網膜組織における免疫染色カスパーゼ-9の定量

このプロトコルは、複雑な組織における機能的に関連するカスパーゼを同定、検証、および標的化するための詳細な免疫組織化学的方法を提供します。この技術の主な利点は、細胞型特異的なアポトーシスおよび非アポトーシスカスパーゼ-9機能の調査を可能にし、関心のある他の複雑な組織およびカスパーゼに適用できることです。カスパーゼの機能を理解することは、細胞生物学における現在の知識を拡大するのに役立ち、疾患への関与による潜在的な治療標的を特定するのにも有利です。

染色された網膜切片の共焦点顕微鏡画像を使用して、カスパーゼレベルの定量を開始します。これを行うには、405、470、555、および640チャンネルの画像ファイルをフィジーのコンソールにドラッグします。画像、カラー、および結合チャンネルタブをクリックして、ファイルに色を割り当てます。

次に、画像スタックとZプロジェクトをクリックしてZスタックを圧縮します。投影タイプとして最大強度を選択します。画像をクリックしてからカラーチャンネルのツールをクリックして、チャンネルのインターフェイスを開きます。

次に、明るさとコントラストのインターフェースを開きます。チャンネルごとのパラメータを選択するには、チャンネルのタブに移動し、チャンネルを1つ選択します。背景の上にカーソルを置き、ピクセル値に注釈を付けます。

次に、カスパーゼ発現セルにカーソルを置き、ピクセル値に注釈を付けます。パラメータをテストするには、明るさとコントラストのインターフェイスに移動し、[選択]をクリックします。表示される最小値またはカスパーゼ表現セルのピクセル値を差し込みます。

次に、[OK]をクリックする前に、最大表示値または背景ピクセル値を差し込みます。盲検組織からランダムな画像を選択し、チャンネルごとにパラメータの選択を繰り返して、すべてのチャンネルのパラメータをテストします。パラメータを設定したら、画像ファイルを開き、Zスタックを圧縮します。

カスパーゼチャネルの明るさとコントラストのパラメーターと、血管マーカーチャネルのイソレクチンを追加します。ポイントツールを使用して、陽性領域の読み出しとしてカスパーゼ発現を伴う血管マーカーの共局在を使用して、陽性血管領域の数を定量化します。次にフックを陽性の神経領域のマーカーとして用いて、陽性の血管領域の数を定量化する。

画像ごとにスプレッドシートの値に注釈を付け、セクションごとに値を平均します。セクション値を平均し、それが目ごとの読み出しになります。プロトコルは、カスパーゼの細胞局在とカスパーゼが発現するニューロン網膜層を特定しました。

網膜断面は、フックで染色した場合、網膜神経節層またはRGL、核間層またはINL、および外顆粒層またはONLの網膜核の視覚化を可能にした。断面では、網膜血管は切断され、RGLとINLの間、およびINLとONLの間の網状層を供給して分離しているように見えました。網膜断面はまた、網膜静脈閉塞の1日後に高度に調節されたカスパーゼ-9を同定した。

カスパーゼ-9阻害は、内皮細胞ノックアウトマウスにおけるニューロンカスパーゼ-7発現を低下させるのにより効果的であり、内皮カスパーゼ-9の機能的関連性を検証しました。代表的な解析は、カスパーゼ-9活性の阻害が網膜静脈閉塞後のカスパーゼ-7発現を薬理学的に遮断することを示した。この技術の成功は、データの一貫性、妥当性、信頼性を確保するために、慎重な組織調製、IHCおよび顕微鏡イメージングに依存しています。

この方法は、カスパーゼシグナル伝達の半定量的比較のためにウェスタンブロッティング分析と組み合わせることができます。この技術は、RVOにおける活性カスパーゼ-9を標的とする治療アプローチの有効性を調べるステップを提供した。このアプローチは、脳を含む他の組織にも適用できます。