構造変化の形態観察も行いました(図3C 、 図4</stron...

ゼブラフィッシュは最近、潜在的な放射線修飾因子を検証するためのモデルとして利用されています。本プロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚を放射線ベースのスクリーニング実験に使用する詳細な手順と、さまざまな治療と放射線の効果を評価するためのいくつかの観察アプローチについて説明します。

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚を放射線ベースのスクリーニング実験に使用する詳細な手順と、さまざまな薬物や放射線の治療を評価するためのいくつかの観察アプローチについて説明します。これは、ゼブラフィッシュの胚を用いたX線曝露を含むセミハイスループットの薬物スクリーニングを設定するのに役立ち、放射線毒性の評価と使用されるさまざまな薬物の有効性の評価に役立ちます。この手順は、潜在的な放射線増感剤またはプロテクターとしてさまざまな薬物をスクリーニングおよび検証または評価するために使用でき、がん放射線療法または放射線生物学の分野でさらに調査または使用できます。まず、解剖顕微鏡で成長する胚を観察します。適切な段階を特定し、死んだ胚や不健康な胚を取り除きます。適切な胚の病期分類が放射線であり、特定の原腸形成段階で薬物投与が行われることを確認します。実験を開始する前に、パスツールピペットの助けを借りて、実験プレートに健康な胚を慎重に分配します。実験グループごとに、15〜20個の胚を採取します。放射線実験を設定する際には、非照射群と放射線のみの対照群を含めます。放射線遮蔽体が余分なウェルを覆い、放射線から保護し、他のウェルが特定の放射線量に曝されている場合は、ウェルプレートに胚を分配します。それ以外の場合は、個々のプレートまたはディスクを使用して、放射線量ごとの胚を確認します。X線照射装置の電源を入れ、装置の初期化とウォームアップを開始します。実験プレートを中央の装置内部の照射器の下に置き、プレートがX線源の真下にあることを確認します。そして、線量を設定し、X線を開始します。照射終了後、プレートを取り出し、マシンプログラムをシャットダウンし、マシンの電源を切り、照射直後に顕微鏡でプレートを確認してください。死んだ胚を取り除き、解剖顕微鏡で評価した後、その数を記録します。プレートを摂氏28.5度のインキュベーターに戻します。放射線照射後、所定の時間間隔でデータを収集します。生存率、孵化効率、発達段階、心拍数、体と尾の湾曲、心膜浮腫、卵黄嚢の伸展、小頭症、水泳嚢の発達、一般的な運動性または活動など、考えられるすべての観察を記録します。画像をキャプチャするには、きれいなスライドで代表的な胚を選択します。顕微鏡で胚を確認し、特定の方向に向けます。受精後6時間で放射線照射された胚の生存曲線は、対照群および2グレイおよび5グレイに曝露された胚において、胚に有意な死亡はなかったことを示している。1分あたりの心拍数は、X線照射量の増加に伴って心拍数が大幅に減少することを示唆していた。対照群では、24時間間隔で心拍数が増加するのが見られました。心拍が大幅に低下したため、15グレイと20グレイの放射線に曝露された胚では、重度の心血管奇形が疑われます。異なる表現型および発生上の欠陥が描かれ、異なる時点で異なる線量の放射線に被曝した胚について評価される。脊椎や尾の曲がり、頭部奇形や小頭症、発達の欠陥、心膜浮腫、卵黄嚢の変形、水泳膀胱の変形、眼の構造の変化などの形態学的観察も行われました 私たちが実証したプロトコルでは、健康な胚の選択、照射器内の胚の適切な配置、交差異常の適切な評価がこの手順の鍵です。

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Research

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Cancer Research

がん研究

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ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

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ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

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初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

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