ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激
December 23rd, 2022
本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。
このプロトコルでは、マイクロフルイディクス技術を製造および使用して、サンプルスループット、自動処理、およびサンプルを視覚化しながら機械的ストレスを正確に適用する機能における実験上の利点を活用する方法について説明します。この技術は、胚やオルガノイドなどの多細胞生物の固定化、整列、およびライブイメージングのための手動処理を最小限に抑えます。また、メカノバイオロジー研究のために機械的圧縮を適用することもできます。
このマイクロ流体チップの高アスペクト比機能を備えた金型の製造は、従来の微細加工技術では困難な場合があります。このビデオ記事で説明されているヒントは、これらの課題を克服できます。まず、シリコンウェーハを最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコールで洗浄します。
シリコンウェーハを摂氏250度のホットプレートに30分間置きます。脱水焼くために。シリコンウェーハを蒸気プライムオーブンでヘキサメチルジシロキサンでコーティングします。
SU-8 2100フォトレジストのボトルを摂氏60度のオーブンに15分間置き、粘度を下げます。ホットプレートに置かれたシリコンウェーハの1インチごとに、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、1ミリリットルの加熱されたフォトレジストを注ぎます。最初に毎分250回転で30秒間、次に毎分350回転でさらに30秒間、どちらも毎秒100RPMの加速でプリスピンを適用します。
次に、最初に毎分500回転で毎秒100 RPMの加速度で15秒間スピンを適用し、次に毎秒1, 450回転で毎秒300 RPMの加速度で30秒間スピンを適用します。クリーンルームスワブでエッジビードを取り除き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します。シリコンウェーハをフォトマスクを通してセンチメートル四方の350ミリジュールのUV光にさらします。
コンタクトマスクアライナーを使用して、シリコンウェーハに露光後ベークを適用し、室温まで冷却します。ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます。ビーカーに金属メッシュを置きます。
シリコンウェーハを逆さまに金属メッシュの上に置きます。シリコンウェーハを現像液に沈め、スターラーをオンにした状態で30分間放置します。シリコンウェーハを、40キロヘルツで1時間新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理装置に移します。
次に、ビーカーからウェーハを取り出し、新しい現像液で洗浄します。PDMSベースと硬化剤とを10対1の比率で混合することにより、プリキュアPDMS溶液を調製します。混合物を室温で5分間500gの遠心分離機に入れて脱気します。
プリキュアPDMSをシリコンウェーハに注ぎ、再度脱気します。最後に、未硬化のPDMSを摂氏60度のオーブンに入れて硬化させます。メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します。
生検パンチ、または先端が鈍い針を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。プラズマ処理後、PDMSをスライドガラス上にパターン面を向けてスライドガラス上に置き、共有結合によってマイクロチャネルを封止します。オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレートに卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の望ましい発育時間にプレートを集める。
寒天に胚卵洗浄液を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌する。組織ふるいを通して胚をこすり、漂白剤溶液を水で徹底的に洗い流します。
胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄で90ミリメートルのガラスペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。7つの胚マイクロチャネルすべてを、メインの胚導入ポートから0.4マイクロメートルのろ過IPAで充填することにより、プライミングします。
IPAを0.4マイクロメートルのろ過された脱イオン水と交換します。次に、DI水を胚卵洗浄液に交換します。ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。
次に、胚を胚導入ポートにピペットで入れ、ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSI陰圧を加え、胚マイクロチャネルを開きます。次に、マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列して胚のマイクロチャネルに定着します。同時に入ってくる複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから、再び下に傾けて詰まりを取り除きます。
必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。次に、マイクロ流体チップを水平位置に戻します。
圧力計付きのポータブル陽圧源をガス入口に接続して、3つのPSI圧縮を適用します。機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。マイクロ流体チャネル内の蛍光顕微鏡下で胚を調べます。
圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、胚を解放するためにガス入口に真空を適用します。次に、マイクロ流体チップを上に傾けて、胚が胚導入ポートに向かって下方に移動します。
ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。マイクロ流体デバイスの機能性は、ショウジョウバエの胚を圧縮チャネルにロードし、ガスチャネルに陽圧を加えることによって実験的に決定されました。胚は、真空下または中性圧状態で有意な圧迫を受けません。
陽圧が加えられると圧縮されます。顕微鏡下での胚の減少幅の測定は、ガス圧を使用して目標の圧縮レベルを取得する方法を示しています。このようにして作られたマイクロ流体デバイスは、固定化されたサンプルの化学的刺激を可能にする。
この刺激により、高い時空間イメージングが可能になります。発生生物学における基本的な問題は、発生中のタンパク質と遺伝子発現を機械的な力がどのように制御するかということです。この技術により、一度に多数の胚に機械的刺激を加えることができるため、比較プロテオミクスまたはトランスクリプトミクス実験を行うのに十分な量のタンパク質とRNAを分離することができます。
これにより、研究者は機械的な力に敏感なタンパク質や遺伝子についてさらに学ぶことができます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
このプロトコルは、ショウジョウバエの胚を整列させ固定するためのマイクロ流体システムの設計と使用法を説明します。高い解像度のイメージングとサンプルの回収を可能にし、手動操作を最小限に抑えます。
主要な研究要素
科学の分野
- マイクロ流体工学
- メカノバイオロジー
- 胚のイメージング
背景
- マイクロ流体工学技術は、サンプルのスループットと自動化された取り扱いを向上させます。
- 正確な機械的ストレスの適用は、メカノバイオロジー研究にとって重要です。
- 従来のマイクロファブリケーション技術では、高アスペクト比の特徴を作ることが困難な場合があります。
- このプロトコルはこれらの課題を克服するためのヒントを提供します。
研究の目的
- 胚の固定と整列のためのマイクロ流体システムを製作すること。
- 多細胞生物の生体イメージングを可能にすること。
- メカノ生物学的分析のための機械的圧縮を適用すること。
使用法
- アセトンとイソプロピルアルコールでシリコンウェーハを洗浄すること。
- マイクロ流体チップのモールドを製作すること。
- 胚の整列と固定すること。
- 機械的ストレスの適用中に高解像度のイメージングを行うこと。
主要な結果
- 数百の胚の成功した整列と固定。
- 高解像度のイメージング能力のデモンストレーション。
- 分析のための機械的圧縮の効果的な適用。
- 他の多細胞生物学系への適用可能性の確認。
結論
- このマイクロ流体システムは手動操作を大幅に削減します。
- 胚のメカノバイオロジーの研究能力を向上させます。
- このアプローチは様々な多細胞生物に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic compression systems enable scalable mechanostimulation of multicellular organisms, addressing a critical bottleneck in mechanobiology and developmental biology research. This technology enhances predictive confidence in gene and protein expression studies by allowing precise, parallelized mechanical perturbation and quantitative analysis. Its integration supports robust target validation and de-risking at early discovery and preclinical inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of mechanosensitive pathways in whole-organism models.
- Supports functional target validation by correlating mechanical stimuli with gene and protein expression changes.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses through high-throughput, quantitative outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, immobilized biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical stimulation protocols to ensure reproducibility and quantitative comparability.
- Enables scalable sample processing for omics-based assay development and compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanostimulation outputs with disease-relevant gene and protein expression profiles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, parallel sample analysis.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker identification in multicellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic compression system fits from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and high-throughput sample preparation for omics analyses.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by enabling controlled mechanical perturbation and quantitative readouts.
- Screening: Delivers reproducible, scalable sample immobilization and stimulation for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mechanical response, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting large-scale, mechanistically informed biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse multicellular model systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates sample handling, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by supporting robust, quantitative mechanobiology data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics fabrication and mechanobiology experimental design.
- Needs access to high-resolution imaging and pressure-controlled microfluidic instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable geometry allows use across various multicellular model systems.
- Sample throughput and device scalability are limited by fabrication and handling infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
