Name: 哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶCandida albicans変異株の形態形成表現型をin vivoイメージングでスクリーニングする方法。マウス皮内接種と共焦点顕微鏡を用いて、感染中の真菌適応メカニズムを非侵襲的に解析する技術です。

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この研究は、NIH助成金1R01AI33409とアイオワ大学カーバー医科大学小児科の支援を受けました。

<ol><li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li>
<li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li>
<li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996(2022).</li>
<li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li>
<li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Candida+albicans+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li>
<li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+genes+to+networks%3A+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li>
<li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682(2021).</li>
<li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504(2010).</li>
<li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621(2021).</li>
<li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122(2022).</li>
<li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475(2017).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+and+filaments+have+specialized%2C+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020).</li>
<li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783(2009).</li>
<li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li>
<li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li>
<li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37(2016).</li>
<li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li>
<li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li>
<li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EFG1%2C+Everyone%27s+favorite+gene+in+Candida+albicans%3A+A+comprehensive+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+and+Microbiology%22%5BJournal%5D)">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229(2022).</li>
<li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras%2FcAMP%2Fprotein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li>
<li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634(2013).</li>
<li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199(1995).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

このモデルは、共焦点顕微鏡を使用して、哺乳類宿主の組織内で成長するC.アルビカンス生物の画像を取得し、活動感染中の形態形成表現型を評価することを可能にします。形態形成のプロセスは、C.アルビカンスの病因の中心であり、さまざまなin vitroアッセイを使用して広く研究されています2,3,4。しかしながら、宿主の複雑な生化学的および構造的環境を完全にモデル化できるin vitroアッセイはない。
ここで説明するプロトコルは、このin vivoイメージングシステムを使用して、感染中の形態形成に関与する遺伝子を特定するためにC.アルビカンス変異体のシリーズ/ライブラリをスクリーニングすることに焦点を当てています。異なる蛍光タンパク質を発現するC. albicans株を用いることで、C. albicans変異株のin vivo形態形成を基準株と比較して定量することができます。変異体の形態形成を同じ感染領域内の参照株と比較することで、生物が同一の環境にさらされることが保証されます。これにより、フィラメント化を受けている細胞の割合、およびフィラメント化の程度を定量的に測定できます。変異株の測定値を参照株の測定値に正規化することで、ある変異株のパフォーマンスを別の変異株のパフォーマンスをより適切に比較できます。
ここに提示された代表的な結果は、インビトロとインビボの表現型の間に有意な不一致が生じる可能性を示しています。C. albicans efg1ΔΔ変異株は、ほとんどすべてのin vitro条件でフィラメント化できないため、形態形成アッセイの陰性対照としてよく使用されます20。in vivoの結果はin vitroの結果と非常に似ていましたが、このひどく妨げられた株でさえ、宿主組織環境でフィラメントを形成することがありました(図3)。これは、形態形成を誘発する宿主環境の強さを強調しています。
対照的に、cyr1ΔΔ変異株は、インビトロ成長とインビボ成長の間に実質的な不一致を示します。変異細胞はいずれもin vitroでフィラメント化を受けませんが、約半数の細胞はin vivoでフィラメントとして増殖します(図4)10,21。興味深いことに、これらのフィラメントは参照株によって形成されたフィラメントよりも有意に短く、CYR1がフィラメントの成長速度または糸状表現型を維持する能力のいずれかに寄与することを示唆しています。フィラメント長の分析を容易にするために、フィラメントの曲線経路長を、画像の2次元投影を用いて測定した。3次元で成長するフィラメントの2次元投影では、xy平面に平行でない軸上に成長するフィラメントは、その実際の長さよりも短く投影されます。この縮み率は参照株でも発生するため、2次元投影でフィラメント長の分布を評価することで、参照株と変異株の定量的な比較が可能になります。フィラメントの長さを3次元ではなく2次元で解析するには、それほど集中的な画像解析は必要ありません。したがって、一般的なデスクトップコンピュータで比較的迅速に実行できます。このより単純な分析を使用すると、スクリーニングプロトコルの一部としてフィラメントの長さ分布を含めることができ、スループットに大幅な遅延を引き起こすことなく、各変異体が形態形成を受ける能力をより微妙に理解できます。
ここで紹介する代表的な研究は、補体系に欠陥があり、好中球をC .アルビカンス 感染部位に動員できないDBA2/Nマウスを用いて実施されました22。これらの研究の目的は、宿主組織内の C.アルビカンスの フィラメント形成の調節のメカニズムを調査することでした。したがって、DBA2 / Nマウスは、個々の株の好中球に対する感受性または耐性のために結果を交絡させないようにするために使用されました。好中球抗C.アルビカンスの 反応はフィラメント形成に影響を与える可能性があるため23、感染部位への好中球の動員は形態形成アッセイの結果に影響を与える可能性があります。ある株が in vivo でフィラメント化できるが、好中球が存在するとフィラメント形成が強く阻害される場合、フィラメント形成はDBA2/Nマウスで検出されますが、無傷の好中球走化性を有するマウスを使用した場合には見られそうにありません。したがって、宿主として使用されるマウスの系統は、このプロトコルを使用する際の重要な要素である。
efg1ΔΔ変異株がin vivoでフィラメントに失敗するという観察は、この株もin vitroでフィラメントできないため、宿主好中球応答に関連している可能性は低いです。cyr1ΔΔ株でインビボで観察されるフィラメント形成は、インビトロでのフィラメント形成の失敗と一致しない。C. albicans感染のゼブラフィッシュモデルからのデータは、応答好中球が形態形成の予防に重要であることを示しています24。したがって、好中球応答を欠くDBA2/Nマウスの使用は、in vitroと比較してin vivoでのcyr1ΔΔのフィラメント形成の増加を説明する可能性は低い。それにもかかわらず、生体内環境は明らかにcyr1ΔΔ株の形態形成に影響を与えています。したがって、この株のさらなる調査は、活動性感染中のC.アルビカンスの形態形成の調節に関する重要な情報を提供する可能性がある。ここで説明するプロトコルは、将来の研究で使用されるcyr1ΔΔ株などの株を同定するためのスクリーニングアッセイとして設計されています。
低流量ガス麻酔システムの使用は、このプロトコルに非常に役立ちます(図1A、B)。このプロトコルの初期開発中に、マウスは、キシラジンと混合されたケタミンの注射可能な麻酔カクテルを使用して麻酔されました。その麻酔法では限られたイメージングを行うことができましたが、麻酔の持続時間は予測できず、イメージング中にマウスが麻酔から回復するのを避けるために、イメージングセッションを迅速に終了する必要がありました。従来の吸入麻酔システムはかさばり、麻酔ガスの流量が高い必要があり、多くの場合、ヒュームフード内で使用する必要があります。したがって、従来の吸入麻酔システムは、研究者を誤って麻酔薬にさらすことなく、共焦点顕微鏡のスペースの制約で使用することは非常に困難です。低流量吸入麻酔システムの使用は、研究者にとって安全な環境を維持しながら、動物の一貫した麻酔を可能にする。低流量のノーズコーンにより、接種と顕微鏡検査の両方で動物を簡単に位置決めできます。小口径で少量の送達チューブにより、比較的長いチューブを使用できるため、顕微鏡検査に干渉しないように麻酔器を十分な距離に配置することができます。
典型的なマウスチャウに存在するクロロフィルは、有意な組織自己蛍光をもたらす25。これにより、画像にかなりのノイズが発生し、高品質で空間解像度の高い画像を取得することが困難になります。イメージング前に7日間クロロフィルフリーの固形飼料を動物に与えた場合、自家蛍光によるバックグラウンドは組織で大幅に減少しましたが、毛髪に沈着したクロロフィルは引き続き問題でした。市販の化学脱毛クリームを使用して耳介の毛を除去することは、毛髪の自家蛍光を最小限に抑えるのに効果的です(図1C、D)。したがって、クロロフィルフリーの固形固形飼料と適切な脱毛の組み合わせにより、自家蛍光が大幅に減少し、画質が劇的に向上しました。髪はイメージングの前に耳から取り除かれるため、動物の髪の色はこのシステムに影響を与えません。このプロトコルは、BALB/c(白)、C57BL/6(黒)、およびDBA2/N(茶色)マウスにおける C.アルビカンス 感染症の研究に成功しています。このプロトコルは、さまざまな宿主遺伝子を欠損しているC57BL/6ノックアウトマウスでも使用できます。これにより、哺乳類の宿主免疫系がフィラメント形成にどのように影響するかについての将来の調査が可能になります。このプロトコルで議論されていないこのモデルの特徴の1つは、このイメージングシステムが非侵襲的であるため、同じ動物を数日間にわたって繰り返しイメージングすることができ、経時的に個々の感染の進行を追跡できることです。この特徴は、宿主と病原体の相互作用に関する将来の研究において重要な役割を果たす可能性があります。
要約すると、このプロトコルは、生きた哺乳動物宿主の組織で成長するC.アルビカンスの高空間分解能画像をもたらし、変異株における形態形成の正確な評価を可能にする8、9、10。ここに提示された結果は、このプロトコルを使用してC.アルビカンス変異体のライブラリをスクリーニングする方法を示しています。これまでに試験されたC.アルビカンス変異体のうち、インビトロでの形態形成に既知の欠陥を有する変異体の大部分は、インビボで容易にフィラメント化を受ける9,10。これは、C.アルビカンスの病因のメカニズムを解明するために設計された実験にこのようなin vivoシステムを含めることの重要性を強調しています。

カンジダ・アルビカンスは一般的なヒト真菌病原体であり、粘膜皮膚疾患、播種性疾患、および限局性組織感染症を引き起こします1。C.アルビカンスの生理学の重要な特徴は、その複雑な多型成長であり、これは共生および病原体の両方としての役割に関連しています2,3,4。30°Cのin vitroでの豊富な栄養条件下では、通常、卵形の出芽酵母として増殖します。栄養欠乏、pH変化、37°Cでの成長、血清への曝露、寒天に埋め込まれた場合の成長など、さまざまな環境トリガーにより、分極成長パターンに移行し、真の菌糸および/または偽菌糸5が形成されます。二極成長の開始とその結果としての糸状生物の成長は、形態形成と呼ばれます。
生物の病原性における形態形成の重要性のために、菌糸形成の調節は広く研究されてきた6,7。形態形成を引き起こすシグナル伝達経路と転写調節の複雑なネットワークがあります。C. albicansの形態形成と病因との関係にもかかわらず、形態形成を調査するほとんどの研究は、菌糸形成を引き起こすためにin vitro刺激を使用してきました。フィラメント化のさまざまなin vitroモデルは、刺激される個々の調節経路に関して同一ではないことがますます明らかになっています。さらに、宿主の複雑な環境と密接に対応するin vitro増殖条件はありません。ヒト病原体としてのC.アルビカンスの重要性を考えると、このプロトコルの目標は、中程度のスループットのシステムを使用して、哺乳類宿主における活性感染中の形態形成を調査し、研究者がC.アルビカンス変異体ライブラリをスクリーニングできるようにすることです。
これらの研究を容易にするために、倒立共焦点顕微鏡を用いて麻酔マウスの耳介に感染している間のC.アルビカンス細胞の高空間分解能画像を得ることができるin vivoイメージングシステムを開発しました8,9,10。耳介の皮膚は非常に薄いため、組織解剖を必要とせずにこれらの画像を得ることができます。したがって、定量的表現型データは、宿主組織内の活動性感染部位で測定することができる。ここで説明するプロトコルは、異なる蛍光タンパク質発現カセット11、12を有する参照株および1つ以上の変異株の形質転換を含む。次に、蛍光タンパク質発現株を混合し、皮内注射します。感染が確立された後、共焦点イメージングを使用して、フィラメント形成の頻度と形成されたフィラメントの長さの両方を定量化します。変異株から得られたデータは、同じ組織領域に存在する参照株から得られたデータに正規化され、したがって内部対照を提供する。このシステムにより、いくつかの一連のC.アルビカンス変異株のスクリーニングに成功し、その多くはin vitroで形態形成の欠陥を持っています9,10。これらの株の多くはインビボで容易にフィラメント化し、形態形成の調査のためのインビボモデルの重要性を強調している。

<table><tbody><tr><td>#1.5カバースリップ</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー20811</td><td>ユニバーサルステージ開口部を覆うのに十分な大きさ</td></tr><tr><td>0.1 mLインスリン注射器</td><td>EXELint</td><td>26018</td><td>5/16インチの注射器を使用できます。1/2 "長さと29&ndash;</td></tr><tr><td>dPBS中の3.7%ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール/30%水</td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>アルコール調製パッド</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>代替品:70%イソプロピルアルコール</td></tr><tr><td>C.albicans参照株および実験株</td>に浸したガーゼパッド <td>SN250</td><td>FGSC オンラインカタログ</td><td>特定のC. albicans株は、実験と研究者の目標によって異なります。私たちは、SC5314に由来する株だけでなく、他の臨床分離株も使用しています。</td></tr><tr><td>クロロフィルフリーマウスチョウ</td><td>Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7050</td><td>画像の取得と分析のためのイメージングソフトウェアを実行できるコンピュータ。さまざまなイメージングソフトウェアが利用可能であり、特定の顕微鏡やユーザーシステムによって異なります。</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N (6-12週齢マウス)</td><td></td><td></td><td>BALB/cおよびC57/BL6マウスも使用できます。後者では、広く利用可能なノックアウトマウスモデルや、食細胞などの個々の細胞型が蛍光タンパク質の発現によって同定されるマウスモデルの使用が可能になります。</td></tr><tr><td>生地を肌に固定するように設計された両面テープ(ファッションテープ)</td><td>地元の薬局や食料品店</td><td></td><td>人間の皮膚の上に衣服を所定の位置に保つために設計された両面粘着テープ。&nbsp;これは通常、薬局や雑貨店の店頭で入手できます。&nbsp;このタイプのテープは、肌にやさしく密着するように設計されているため、使用することが重要です。&nbsp; 例:&nbsp; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =ファッション+テープ&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&SR=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =ファッション+テープ&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&SR=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =ファッション+テープ&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>無菌でなければなりません。実験ごとに新しい容器を開けてください</td></tr><tr><td>Fetal wevine serum</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼパッド</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>Gel eye lurbicant</td><td>地元の薬局や食料品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ or FIJI分析ソフトウェア</td><td>NIH</td><td>ImageJ (FIJI)</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td><td>Leica</td><td>DMi8 (SP8)</td><td>対物レンズ&nbsp;(ライカ11506375)ここで使用&nbsp;は、耳組織の屈折率を近似しながら、高いNA(0.95)を持つことを可能にする25倍の水浸レンズです。 顕微鏡(ライカDMi8(SP8プラットフォーム))には488nmと638nmのダイオードレーザーラインがあり、発光光の検出のためのコンピューター制御の調整可能な帯域幅を備えたフィルターフリー&nbsp;スペクトル検出が装備されています。 ステージには、対物レンズを可能にするのに十分なクリアランスが必要です。ステージにぶつからずに下部のカバースリップに到達します。</td></tr><tr><td>低流量麻酔システムまたは従来の麻酔気化器</td><td>ケント・サイエンティフィック・インターナショナル</td><td>ソムノスイート</td><td></td></tr><tr><td>ナイア 脱毛剤ローション</td><td>地元の薬局または食料品店</td><td></td><td>市販の脱毛クリーム</td></tr><tr><td>ヌーセオトリシン</td><td>イエナ・バイオサイエンス</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATRプラスミド</td><td></td><td></td><td>蛍光タンパク質発現形質転換コンストラクト&nbsp;ロバート・ウィーラー博士(Seman, et al., 2018, Infection and Immunity;Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td></tr><tr><td>感圧性実験室用テープ</td><td>テープ &Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640細胞培養培地</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>指ぬき、プラスチック 15 mL 円錐管、またはファルコン 5 mL 丸底ポリスチレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td>注射剤中に動物の耳を安全に保持するため</td></tr></tbody></table>

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

カンジダアルビカンスは重要なヒト病原体です。形態学的形態を切り替えるその能力は、その病因の中心です。これらの形態学的変化は、環境刺激に応答して制御される複雑なシグナル伝達ネットワークによって調節される。これらの調節成分は高度に研究されていますが、ほとんどすべての研究では、フィラメント形成を引き起こすためにさまざまなin vitro刺激を使用しています。病態形成過程で形態形成がどのように制御されるかを明らかにするために、哺乳類宿主内で菌糸形成を受けている生物の高空間分解能画像を取得するためのin vivo顕微鏡システムを開発しました。ここで紹介するプロトコルでは、このシステムを使用してC.アルビカンス変異株の小さなコレクションをスクリーニングし、感染部位で発生する形態形成の主要な調節因子を特定できるように説明しています。代表的な結果が提示され、転写調節因子Efg1などの形態形成のいくつかの調節因子は、インビトロおよびインビボで一貫した表現型を有するのに対し、アデニルシクラーゼ(Cyr1)などの他の調節因子は、インビトロと比較してインビボで有意に異なる表現型を有することを示す。

ここに示されている結果は、以前に公開されたレポート9,10に基づいています。この分析の目的は、変異体の能力を定量的に評価することです C.アルビカンス株 活動性感染中に形態形成を受ける。偽菌糸と菌糸を区別する典型的なパラメータは、複雑なin vivo環境で3次元的に成長する生物では評価が困難な場合があります。これは、共焦点イメージングによって作成された2次元断面を見る場合に特に当てはまります。したがって、このスクリーニング分析は、酵母に対して糸状として成長する生物を特定することに焦点を当てています。3次元再構成を含む、より詳細な分析を使用した追跡調査では、この方法は酵母、菌糸、偽菌糸の識別に適応できます。
C. albicansの参照株または変異株における蛍光タンパク質の発現は、in vivoでの株形態の容易な検出を可能にする(図3および図4)。一般に、定量的光学顕微鏡分析は、画像内のピクセルがほとんどまたはまったく飽和していない場合に最適です。ただし、このプロトコルでは、画像の彩度によって分析が簡素化されることがよくあります。蛍光タンパク質の局在は細胞全体で均一ではなく、フィラメントよりも母酵母の方が高いことがよくあります。幸いなことに、形態形成の調査では、信号の強度ではなく空間分布が結果を定義します。したがって、多くのピクセルが飽和している画像を取得することで、このアッセイで形態形成を定量化する能力が向上します。
in vivoでの形態形成を評価することの重要性を説明するために、参照株(SN250)と2つの変異体(転写因子Efg1を欠く1つとアデニリルシクラーゼCyr1を欠く変異株)について代表的な結果が提示されます。インビトロでは、これらの株のいずれもフィラメントとして増殖しない20,21。10%血清を添加したRPMI培地でインビトロで増殖させると、基準株は急速にフィラメントを形成するが、efg1ΔΔおよびcyr1ΔΔ株は形成しない(図3および図4)。これらの条件下では、efg1ΔΔ変異体はやや分極した増殖を示し、娘細胞は母細胞と比較してわずかに伸長している。これは、フィラメント化の明確な定義を使用することの重要性を強調しています。そのような定義はデフォルトでは任意ですが、表現型の一貫した評価に必要です。これらの研究では、糸状成長パターンは、娘細胞の最長寸法が母細胞の2倍以上である生物として定義されます。この定義を使用すると、伸長したefg1ΔΔ細胞は糸状ではありません。
そのインビトロ表現型と一致して、efg1ΔΔはインビボで有意なフィラメント形成欠陥を示します:efg1ΔΔ細胞の約9%がインビボでフィラメントとして増殖しました(図3)。対照的に、cyr1ΔΔ変異細胞の53%は、生体内でフィラメントとして増殖した(図4)。インビボでフィラメント形成を受けるcyr1ΔΔ変異細胞の数は基準株よりも有意に低かったが、インビボでフィラメントを形成するcyr1ΔΔ変異体の能力は、インビトロでの形態形成の完全な欠如からの実質的な変化を表す。視覚的には、cyr1ΔΔ変異体によって形成されたフィラメントは、基準株よりも短いように見えた。これを定量的に評価するために、糸状細胞の曲線経路長を、生体内画像の2次元投影を用いて測定した(図4E)。cyr1ΔΔフィラメントの中央長は、基準株のフィラメントよりも29%短かった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> 図1:麻酔と接種 。 (A)誘導チャンバーを使用した麻酔の誘導。(B)麻酔はノーズコーンを使用して維持され、必要に応じてマウスの位置を変えることができます。(C)脱毛クリームは、先端が綿のアプリケーターを使用して塗布されます。麻酔中に目を保護するために、目の潤滑ジェルが適用されています。(D)右耳の効果的な脱毛。未治療の左耳と比較してください。(E) C.アルビカンスの マウス耳への皮内注射。耳は、両面スキンテープ(ファッションテープ)で包まれた円錐形のチューブの先端を使用して所定の位置に保持されます。(F)皮内注射の接写。淡い泡が皮膚に形成され、これは皮内配置が成功したことを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> 図2:イメージングの準備 。 (A)イメージング用に準備された顕微鏡ステージ。麻酔ノーズコーンは所定の位置に固定されています。レンズ開口部を覆うステージにカバーガラスがテープで固定されています。追加のテープが利用可能です。加熱ステージは37°Cに予め加温される(図示せず)。(B)麻酔したマウスを麻酔鼻コーンに配置する。(C)マウスをわずかに回転させて、接種した耳の側面が下部カバースリップ/対物レンズの方を向くようにします。次に、耳を下部カバースリップに対して平らにし、耳の上に2番目のカバーガラスを置いて所定の位置に固定します。(D)トップカバースリップをステージにテープで固定し、顕微鏡ステージに対して耳を所定の位置に固定します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> 図3:efg1ΔΔ変異株のインビトロおよびインビボ形態。 (a)RPMI+10%血清中で細胞を増殖させ、37°Cで4時間フィラメント化をin vitro誘導した後のWTおよびefg1ΔΔ変異株の広視野画像。スケールバーは10μmを表す。画像のコントラストは、見やすくするために写真編集ソフトウェアを使用して調整されました。(B)WTおよびefg1ΔΔ変異株において観察されたインビトロでのフィラメント化の割合。und = 検出不能 (フィラメントは検出されませんでした)。バーの高さは、少なくとも100個の細胞が定量化された3つの独立した実験からの糸状細胞の中央値パーセンテージを表す。エラーバーは標準偏差を示します(スチューデントのt検定で比較した結果、p &lt; 0.001)。(C)接種後24時間でin vivoで成長するWT(緑)とefg1ΔΔΔ変異体(赤)の共焦点顕微鏡写真。矢印は、我々の「糸状」の定義を満たすefg1ΔΔ変異細胞の例を示す。スケールバーは50μmを表す。 (d)WTおよびefg1ΔΔ変異株において観察されたインビボでのフィラメント化の割合。バーの高さは、2つの独立した実験からの糸状細胞の割合の中央値を表します。エラーバーは標準偏差を示します(スチューデントのt検定で比較した結果、p &lt; 0.001)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> 図4:cyr1 ΔΔ変異株のインビトロおよびインビボ形態。 (a)細胞をRPMI+10%血清中で37°Cで4時間増殖させてフィラメント化をインビトロ誘導した後のcyr1ΔΔ変異株の 広視野画像。スケールバーは10μmを表す。画像のコントラストは、見やすくするために写真編集ソフトウェアを使用して調整されました。(B)WTおよびcyr1ΔΔ変異株において観察されたインビトロでのフィラメント化の割合。und = 検出不能 (フィラメントは検出されませんでした)。バーの高さは、少なくとも100個の細胞が定量化された3つの独立した実験からの糸状細胞の中央値パーセンテージを表す。エラーバーは標準偏差を示します(スチューデントのt検定で比較した結果、p &lt; 0.001)。(C)接種後24時間でインビボで増殖するWT(緑)とcyr1ΔΔΔ変異体(赤)の共焦点顕微鏡写真。スケールバーは50μmを表す。 (d)WTおよびcyr1ΔΔ変異株において観察される生体内でのフィラメント化の割合。バーの高さは、2つの独立した実験からの糸状細胞の割合の中央値を表します。エラーバーは標準偏差を示します(スチューデントのt検定で比較した結果、p &lt; 0.001)。(e)生体内のフィラメント長の分布は、zスタックの2次元投影における曲線経路長によって測定される。各ドットは1本のフィラメントの長さを表す。酵母として増殖する細胞は、この分析には含まれなかった。バーはフィラメント長の中央値を示します。長さの分布は、マン・ホイットニーU検定(p &lt; 0.001)を用いて分析すると有意に異なる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この原稿は、非侵襲的共焦点顕微鏡を使用して、哺乳類宿主における活動感染中の形態形成表現型について中等度のカン ジダアルビカンス 変異体ライブラリをスクリーニングする方法について説明しています。

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

カンジダ・アルビカンスの形態形成は、無数の環境シグナルによって引き起こされます。in vivoで形態形成を研究することにより、生物がこれらすべての環境シグナルをどのように統合して応答するかを決定しています。この技術の主な利点は、in vitroモデルシステムを使用して導入される可能性のあるバイアスやアーティファクトがない場合に形態形成を研究できることです。皮内注射の経験がある人はほとんどいません。このテクニックに不慣れな人は、動物資源の獣医に連絡して学習することを強くお勧めします。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室グループのポスドクである若出ローハンです。接種の前に少なくとも7日間クロロフィルフリーのチャウを与えることによって接種のために動物を準備することから始めます。注射の前日に、つまようじを使用して1つのコロニーからカナダのアルビカンス細胞を軽くたたきます。25ミリリットルのYPDを接種し、このプロセスを数回繰り返して、いくつかの異なるコロニーから細胞を取得します。培養液を175RPMのオービタルシェーカーインキュベーターで摂氏30度で一晩インキュベートします。1ミリリットルの培養物を500 x gで2分間遠心分離し、次に1ミリリットルの滅菌DPBSで酵母を3回洗浄します。ペレットを1ミリリットルの滅菌DPBSに再懸濁し、培養液を1〜100に希釈します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、それに応じて細胞密度を調整します。次に、参照株と実験株を等量混合して注射用の接種材料を作成します。綿の先端の綿棒を使用して、麻酔をかけた動物の両耳の内面と外面に市販の脱毛クリームをたっぷりと塗ります。2〜3分後、乾いたガーゼで耳をそっと拭き、続いて滅菌水で飽和させたガーゼパッドで脱毛クリームの残留物を完全に取り除きます。耳の表面を70%エタノールで滅菌した後、バイアルを複数回反転させるか、ボルテックスして接種材料をよく混ぜます。20〜30マイクロリットルの接種材料をインスリン注射器に引き込みます。針を直立位置に保持し、シリンジを軽くたたいて、バレル内の空気が上部にあることを確認します。空気と余分な接種材料を接種チューブまたは廃棄物チューブに慎重に排出して、プランジャーが10マイクロリットルのマークになるようにします。市販の両面スキンテープを小さな円錐形または丸底のプラスチックチューブに塗布し、麻酔のノーズコーンが外れないように、テープ全体に耳を垂らします。注射針を皮膚とほぼ平行に保ち、大きな静脈を避け、針の先端を皮膚の最外層に挿入し、ベベルがちょうど覆われるまで、接種材料を皮内にゆっくりと注入します。良い皮内注射は皮膚に小さな泡を上げます。漏れを最小限に抑えるために、針を耳から外す前に、針を15〜20秒間所定の位置に保ちます。制度上のプロトコルに従って、ケージ内の動物がカンジダアルビカンスに感染していることを示すバイオハザードラベルでケージにマークを付けます。接種材料の調製に使用したのと同じ洗浄培養物を使用して、RPMI 1640で1〜50希釈の細胞を作成し、10%熱および活性化ウシ胎児血清を添加し、摂氏37度で4時間タンブリングしながらインキュベートします。顕微鏡を使用してサンプルを調べます。少なくとも100個の細胞をカウントし、各株について酵母および糸状細胞の数を記録します。作動距離の長い対物レンズを所定の位置に回転させ、液浸液の液滴をレンズに置きます。カバースリップを配置するときに起こりうる損傷を避けるために、レンズを下げてください。1.5番のカバーをステージ開口部の上に滑り込ませ、所定の位置にテープで固定します。液浸液が対物レンズとカバースリップの両方に接触するように対物レンズを持ち上げます。麻酔ノーズコーンを顕微鏡ステージに固定して、イメージングの位置にいるときに動物の鼻を完全に覆うようにします。麻酔をかけたマウスの鼻をノーズコーンに入れます。対物レンズの上のカバースリップに滅菌水を一滴置きます。麻酔のノーズコーンを調整し、マウスの耳が水滴の上にくるようにマウスを配置します。別のカバースリップを取り、カバースリップの端をマウスの本体と平行に置き、耳が頭と出会う場所で端がマウスに触れるようにします。ヒンジモーションを使用して、カバースリップの自由端を顕微鏡ステージに下げます。カバースリップが顕微鏡ステージに当たると、耳が平らになります。トップカバーのスリップをしっかりとテープで留めて、耳を平らに保ち、マウスの髪の毛やひげがテープに引っ掛からないようにするのに十分な圧力を保持します。環境チャンバーを備えた顕微鏡を使用しない限り、通常の熱環境を維持するために、マウスの体を滅菌ドレープでゆるく覆います。白色光、広視野イメージングを使用して、焦点面を耳の組織に調整し、血管内を移動する赤血球に焦点を合わせます。視野内のすべての細胞について形態を決定できるように、十分に強い信号対雑音比を得るには、レーザー出力またはイメージング速度を調整します。組織の損傷を避けるために、可能な限り低いレーザー出力を使用してください。参照された株に明確なフィラメントが形成され、ほとんどの生物がそれらの形態を決定できるほど十分に広がっている視野を選択してください。Z スタックのフォーカスの上面と下面を設定します。感染領域の深さ全体をカバーする必要はありませんが、画像ボリュームの上部または下部にある生物は通常、分析から除外されることに注意してください。Zスタック画像を取得し、各チャンネルを疑似色して各ひずみを区別し、チャンネルを重ね合わせます。画像を保存します。イメージングソフトウェアを使用して、Zスタックを2次元画像に最大投影します。最大投影画像に見られる各生物を、菌株の種類と形態別にカウントします。参照された株は、インビトロで急速にフィラメントを形成します。一方、EFG1ヌルはフィラメントの形成に失敗しました。EFG1ヌルは、生体内でも著しいフィラメント形成欠陥を示します。EFG1ヌル細胞の約9%がin vivoでフィラメントとして増殖した。同様に、CYR1 Null変異株は、参照株と比較してインビトロでフィラメント形成障害を示した。対照的に、CYR1 Null変異細胞の53%は、生体内でフィラメントとして増殖した。CYR1 Null変異体によって形成されたフィラメントは、参照株よりも短かった。接種中は針を皮膚と平行に保つことが重要です。目標は、接種材料を皮膚の外層のすぐ下に配置することです。この技術は、目的の宿主細胞で蛍光タンパク質を発現するマウス系統でも使用でき、宿主病原体の相互作用をin vivoで研究することができます。

use-vivo-imaging-to-screen-for-morphogenesis-phenotypes-candida

Research

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