がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化
2022年6月30日
ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。
ATAC-seqは、ゲノム内のオープンクロマチン領域の状態を特定することを可能にし、これは通常状態と比較して疾患状態でしばしば変化する。より少ない細胞投入、Tn5消化の簡素化されたプロトコル、それに続くPCR増幅による断片化されたDNAおよびライブラリー調製の単離およびより短い実験時間は、それをより有利な技術にする。ATAC-seqによるエピジェネティックなランドスケープの変化を正常状態と疾患状態との比較は、疾患に関連するクロマチン調節要素に光を当て、新しい治療戦略の設計に役立ちます。
この手法は、重要な実験ステップが含まれていないため、簡単に実行できます。ATAC-seqの結果を得るには、いくつかの標準化ステップのみが必要です。まず、PBSに1ミリリットルあたり100万個の細胞を含む細胞懸濁液から25マイクロリットルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移し、500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を注意深く廃棄し、25マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。500gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
直ちにペレットを25マイクロリットルのTn5反応混合物に再懸濁し、摂氏37度で30分間インキュベートする。10分ごとに溶液を混合します。5マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと125マイクロリットルのバッファーPBをTn5タグ付きDNA溶液に加えます。
よく混ぜる。次に、スピンカラムを2ミリリットルの捕集チューブに入れ、サンプルをスピンカラムに塗布します。室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、フロースルーを廃棄する。
PE バッファーを列に追加し、列をスピンします。スピンカラムを同じ収集チューブに戻し、5分間遠心分離してメンブレンを完全に乾燥させます。フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。
DNA断片を10マイクロリットルのバッファーEBで溶出し、カラムを室温で1分間静置します。その後、室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、DNAを溶出させた。200マイクロリットルのPCRチューブでPCR反応をセットアップし、PCR増幅プログラムパート1を実行します。
リアルタイムQPCRの場合、5マイクロリットルのPCR産物、0.75マイクロリットルの1, 000倍希釈SYBRゴールド、5マイクロリットルの2X PCRマスターミックス、および3.75マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてPCR反応混合物を調製します。実行パラメーターを使用して、必要な追加の PCR サイクル数を決定します。サイクル番号が決定されたら、前に計算された追加のサイクルを使用してPCRを設定します。
増幅されたPCR産物に150マイクロリットルのビーズを加え、室温で15分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに5分間置き、上清を注意深く取り除きます。ビーズを200マイクロリットルの80%エタノールで洗浄し、上清を取り除きます。
エタノールを完全に除去し、サンプルを室温で10分間風乾します。最後に、50マイクロリットルの溶出バッファーで再懸濁します。チューブを磁気スタンドに置き、溶出液を新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
トリパンブルーを用いた細胞溶解効率の比較を以下に示す。NMuMG細胞を低張緩衝液およびCSK緩衝液で処理し、トリパンブルーで染色した。より高い細胞溶解効率は、CSK処理細胞において観察された。
ATAC-seqライブラリーは、MDA-MB-231乳癌細胞から調製した。PCR増幅後、ビーズ精製の前後に0.5X TBE、1.5%アガロースゲルでPCR産物を分析しました。プライマーは、最初のビーズ精製によってほとんど除去されます。
1X TAE 1%アガロースゲル電気泳動および自動電気泳動からのDNAバンドパターンも示されています。SYBR Goldは、ここに示されているDNA断片を視覚化するために使用されました。ERS1遺伝子座を示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。
T47D細胞におけるATAC-seqデータのゲノムカバレッジをこの画像に示します。以前の出版物のプライマーが使用され、それらのターゲット領域は黄色で強調表示されています。ATAC-seqライブラリにおけるプライマーアンプリコン濃縮を示す棒グラフをここに示します。
ATAC-seqライブラリは、低張緩衝液またはCSK緩衝液により調製した。代表的な画像は、ATAC-seq最適化のためのゲノムブラウザの可視化を示しています。25, 000細胞インプット条件からのATAC-seqデータは、ヌクレオソームフリーフラグメントの最も高い濃縮を示し、一方、100, 000セルインプット条件は最も高いモノヌクレオソームDNAを示した。
異なる細胞番号からのATAC-seqデータを示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。HOMERピークアノテーション分析は、この代表的な画像に描かれています。HOMERは、各ピークを近位または遠位ピークのプロモーターとして分類した。
細胞溶解バッファーの細胞投入量の選択数と細胞型に依存するTn5酵素の濃度は、標準化しなければならない最も重要なパラメータです。カットアンドタック法でプロテインAと融合したTn5は、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて目的のタンパク質のDNA結合部位を特定するために広く使用されています。
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概要
ATAC-seqは、特にがん細胞におけるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングする強力なDNAシーケンシング技術です。このプロトコルは上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順を提供し、疾患メカニズムの理解を深めます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ゲノミクス
- がん生物学
背景
- ATAC-seqはゲノム内の開放クロマチン領域を特定します。
- クロマチンアクセシビリティは病態でしばしば変化します。
- この技術は細胞数が少なくて済み、実験プロセスを簡素化します。
- 疾患関連のクロマチン制御要素の理解に役立ちます。
研究の目的
- 上皮細胞タイプにおけるATAC-seqを最適化する。
- 正常と疾患状態の間のエピジェネティックな景観を比較する。
- 新しい治療戦略の設計を促進する。
使用された方法
- 細胞懸濁液をマイクロ遠心管に移す。
- 4°Cで5分間500 Gで遠心分離する。
- DNA断片化のためのTn5消化。
- ライブラリ調製のためのPCR増幅。
主な結果
- クロマチンアクセシビリティの変化の成功的な同定。
- 従来の方法に対するATAC-seqの利点の実証。
- 疾患関連のクロマチン制御要素に関する洞察。
- 標準化手順により信頼できる結果が得られる。
結論
- ATAC-seqはクロマチンダイナミクスを研究するための使いやすい技術です。
- がん生物学に関する貴重な洞察を提供します。
- 最適化手順により、技術の適用性が向上します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
ATAC-seq optimization enables high-resolution mapping of chromatin accessibility in cancer cells, directly informing target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery pipelines. Standardized protocols for cell lysis, enzyme titration, and input volume ensure reproducible, quantitative data critical for early-stage decision-making. This workflow supports portfolio triage by clarifying epigenetic regulatory elements linked to disease progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin accessibility changes associated with oncogenic transformation.
- Supports functional validation of regulatory elements and enhancer activity in cancer models.
- Provides mechanistic insight for de-risking target hypotheses in epigenetic drug discovery.
- Facilitates prioritization of candidate targets based on disease-relevant chromatin states.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, low-input protocols suitable for diverse cancer cell types.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of chromatin accessibility for assay development.
- Enables robust comparison of epigenetic states across experimental conditions.
- Prepares validated libraries for downstream sequencing and high-throughput analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility profiles with disease progression and biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic targets.
- Provides data for risk-adjusted advancement of candidate therapeutics targeting chromatin regulators.
- Enhances predictive confidence in translational models by mapping regulatory element activity.
Pipeline & Workflow Integration
ATAC-seq optimization is positioned at the interface of early discovery and lead identification, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification in cancer epigenetics.
- Discovery Biology: Quantifies chromatin accessibility to clarify regulatory mechanisms and validate disease-relevant targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-resolution readouts for comparative analysis of chromatin states and peak annotation.
- Translational Research: Links open chromatin regions to disease biomarkers and therapeutic response predictors.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse cancer models and epigenetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protocols for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying epigenetic drivers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets and therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology and next-generation sequencing workflows.
- Demands access to high-quality reagents, Tn5 enzyme, and sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of cell lysis, enzyme titration, and input volume.
- Must be adapted for specific cancer cell types and experimental conditions.
- Optimization of critical parameters is essential for high-quality, interpretable data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Cell Lysis and Tn5 Tagmentation
1:52
DNA Purification
2:57
PCR Amplification
3:43
Beads Purification
4:26
Results: Comparison of TSS Enrichment Scores and Differential Peaks Obtained Using Optimized Cell‐Lysis Buffers, Cell Number Input, and Tn5 Concentration of ATAC‐Seq Libraries
6:33
Conclusion
