Name: がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶATAC-seq最適化法で上皮細胞のクロマチンアクセシビリティを解析し、がんエピジェネティクスの病態メカニズムと治療戦略設計への応用を探索する。

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優れた技術支援を提供してくれたUNDゲノミクスコア施設に感謝します。
この研究は、国立衛生研究所[P20GM104360からM.T.、P20 GM104360からA.D.]によって資金提供され、ノースダコタ大学医学部および健康科学部、生物医科学部[M.T.へ]から提供されたスタートアップ資金によって資金提供されました。

1.実験開始前の準備
<ol><li>溶解バッファーストックを調製します。 注:最適な核分離バッファーは、細胞タイプごとに異なる場合があります。原著論文8で使用した低張バッファーとCSKバッファー12,13の両方を、トリパンブルー染色を使用して各細胞タイプについてテストすることをお勧めします。<ol><li>低張緩衝液(グリーンリーフ緩衝液)を調製するには、10 mM トリス塩酸塩 pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1% NP-40を混合します。</li>
		<li>CSKバッファーを調製するには、10 mM パイプpH 6.8、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl2、および0.1% Triton X-100を混合します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞培養条件が最適であることを確認してください。光学顕微鏡で細胞を調べて、アポトーシスのレベルが上昇していないことを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の電源を入れて4°Cにします。</li>
</ol>2.細胞収穫
<ol><li>細胞の培養物から培地を<80%のコンフルエントで吸引します。細胞は通常、必要な細胞数、処理などに基づいて、35mmまたは60mmのディッシュで増殖します。</li>
	<li>細胞を1 mLまたは3 mLのPBSで洗浄します。</li>
	<li>0.5 mLまたは1 mLのトリプシンを加え、2〜3分間インキュベートします(細胞の種類によって異なります)。1 mLピペットを慎重に使用してよく混ぜます。</li>
	<li>1 mLまたは2 mLの培地をプレートに加え、よく混ぜます。15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を15 mLチューブで300 x gで3分間遠心分離します 。 注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞を1 mLまたは2 mLの培地に再懸濁します。 注:均質なシングルセル溶液を調製することが重要です。組織の場合、Dounceホモジナイザーを使用して組織を均質化し、大きな細胞の塊や凝集体を最小限に抑えることができます。一部の組織では、生細胞を単離して単一細胞溶液を得るために、ろ過(セルストレーナーなど)および/またはFACSセルソーティングが必要です。</li>
	<li>セルカウンターを使用してセルをカウントします。 注:この研究では、自動セルカウンター(材料表)を使用しました。</li>
	<li>必要な細胞量(例えば、細胞数に基づいて1 x 106 細胞を含む体積)を300 x g で室温(RT)で3分間遠心分離します。</li>
	<li>1 x 106 細胞を含む細胞ペレットを1 mLのコールドPBSに再懸濁します。 注:細胞数が1 x 10 6細胞未満の場合は、冷たいPBS容量を減らして、同じ濃度(1 x 106細胞/ mL)で細胞溶液を調製します。</li>
</ol>3.細胞溶解
<ol><li>25 μL(= 2.5 x 104 細胞)を新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します 注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。</li>
	<li>25 μLの溶解バッファーを加え、穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁します。氷上で5分間インキュベートする</li>
	<li>4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します。 注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。</li>
</ol>4. Tn5 タグメンテーション
<ol><li>直ちにペレットを25 μLのTn5反応混合物に再懸濁します。Tn5反応混合物は以下の通りである:12.5 μLの2xタグメンテーションDNAバッファー(TDバッファー)、1.25-5 μLのTn5トランスポザーゼ、および11.25-7.5 μLのヌクレアーゼフリー水。 注:Tn5の標準濃度は、2.5 x 104 細胞で2.5μLです。</li>
	<li>37°Cで30分間インキュベートします。 注意: 10分ごとに溶液を混合します。</li>
</ol>5. DNA精製
注:増幅する前に精製が必要です。DNA精製は、MinElute PCR精製キット(材料表)を使用して行われます。
<ol><li>5 μLの3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)を加える。</li>
	<li>直ちに125 μLのバッファーPBを加え、よく混合します。</li>
	<li>ステップ2から始まるPCR精製キットのプロトコルに従ってください。<ol><li>スピンカラムを2 mLの収集チューブに入れます。</li>
		<li>サンプルをスピンカラムに適用し、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。</li>
		<li>フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。</li>
		<li>750 μLのバッファーPEをスピンカラムに加え、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。</li>
		<li>フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。</li>
		<li>スピンカラムを5分間遠心分離して、メンブレンを完全に乾燥させます。</li>
		<li>フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに入れます。</li>
		<li>10 μLのバッファーEBでDNA断片を溶出します。</li>
		<li>カラムをRTで1分間放置します。</li>
		<li>RTで17,900 x g で1分間遠心分離し、DNAを溶出します。</li>
	</ol></li>
</ol>6. PCR増幅
注:配列決定には、転置(タグ付き)DNAのPCR増幅が必要です。この例では、Nexteraキットアダプター(材料表)を使用しました。本研究で用いたプライマーを 表1に列挙する。
<ol><li>200 μL PCRチューブ(各サンプルにつき50 μL)で以下のPCR反応をセットアップします。PCR反応混合物は以下の通りである:溶出したDNA10 μL(ステップ5)、2.5 μLの25 mMアダプター1、2.5 μLの25 mMアダプター2、25 μLの2x PCRマスターミックス、および10 μLのヌクレアーゼフリー水</li>
	<li>PCR増幅プログラムパート1を実行します(表2)。 注:初期増幅では、標準のサーマルサイクラーを使用するすべてのサンプルに同じ条件が使用されます。</li>
	<li>リアルタイム qPCR (サンプルあたり合計 14.5 μL)<ol><li>PCR増幅パート1からの5 μLの生成物(ステップ6.2)を使用して、今度はSYBR金を含む以下の反応を設定し、リアルタイムPCRマシンで検出します。</li>
		<li>ステップ6.2のPCR産物5 μL、SYBR金0.75 μL(希釈1000倍)、2倍PCRマスターミックス5 μL、ヌクレアーゼフリー水3.75 μLのPCR反応混合物を調製します。 注:各サンプルの飽和に達する前のライブラリ増幅の正確なサイクル数は、PCR10のGCおよびサイズバイアスを低減するためにqPCR(表3)によって決定されます。SYBR金をヌクレアーゼフリー水で希釈した。希釈液を作るために、1 μLのSYBR Gold(ストック濃度10,000倍)を999 μLのヌクレアーゼフリー水に加えました。表3に記載されているRT-qPCRの実行時間は約60分です。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ 6.3 の実行パラメーターを使用して、必要な追加 PCR サイクル数を決定します。<ol><li>サイクル数 = 1/4 最大(飽和)蛍光強度(通常 3 または 4 PCR サイクル)</li>
	</ol></li>
	<li>PCR増幅プログラムパート2(容量= 45 μL; 表 4): サイクル番号を決定したら、手順 6.4.1 で計算された追加のサイクルを使用して PCR を設定します。たとえば、計算されたサイクル数が3の場合、以下のプログラムで3サイクルを設定します。合計サイクルは 8 (手順 6.2 では 5 回、手順 6.5 ではさらに 3 回) になります。</li>
</ol>7.ビーズ精製
注:ここでは、AMPure XP(材料表)ビーズを使用しました。
<ol><li>前のステップで増幅したPCR産物に、RTで150 μLのビーズを加えます。 注:このプロセスでは、自家製のAMPureビーズ14 を使用できます。</li>
	<li>RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを磁気スタンドに5分間置きます。</li>
	<li>上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>ビーズを200μLの80%エタノールで洗浄します。 注:80%エタノールは新鮮に調製する必要があります。</li>
	<li>手順 7.4 を繰り返します。</li>
	<li>エタノールを完全に除去します。</li>
	<li>サンプルをRTで10分間風乾します。</li>
	<li>50 μLの溶出バッファー(10 mM Tris-HCL pH 8.0)で再懸濁します。</li>
	<li>ビーズ精製(ステップ7.1.-7.9)を繰り返して、プライマーの汚染をさらに最小限に抑えます。</li>
</ol>8. DNA濃度と品質チェック
<ol><li>核酸定量キット(材料表)を用いてDNA濃度を測定する。</li>
	<li>SYBR Gold(0.5x TBE、1.5%アガロースゲル)または自動電気泳動システム(TapeStation、バイオアナライザーなど)を使用したゲル電気泳動によって、増幅されたDNA断片を確認します。</li>
</ol>9. シーケンシング
<ol><li>増幅されたDNAサンプル12、13を用いてハイスループットシーケンシングを行う。 注:増幅されたDNAサンプルは、ハイスループットシーケンシングの準備ができています。ヌクレオソームDNAフラグメント情報を保持するには、シングルエンドシーケンシングよりもペアエンドシーケンシングが推奨されます。DNA断片の両端は、トランスポザーゼが結合する場所を示す。オープンクロマチン領域のマッピングには、通常、サンプルあたり3,000万リードで十分です。</li>
</ol>10.データ分析
<ol><li>基本通話品質に基づくデータ フィルタリング: 最小平均基本品質スコアを 20 (99% の精度) に設定します。</li>
	<li>アダプターのトリミング: 適切なツールを使用してアダプターのシーケンスを削除します。 注: Trim Galore ラッパー ツール (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) を使用してアダプタ シーケンスを削除しました。イルミナTn5によって調製されたATAC-seqライブラリでは、次の配列がアダプタ配列として使用されます:CTGTCTCTTATACACATCT。アダプターの汚染を認識するための最小シーケンス長は 5 に設定されています。</li>
	<li>ゲノムマッピング:以下のパラメータ「-I 0 -X 2000 -m 1」15を使用して、Bowtieでリードを適切なゲノムにマッピングします。MDA-MB-231基底乳がん細胞からのマッピング品質の例を以下に示します。 少なくとも1つのアライメントが報告された読み取り:52.79% アライメントに失敗した読み取り数: 13.10% -m が原因でアライメントが抑制された読み取り: 34.11%</li>
	<li>重複排除:ピカードツール16でPCRの重複をマークします。</li>
	<li>データ可視化用のゲノムカバレッジファイルの生成:重複排除されたペアエンドリードをシングルエンドリードフラグメントに変換します。ゲノムカバレッジトラックは、ベッドツール17からゲノムカバレッジベッドを使用して取得されます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、この論文で説明されている研究に関連する関連または重要な金銭的利益がないことを宣言します。

ATAC-seqは、オープンクロマチン領域と活性クロマチン領域のマッピングに広く使用されています。がん細胞の進行は、遺伝子の変化やエピジェネティックなリプログラミングによって駆動されることが多く、その結果、クロマチンへのアクセス可能性と遺伝子発現が変化します。このリプログラミングの例は、腫瘍転移中の重要な細胞リプログラミングプロセスであることが知られている上皮間葉転換(EMT)およびその逆プロセスである間葉系から上皮への移行(MET)の間に見られる30。別の例は、ホルモン療法に対する薬剤耐性の獲得であり、管腔乳房腫瘍31においてしばしば観察される。ATAC-seqは、このような細胞表現型の変化をクロマチンレベルでモニターするのに有用であり、起源の細胞および癌サブタイプを予測するために使用することができる4。
ATAC-seqによるクロマチンリモデリングを正確に測定するには、再現性のある一貫したプロトコルの確立が必要です。この原稿では、ATA...

クロマチンアクセシビリティは、ゲノムワイドスケールでの遺伝子発現調節の重要な要件です1。クロマチンアクセシビリティの変化は、癌を含むいくつかの病状と頻繁に関連しています2,3,4。長年にわたり、研究者がクロマチンアクセシビリティの領域をマッピングすることによってクロマチンランドスケープを調査できるようにするために、多くの技術が開発されてきました。その中には、DNase-seq(DNase I過敏性部位シーケンシング)5、FAIRE-seq(ホルムアルデヒドによる調節要素の単離)6、MAPit(個々のテンプレートに対するメチルトランスフェラーゼアクセシビリティプロトコル)7、および本論文の焦点であるATAC-seq(トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ)8などがあります。DNase-seqは、DNaseの重要な特徴、すなわちヒストンや転写因子5などの他のタンパク質を含まない裸のDNAを優先的に消化することを利用して、アクセス可能な領域をマッピングします。FAIRE-seqは、ChIP-seqと同様に、免疫沈降が関与しないことを除いて、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理を利用し、ヌクレオソームを含まない領域はフェノール-クロロホルム抽出によって単離されます6。MAPitメソッドは、GCメチルトランスフェラーゼを使用して、単一分子分解能でクロマチン構造をプローブします7。ATAC-seqは、活性亢進トランスポザーゼTn58に依存しています。Tn5トランスポザーゼは、開いたクロマチン領域に優先的に結合し、シーケンシングアダプターをアクセス可能な領域に挿入します。Tn5は、DNAを介した「カットアンドペースト」メカニズムを介して動作し、アダプターをプリロードしたトランスポザーゼが開いたクロマチン部位に結合し、DNAを切断し、アダプターをライゲーションします8。Tn5結合領域は、これらのアダプターにアニールするプライマーを用いたPCR増幅によって回収される。FAIRE-seqおよびDNase-seqは、大量の出発物質(~100,000細胞から225,000細胞)と、シーケンシング9の前に別のライブラリ調製ステップを必要とします。一方、ATAC-seqプロトコルは比較的単純で、必要な細胞数(<50,000セル)10です。FAIRE-seqおよびDNase-seq技術とは異なり、単離されたDNAサンプルはすでにTn5によってシーケンシングアダプターでタグ付けされているため、ATAC-seqのシーケンシングライブラリ調製は比較的簡単です。したがって、ライブラリ調製を完了するために適切なプライマーによるPCR増幅ステップのみが必要であり、エンドリペアおよびアダプターライゲーションなどの事前処理ステップを実行する必要はなく、したがって時間を節約する11。第二に、ATAC-seqは、MAPit7に必要な領域特異的プライマーによるバイサルファイト変換、クローニング、および増幅の必要性を回避します。これらの利点により、ATAC-seqはオープンクロマチン領域を定義するための非常に一般的な方法になりました。ATAC-seq法は単純ですが、高品質で再現性のあるデータを得るためには、複数のステップを最適化する必要があります。この原稿では、標準的なATAC-seqライブラリ調製の最適化手順について説明し、特に(1)溶解バッファー組成、(2)Tn5トランスポザーゼ濃度、および(3)細胞数の3つのパラメーターを強調しています。さらに、この論文では、癌性および非癌性の付着上皮細胞の両方を使用した最適化条件からのサンプルデータを提供します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Natural</td></tr><tr><td>10 & micro;L XL TipOneチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>フィルター付きおよび低保持</td></tr><tr><td>100 &micro;L XL TipOne RPTチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>フィルター付きおよび低保持</td></tr><tr><td>100 &micro;L XL TipOneチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>フィルター付きで低保持力。斜めの等級</td></tr><tr><td>15 mLの円錐形の遠心分離機の管Corning</td><td></td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;L TipOne RPTチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1183-1810</td><td>フィルターと低保持</td></tr><tr><td>200&マイクロ;L TipOne RPTチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td>ろ過および低保持</td></tr><tr><td>50 mL遠心分離チューブ</td><td>Fisherbrand</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td><td>ス サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>YBP136010</td><td>遺伝子解析グレード</td></tr><tr><td>この研究で使用したすべての細胞株は、ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td>ビーズ精製キット</td></tr><tr><td>CellDrop セルカウンター</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>セルカウンター</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra、無水、&ge;99% (滴定)</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ミリポアSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 100%</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td></td>ック <td>AC615100020 無水;フィッシャーサイエンティフィック - デコンラボ滅菌製品</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清 - TETテスト済み</td><td>R&D Systems</td><td>S10350</td><td>トリプル 0.1 & マイクロ;m フィルター</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4.5 g/L D-グルコース;[+]L-グルタミン;[-]ピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>(0.25%)、フェノールレッド</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>ミリポアSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit 蛍光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA purification kit</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S8045</td><td>バイオエクストラ、&ge;98% (酸性)、ペレット (無水)</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA サンプル調製キット</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>2x TD and Tn5 Transposase</td></tr><tr><td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>分子生物学</td></tr><tr><td>PCR 検出システム</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>CFX384リアルタイムシステム。C1000 タッチサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>BioPerformance Certified, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen;核酸定量キット</td></tr><tr><td>Quibit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Nadium Acetate</td><td>Homemade-pH</td><td></td> <td>5.2</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR GreenSupermix, 1.25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>Flex-free, natural, polypropylene</td></tr><tr><td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>シングルノッチ.天然ポリプロピレン</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>648311</td><td>ULTROLグレード</td></tr><tr><td>トリトン x-100</td><td>IBI サイエンティフィック</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq デュアルインデックスシーケンシング プライマーキット</td><td>イルミナ</td><td>PE-121-1003</td><td>ペアエンド</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P7949</td><td>BioXtra、粘性液体</td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>ミリポアSigma</td><td>W3500</td><td>無菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています</td></tr></tbody></table>

がんエピジェネティクス研究のためのatac-seq最適化

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

ハイスループットシーケンシング(ATAC-seq)プローブを用いたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイは、高活性Tn5トランスポザーゼを用いたデオキシリボ核酸(DNA)アクセシビリティです。Tn5は、アダプターを切断およびライゲーションして、アクセス可能なクロマチン領域内でのハイスループットシーケンシングを実現します。真核細胞では、ゲノムDNAは、DNA、ヒストン、およびその他のタンパク質の複合体であるクロマチンにパッケージ化されており、転写機構に対する物理的な障壁として機能します。外因性シグナルに応答して、転写因子はクロマチンリモデリング複合体を動員し、遺伝子活性化のための転写機構へのアクセスを可能にします。したがって、オープンクロマチン領域の同定は、癌の進行などの生物学的事象中のエンハンサーおよび遺伝子プロモーター活性をモニタリングする場合に有用である。このプロトコルは使いやすく、細胞投入要件が低いため、ATAC-seqは、がん細胞を含むさまざまな細胞タイプのオープンクロマチン領域を定義するために広く採用されています。データ集録を成功させるには、ATAC-seqライブラリを準備する際にいくつかのパラメータを考慮する必要があります。その中で、細胞溶解バッファーの選択、Tn5酵素の滴定、および細胞の開始量は、癌細胞におけるATAC-seqライブラリ調製にとって非常に重要です。高品質のデータを生成するには、最適化が不可欠です。ここでは、上皮細胞型に対するATAC-seq最適化法について詳細に説明する。

ATAC-seqデータを高品質で得るためには、実験条件を最適化することが重要です。ATAC-seqライブラリの調製は、細胞溶解、タグメンテーション(Tn5によるフラグメンテーションとアダプター挿入)、ゲノムDNA精製、PCR増幅、データ解析の5つの主要ステップ(図1)に分けることができます。初期プロセスとして、細胞溶解(核分離)バッファーを最初に各細胞タイプに最適化する必要があります。元のATAC-seq論文8に記載されている低張緩衝液またはCSK緩衝液12,13のいずれかを使用して、乳癌細胞を溶解しました。トリパンブルー染色は、核単離の確認に使用できます18。MDA-MB-231、T47D、MCF7、およびA375細胞などのヒト癌細胞株におけるATAC-seqライブラリ調製のために、CSKバッファーは複数のグループによって使用されています<sup class="xr...

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seqは、ゲノム内のオープンクロマチン領域の状態を特定することを可能にし、これは通常状態と比較して疾患状態でしばしば変化する。より少ない細胞投入、Tn5消化の簡素化されたプロトコル、それに続くPCR増幅による断片化されたDNAおよびライブラリー調製の単離およびより短い実験時間は、それをより有利な技術にする。ATAC-seqによるエピジェネティックなランドスケープの変化を正常状態と疾患状態との比較は、疾患に関連するクロマチン調節要素に光を当て、新しい治療戦略の設計に役立ちます。この手法は、重要な実験ステップが含まれていないため、簡単に実行できます。ATAC-seqの結果を得るには、いくつかの標準化ステップのみが必要です。まず、PBSに1ミリリットルあたり100万個の細胞を含む細胞懸濁液から25マイクロリットルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移し、500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、25マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。500gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。直ちにペレットを25マイクロリットルのTn5反応混合物に再懸濁し、摂氏37度で30分間インキュベートする。10分ごとに溶液を混合します。5マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと125マイクロリットルのバッファーPBをTn5タグ付きDNA溶液に加えます。よく混ぜる。次に、スピンカラムを2ミリリットルの捕集チューブに入れ、サンプルをスピンカラムに塗布します。室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、フロースルーを廃棄する。PE バッファーを列に追加し、列をスピンします。スピンカラムを同じ収集チューブに戻し、5分間遠心分離してメンブレンを完全に乾燥させます。フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。DNA断片を10マイクロリットルのバッファーEBで溶出し、カラムを室温で1分間静置します。その後、室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、DNAを溶出させた。200マイクロリットルのPCRチューブでPCR反応をセットアップし、PCR増幅プログラムパート1を実行します。リアルタイムQPCRの場合、5マイクロリットルのPCR産物、0.75マイクロリットルの1, 000倍希釈SYBRゴールド、5マイクロリットルの2X PCRマスターミックス、および3.75マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてPCR反応混合物を調製します。実行パラメーターを使用して、必要な追加の PCR サイクル数を決定します。サイクル番号が決定されたら、前に計算された追加のサイクルを使用してPCRを設定します。増幅されたPCR産物に150マイクロリットルのビーズを加え、室温で15分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに5分間置き、上清を注意深く取り除きます。ビーズを200マイクロリットルの80%エタノールで洗浄し、上清を取り除きます。エタノールを完全に除去し、サンプルを室温で10分間風乾します。最後に、50マイクロリットルの溶出バッファーで再懸濁します。チューブを磁気スタンドに置き、溶出液を新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。トリパンブルーを用いた細胞溶解効率の比較を以下に示す。NMuMG細胞を低張緩衝液およびCSK緩衝液で処理し、トリパンブルーで染色した。より高い細胞溶解効率は、CSK処理細胞において観察された。ATAC-seqライブラリーは、MDA-MB-231乳癌細胞から調製した。PCR増幅後、ビーズ精製の前後に0.5X TBE、1.5%アガロースゲルでPCR産物を分析しました。プライマーは、最初のビーズ精製によってほとんど除去されます。1X TAE 1%アガロースゲル電気泳動および自動電気泳動からのDNAバンドパターンも示されています。SYBR Goldは、ここに示されているDNA断片を視覚化するために使用されました。ERS1遺伝子座を示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。T47D細胞におけるATAC-seqデータのゲノムカバレッジをこの画像に示します。以前の出版物のプライマーが使用され、それらのターゲット領域は黄色で強調表示されています。ATAC-seqライブラリにおけるプライマーアンプリコン濃縮を示す棒グラフをここに示します。ATAC-seqライブラリは、低張緩衝液またはCSK緩衝液により調製した。代表的な画像は、ATAC-seq最適化のためのゲノムブラウザの可視化を示しています。25, 000細胞インプット条件からのATAC-seqデータは、ヌクレオソームフリーフラグメントの最も高い濃縮を示し、一方、100, 000セルインプット条件は最も高いモノヌクレオソームDNAを示した。異なる細胞番号からのATAC-seqデータを示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。HOMERピークアノテーション分析は、この代表的な画像に描かれています。HOMERは、各ピークを近位または遠位ピークのプロモーターとして分類した。細胞溶解バッファーの細胞投入量の選択数と細胞型に依存するTn5酵素の濃度は、標準化しなければならない最も重要なパラメータです。カットアンドタック法でプロテインAと融合したTn5は、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて目的のタンパク質のDNA結合部位を特定するために広く使用されています。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。...

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq...

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー)...

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA...

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。...

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

トランスジェニックレポーターマウスから単離された脂肪組織との核ソーティングを使用して、脂肪細胞上で特異的にトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン(ATAC-seq)を核蛍光標識でアッセイするためのプロトコルを紹介します。...

蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

ここでは、L4期 Caenorhabditis elegans...

Caenorhabditis elegans L4幼虫全体におけるクロマチンアクセス性プロファイリング

学ぶATAC-seq最適化法で上皮細胞のクロマチンアクセシビリティを解析し、がんエピジェネティクスの病態メカニズムと治療戦略設計への応用を探索する。

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

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