Name: ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイス製造とDrosophila melanogaster胚の固定・整列手法。高解像度イメージングと機械圧縮刺激により、発生生物学における力学的力の影響を研究できます。

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この研究は、国立科学財団(CMMI-1946456)、空軍科学研究局(FA9550-18-1-0262)、および国立衛生研究所(R01AG06100501A1;R21AR08105201A1)。

1. シリコンウェーハモールドの準備
<ol><li>シリコンウェーハ( 材料表を参照)を最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコール(IPA)で洗浄します。</li>
	<li>シリコンウェーハを250°Cのホットプレートに30分間置き、脱水ベークを行います(図3A)。</li>
	<li>シリコンウェーハをベーパープライムオーブン( 材料表を参照)でヘキサメチルジシラザン(HDMS)でコーティングします(プロセス温度:150°C、プロセス圧力:2 Torr、プロセス時間:5分、HDMS容量:5 μL)(図3B)。</li>
	<li>SU-8 2100フォトレジストのボトル( 材料の表を参照)を60°Cのオーブンに15分間入れて、粘度を下げます。 注:オーブンで加熱すると、フォトレジストの粘度が低下します。粘度の低いフォトレジストは、より簡単に取り扱うことができ、ウェーハの上により正確に注ぐことができます。</li>
	<li>シリコンウェーハを60°Cのホットプレートに置き、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、ウェーハの各インチに1 mLの加熱フォトレジストを注ぎます(図3C)。</li>
	<li>フォトレジスト塗布シリコンウェーハをスピンコーターに移します( 材料表を参照)。</li>
	<li>最初に250 rpmで30秒間、次に350 rpmでさらに30秒間、どちらも100 rpm / sの加速でプリスピンを適用します(図3D)。</li>
	<li>クリーンルームスワブを使用して、シリコンウェーハの端から余分なフォトレジストを取り除きます。</li>
	<li>最初に500 rpmで100 rpm / sの加速度で15秒間スピンを適用し、次に1450 rpmで30 rpm / sの加速度で30秒間スピンを適用します(図3E)。</li>
	<li>クリーンルームの綿棒でエッジビードを取り外します。</li>
	<li>シリコンウェーハを50°Cのホットプレートに置き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します(図3F)。</li>
	<li>ホットプレートの温度を2°C / minの速度で95°Cまでゆっくりと上昇させます。</li>
	<li>シリコンウェーハを95°Cで50分間ソフトベークします(図3G)。</li>
	<li>ホットプレートを2°C / minの速度で室温までゆっくりと冷却します。</li>
	<li>シリコンウェーハをマスクアライナー( 材料表を参照)に置き、その上にフォトマスクを配置します(フォトマスクの形状については 補足図1 を参照してください)。</li>
	<li>コンタクトマスクアライナーを使用して、フォトマスクを通してシリコンウェーハを350 mJ / cm 2のUV光(35 mW / cm2で10秒間)にさらします(図3H)。</li>
	<li>ウェーハを50°Cのホットプレートに5分間、65°Cでさらに5分間、最後に80°Cでさらに20分間、シリコンウェーハに連続した露光後ベークを適用します(図3I)。</li>
	<li>シリコンウェーハを2°C/分の速度で室温までゆっくりと冷却します。</li>
	<li>シリコンウェーハより少し小さい直径のマグネチックスターラーをビーカーに入れます。シリコンウェーハを逆さまにして、ビーカーの上に置きます。</li>
	<li>ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます( 材料の表を参照)。シリコンウェーハを現像液に30分間沈めたまま、スターラーをオンにしておきます(図3J)。</li>
	<li>シリコンウェーハを、40kHzで1時間、新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理器に移します(図3K)。</li>
	<li>シリコンウェーハをIPA溶液で徹底的に洗浄して、最終的なシリコンウェーハモールドを取得します(図3L)。</li>
</ol>2. マイクロ流体チップの作製
<ol><li>シリコンウェーハモールドを10滴(~500 μL)のトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン(PFOCTS、 材料表を参照)と一緒にデシケーターに入れ、近くの小さな計量ボートに入れます。</li>
	<li>デシケーターを真空ポンプに約200Torrで30分間接続します。</li>
	<li>デシケーターバルブをオフにし、PFOCTSコーティングのために真空ポンプを一晩外します。</li>
	<li>PDMSベースと硬化剤( 材料の表を参照)を10:1の比率で混合することにより、硬化前のポリジメチルシロキサン(PDMS)溶液を調製します。</li>
	<li>混合物を遠心分離機(室温で5分間500 x g )に入れて脱気します。 注意: この遠心分離により、気泡が上面に移動し、その結果、短時間で除去されます。</li>
	<li>脱気したPDMS溶液をシリコンウェーハモールドに注ぎます。</li>
	<li>再度脱気して、金型表面に閉じ込められた気泡を取り除きます。</li>
	<li>PDMSを60°Cのオーブンで1時間50分間硬化させます(図3M)。</li>
	<li>メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します(図3N)。</li>
	<li>PDMSパーツをはがし、カッティングマットの上に逆さまに置きます。</li>
	<li>かみそりを使用して、PDMS部品を最終的な形状にカットします(図3O)。</li>
	<li>生検パンチ( 材料表を参照)または先端が鈍い針(図3P)を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。<ol><li>胚入口穴には、直径4mmのパンチを使用します。</li>
		<li>胚出口の穴には、直径1.3 mmのパンチを使用します。</li>
		<li>ガス入口穴には、2mmパンチを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>スコッチテープを使用して、PDMSのパターン化された表面に残っている可能性のある粒子を取り除きます。</li>
	<li>24 mm x 60 mmの長方形のスライドガラスを最初にアセトンで洗浄し、次にIPAで洗浄します。</li>
	<li>ろ過された空気源に接続されたエアガンでガラス表面を乾燥させます。</li>
	<li>スライドガラスを250°Cのホットプレートに2時間置き、脱水ベークを適用します(図3Q)。</li>
	<li>表面の汚染を防ぐために、スライドガラスをビーカーで覆います。</li>
	<li>パターン化された面を上にしてPDMSを配置し、脱水ガラスをプラズマクリーナーにスライドさせます(材料の表を参照)。</li>
	<li>PDMSとスライドガラスを酸素プラズマで18 Wで30秒間処理します。</li>
	<li>PDMSをスライドガラス上に置き、パターン化された表面をスライドガラスに向けて、共有結合 を介して マイクロチャネルをシールします(図3R)。</li>
	<li>ピンセットを使用してPDMS部品をスライドガラスにそっと押し付け、完全なコンフォメーション接触を確保します。</li>
	<li>完成したマイクロ流体チップを室温で一晩保管し、ボンディングが最終的な強度に達するようにします。</li>
</ol>3.ショウジョウバエ胚の調製
<ol><li>オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレート(1.5%寒天、25%リンゴジュース、2.5%スクロース)に卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の所望の発育時間にプレートを集める。 注:本実験では、プレートを140分で収集し、細胞化段階17で胚を調製および選別しました。</li>
	<li>寒天に胚卵洗浄液(0.12 M NaCl、0.04% Triton-X 100)を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。</li>
	<li>胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌します。組織ふるいを通して胚をこすり、水で漂白剤溶液を完全に洗い流します。</li>
	<li>胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄を入れた90mmガラスのペトリ皿に胚を移します。</li>
	<li>解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。 注:このアプリケーションでは、細胞化段階の胚が選択されました。適切な発達段階の選択を確実にする方法の詳細な説明は、 ショウジョウバエ17の実験室ハンドブックに記載されています。</li>
</ol>4. マイクロ流体チップを用いたショウジョウバエ胚への機械的刺激の適用
<ol><li>7つの胚マイクロチャネルすべてを、メイン胚導入ポートから0.4 μmのフィルターIPAで充填してプライミングします。</li>
	<li>IPAを0.4μmのろ過された脱イオン(DI)水と交換します。</li>
	<li>DI水を胚卵洗浄液に置き換えます。</li>
	<li>ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。</li>
	<li>胚を胚導入ポートにピペットで入れます(図4A)。</li>
	<li>ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSIの負圧(つまり、真空)を適用し、胚のマイクロチャネルを開きます。</li>
	<li>マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列し、胚のマイクロチャネルに定着するようにします(図4B)。</li>
	<li>同時に入る複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから再び下に傾けて詰まりを取り除きます。</li>
	<li>必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。</li>
	<li>胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。</li>
	<li>マイクロ流体チップを水平位置に戻します(図4C)。</li>
	<li>圧力計付きのポータブル陽圧源( 材料表を参照)をガス入口に接続して、3PSI圧縮を適用します(図4D)。</li>
	<li>圧力計を継続的にチェックして、一貫した圧縮レベルが適用されていることを確認します。</li>
	<li>機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。</li>
	<li>圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、ガス入口に真空を適用して胚を解放します。</li>
	<li>次に、マイクロ流体チップを上方に傾けて、胚が胚導入口に向かって移動する(図4E)。</li>
	<li>ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。 注:収集時に、ショウジョウバエを成虫に成長させることによって、胚発生と生存能力に対する圧迫の影響を調査できます。マイクロ流体デバイスのハイスループット処理能力により、多数のサンプルを必要とするダウンストリームオミクスベースのアッセイで胚を使用することもできます(図2)。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introductory+review+of+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li>
<li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li>
<li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanogenetics%3A+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li>
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<li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+driving+force%3A+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function%2C+fate%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li>
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<li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392(2020).</li>
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<li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+tools+for+mechanobiology%3A+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162(2019).</li>
<li>Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li>
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<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006(2011).</li>
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<li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241(2020).</li>
<li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li>
</ol>

著者は、この原稿に記載されている製品に金銭的利益はなく、他に開示するものは何もありません。

この記事では、何百もの ショウジョウバエ 胚全体に機械的刺激を自動的に整列させ、固定し、正確に適用するマイクロ流体デバイスの開発について説明しています。マイクロ流体システムと薄いガラスカバーガラスの統合により、刺激中に高解像度の共焦点顕微鏡で胚をイメージングすることができました。マイクロ流体デバイスは、下流の生物学的アッセイを実行するための刺激直後に胚を収集することも可能にしました。このデバイスの設計上の考慮事項、製造方法、および特性評価について詳細に説明しました。シリコンウェーハモールド製造プロトコルにより、高アスペクト比のトレンチを備えたフォトレジストの均一な厚膜が可能になりました。
この製造アプローチを成功させるには、ベーキングステップの温度を下げ、フォトレジストでコーティングした後のシリコンウェーハの加熱および冷却速度を最小限に抑えることが重要です。これを適切に行わないと、フォトレジストコーティングが簡単に剥離し、金型の形状を変更する可能性があります。シリコンウェーハモールドが正常に製造されると、加熱および冷却サイクル2...

生命システムは、その生涯を通じて常にさまざまな機械的入力を経験し、応答します1。メカノトランスダクションは、発達障害、筋肉や骨の喪失、機械的環境によって直接的または間接的に影響を受けるシグナル伝達経路を介した神経病理学など、多くの疾患に関連しています2。しかし、機械受容性シグナル伝達経路4における機械的刺激3によって制御される遺伝子やタンパク質はほとんど分かっておらず5、機械的制御機構の解明や病的メカノトランスダクションに関連する疾患の分子標的の同定は進んでいません6,7。.メカノバイオロジー研究を関連する生理学的プロセスに投影する際の制限要因の1つは、無傷の多細胞生物の代わりに、従来の培養皿で個々の細胞を使用することです。ショウジョウバエ(ショウジョウバエ)などのモデル生物は、動物の発生に関与する遺伝子、シグナル伝達経路、およびタンパク質の理解に大きく貢献しています8,9,10。しかし、ショウジョウバエなどの多細胞モデル生物をメカノバイオロジー研究に利用することは、実験ツールの課題によって妨げられてきました。様々な刺激を準備、ソート、イメージング、または適用するための従来の技術は、ほとんどが手動操作を必要とする。これらのアプローチは時間がかかり、専門知識を必要とし、ばらつきをもたらし、実験計画とサンプルサイズを制限します11。最近のマイクロテクノロジーの進歩は、非常に高いスループットと高度に制御された実験パラメータを備えた新しい生物学的アッセイを可能にするための優れたリソースです12、13、14。
本稿では、ショ ウジョウバエ の数百個の胚全体に一軸圧縮の形で機械的刺激を整列させ、固定し、正確に適用するための強化されたマイクロ流体デバイスの開発について説明します15(図1)。マイクロ流体システムとガラスカバーガラスの統合により、刺激中のサンプルの高解像度共焦点イメージングが可能になりました。また、マイクロ流体デバイスは、オミクスアッセイを実行するための刺激後の胚の迅速な収集を可能にしました(図2)。このデバイスの設計上の考慮事項の説明、ならびにソフトリソグラフィおよび実験的特性評価を使用した製造を本明細書に記載する。このようなデバイスのシリコンウェーハモールドを製造するには、高アスペクト比(AR)トレンチ(AR >5)を備えた大面積にわたって厚いフォトレジスト(厚さ>200μm)を均一にコーティングする必要があるため、この方法は従来のフォトリソグラフィモールド製造プロトコルを大幅に変更しました。このようにして、この方法は、フォトレジストの取り扱い、接着、コーティング、パターニング、および現像を容易にした。さらに、潜在的な落とし穴とその解決策についても説明します。最後に、この設計および製造戦略の多様性は、 ショウジョウバエ 卵室や脳オルガノイドなどの他の多細胞システムを使用して実証されました16。

<table><tbody><tr><td>100 mLの三角穴あきプラスチックビーカー、60 mmのシャーレ</td><td>フィッシャー</td><td>14-955-111B</td><td>空気穴付きパーフェレート</td></tr><tr><td>100 mm P B <100> 0-100 500um SSP テストグレード Si ウエハー</td><td>大学ウエハー</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>テッド・ペラ</td><td>15110</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td></td><td></td><td>ブランド固有ではない</td></tr><tr><td>鈍い針セット</td><td>CML 供給</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>コンタクト マスク アライナー</td><td>クインテル</td><td>Q4000 MA</td><td></td></tr><tr><td>カッティング マット</td><td>ダーレ</td><td>ヴァンテージ 10670</td><td>サイズ: 24" x 36"</td></tr><tr><td>開発者</td><td>Kayaku Advance Materials</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>ダイレクトライト リトグラフ</td><td>ハイデルベルク</td><td>MLA100</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td>透過光付き</td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ガラス スライド</td><td>ワーナー インスツルメンツ</td><td>〒64-0710&nbsp;(CS-24/60)</td><td></td></tr><tr><td>HMDS Vapor Prime Oven</td><td>Yes Engineering</td><td>YES-3TA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>ブランド指定なし</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Labnet</td><td>I5110A</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td>ブランド指定なし</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>ポータブル圧力源</td><td>Hygger 最も静かな</td><td>HGD946</td><td></td></tr><tr><td>圧力計</td><td>コールパーマー</td><td>EW-68950-25</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ローレル</td><td>WS-650-8B</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン (PFOCTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>フィッシャー</td><td>AAA16046AP</td><td></td></tr><tr><td>チューブサンゴ</td><td>バン</td><td>02-587-1A</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>コールパー</td><td>マーUX-08895-05</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-07164-87</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

胚形成中、協調的な細胞運動は、遺伝子発現および活性を調節する機械的な力を生成する。このプロセスを研究するために、吸引やカバーガラス圧縮などのツールを使用して、胚全体を機械的に刺激してきました。これらのアプローチは、不正確であり、手動処理を必要とし、同時に数個の胚しか処理できないため、実験計画を制限します。マイクロ流体システムは、スループットと精度を向上させながら、このような実験タスクを自動化する大きな可能性を秘めています。この記事では、ショウジョウバエ メラノガスター(ショウジョウバエ )胚全体を正確に圧縮するために開発されたマイクロ流体システムについて説明します。このシステムは、空気圧で作動する変形可能な側壁を備えたマイクロチャネルを備えており、胚の整列、固定化、圧縮、および刺激後の収集を可能にします。これらのマイクロチャネルを7つのレーンに並列化することにより、安定したまたは動的な圧縮パターンを数百の ショウジョウバエ 胚に同時に適用できます。このシステムをガラスカバーガラス上に製造することで、高解像度顕微鏡によるサンプルの機械的刺激とイメージングを同時に行うことができます。さらに、PDMSのような生体適合性材料の利用と、システム内を流体を流す能力により、このデバイスは媒体依存サンプルを用いた長期実験が可能です。このアプローチにより、サンプルに機械的にストレスを与える手動取り付けの必要性もなくなります。さらに、マイクロチャネルからサンプルを迅速に収集できるため、従来の機械的刺激アプローチでは達成できない大量のサンプルを必要とするオミクスアッセイを含む、刺激後の分析が可能になります。このシステムの形状は、異なる生物学的システムに対して容易に拡張可能であり、多数の分野が、高いサンプルスループット、機械的刺激または固定化、および自動アライメントを含む本明細書に記載される機能的特徴から利益を得ることを可能にする。

マイクロ流体システムは、変形可能なPDMS側壁によって分離された2つのサブコンパートメントに分割されています。最初のコンパートメントは、 ショウジョウバエ の胚が導入され、自動的に整列され、整列され、圧縮される液体システムです。2番目のコンパートメントは、圧縮チャネルの有効幅を正確に制御するために、圧縮チャネルの両側のガス圧力が行き止まりのマイクロチャネル を介して 制御されるガスシステムです。マイクロ流体デバイスは、底部がスライドガラスで密閉されているため、マイクロ流体デバイスの関連寸法に対するサンプルの高解像度ライブイメージングが可能です(補足図2)。
ショウジョウバエ胚などの多細胞生物は、所望の胚発生段階で選択される。ショウジョウバエの胚の場合、胚のサイズは孵化するまで変化しないため、すべての発生段階がこのアプローチと等しく互換性があります。選択されたサンプルは、ガラスマイクロピペットを使用して、大きな入口(すなわち、直径4mm)を通してマイクロ流体デバイスに導入されます...

本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

このプロトコルでは、マイクロフルイディクス技術を製造および使用して、サンプルスループット、自動処理、およびサンプルを視覚化しながら機械的ストレスを正確に適用する機能における実験上の利点を活用する方法について説明します。この技術は、胚やオルガノイドなどの多細胞生物の固定化、整列、およびライブイメージングのための手動処理を最小限に抑えます。また、メカノバイオロジー研究のために機械的圧縮を適用することもできます。このマイクロ流体チップの高アスペクト比機能を備えた金型の製造は、従来の微細加工技術では困難な場合があります。このビデオ記事で説明されているヒントは、これらの課題を克服できます。まず、シリコンウェーハを最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコールで洗浄します。シリコンウェーハを摂氏250度のホットプレートに30分間置きます。脱水焼くために。シリコンウェーハを蒸気プライムオーブンでヘキサメチルジシロキサンでコーティングします。SU-8 2100フォトレジストのボトルを摂氏60度のオーブンに15分間置き、粘度を下げます。ホットプレートに置かれたシリコンウェーハの1インチごとに、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、1ミリリットルの加熱されたフォトレジストを注ぎます。最初に毎分250回転で30秒間、次に毎分350回転でさらに30秒間、どちらも毎秒100RPMの加速でプリスピンを適用します。次に、最初に毎分500回転で毎秒100 RPMの加速度で15秒間スピンを適用し、次に毎秒1, 450回転で毎秒300 RPMの加速度で30秒間スピンを適用します。クリーンルームスワブでエッジビードを取り除き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します。シリコンウェーハをフォトマスクを通してセンチメートル四方の350ミリジュールのUV光にさらします。コンタクトマスクアライナーを使用して、シリコンウェーハに露光後ベークを適用し、室温まで冷却します。ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます。ビーカーに金属メッシュを置きます。シリコンウェーハを逆さまに金属メッシュの上に置きます。シリコンウェーハを現像液に沈め、スターラーをオンにした状態で30分間放置します。シリコンウェーハを、40キロヘルツで1時間新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理装置に移します。次に、ビーカーからウェーハを取り出し、新しい現像液で洗浄します。PDMSベースと硬化剤とを10対1の比率で混合することにより、プリキュアPDMS溶液を調製します。混合物を室温で5分間500gの遠心分離機に入れて脱気します。プリキュアPDMSをシリコンウェーハに注ぎ、再度脱気します。最後に、未硬化のPDMSを摂氏60度のオーブンに入れて硬化させます。メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します。生検パンチ、または先端が鈍い針を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。プラズマ処理後、PDMSをスライドガラス上にパターン面を向けてスライドガラス上に置き、共有結合によってマイクロチャネルを封止します。オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレートに卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の望ましい発育時間にプレートを集める。寒天に胚卵洗浄液を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌する。組織ふるいを通して胚をこすり、漂白剤溶液を水で徹底的に洗い流します。胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄で90ミリメートルのガラスペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。7つの胚マイクロチャネルすべてを、メインの胚導入ポートから0.4マイクロメートルのろ過IPAで充填することにより、プライミングします。IPAを0.4マイクロメートルのろ過された脱イオン水と交換します。次に、DI水を胚卵洗浄液に交換します。ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。次に、胚を胚導入ポートにピペットで入れ、ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSI陰圧を加え、胚マイクロチャネルを開きます。次に、マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列して胚のマイクロチャネルに定着します。同時に入ってくる複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから、再び下に傾けて詰まりを取り除きます。必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。次に、マイクロ流体チップを水平位置に戻します。圧力計付きのポータブル陽圧源をガス入口に接続して、3つのPSI圧縮を適用します。機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。マイクロ流体チャネル内の蛍光顕微鏡下で胚を調べます。圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、胚を解放するためにガス入口に真空を適用します。次に、マイクロ流体チップを上に傾けて、胚が胚導入ポートに向かって下方に移動します。ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。マイクロ流体デバイスの機能性は、ショウジョウバエの胚を圧縮チャネルにロードし、ガスチャネルに陽圧を加えることによって実験的に決定されました。胚は、真空下または中性圧状態で有意な圧迫を受けません。陽圧が加えられると圧縮されます。顕微鏡下での胚の減少幅の測定は、ガス圧を使用して目標の圧縮レベルを取得する方法を示しています。このようにして作られたマイクロ流体デバイスは、固定化されたサンプルの化学的刺激を可能にする。この刺激により、高い時空間イメージングが可能になります。発生生物学における基本的な問題は、発生中のタンパク質と遺伝子発現を機械的な力がどのように制御するかということです。この技術により、一度に多数の胚に機械的刺激を加えることができるため、比較プロテオミクスまたはトランスクリプトミクス実験を行うのに十分な量のタンパク質とRNAを分離することができます。これにより、研究者は機械的な力に敏感なタンパク質や遺伝子についてさらに学ぶことができます。

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