Name: 自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ自然免疫細胞死におけるカスパーゼ活性化の評価法。インフルエンザAウイルス感染モデルを用いて、ピロプトーシス・アポトーシス・ネクロプトーシスなどの細胞死経路を解析し、疾患メカニズムと治療戦略への洞察を得る。

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カンネガンティ研究室のメンバーのコメントや提案に感謝し、科学編集のサポートをしてくれたJ.ガレット博士に感謝します。私たちの研究室での作業は、国立衛生研究所(NIH)の助成金AI101935、AI124346、AI160179、AR056296、およびCA253095(T.-D.K.)およびアメリカのレバノンシリア関連慈善団体(T.-D.K.)によってサポートされています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

T.-D.K.はファイザーのコンサルタントです。

カスパーゼの切断と活性化をモニタリングすることで、自然免疫応答の一部としての自然免疫PCD活性化の最も包括的な画像の1つが得られます。ここに記載のプロトコルは、IAV、HSV1、およびF.ノビシダ感染および滅菌トリガーLPS + ATPに応答してカスパーゼ活性化をモニターする戦略を示すが、多数の他の刺激がPCDを誘導することができ、いくつかの刊行物44、48、49、50、51、52、53、54、56に示されているように、この方法で使用することができ</su...

自然免疫系は、感染中および組織損傷や恒常性の変化などの無菌刺激に応答して、最初の防御線として機能します。細胞表面と細胞質にある自然免疫センサーは、病原体または損傷に関連する分子パターン(それぞれPAMPまたはDAMP)に応答し、炎症性シグナル伝達経路と細胞応答を引き起こします。自然免疫応答の重要なプロセスの1つは、感染または損傷した細胞を除去し、さらなる自然免疫応答および適応免疫応答を促進するための細胞死の誘導です。プログラム細胞死(PCD)は、種を超えて高度に保存されたプロセスであり、自然免疫メカニズムとしての進化的重要性を強調しています。
すべての細胞タイプで活性化できるいくつかの自然免疫PCD経路があります。カスパーゼは、高度に保存された細胞内システイン依存性プロテアーゼの重要なファミリーであり、従来の非炎症性アポトーシス経路だけでなく、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなどの炎症性PCD経路を含む多くのPCD経路で重要です1,2,3,4,5 .明確に定義された11のヒトカスパーゼと10のマウスカスパーゼ、および機能的である可能性のある疑似カスパーゼがあり、ほとんどは、活性化のために切断を必要とする不活性な単量体または二量体のプロカスパーゼとして構成的に発現されます6,7。カスパーゼには、多タンパク質複合体の動員と形成のための重要なドメインも含まれています。これらには、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11に見られるカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン(CARD)、またはカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10に見られるデスエフェクタードメイン(DED)が含まれます。カスパーゼは、タンパク質分解活性と多タンパク質複合体を形成する能力の両方を通じて、自然免疫PCDの重要な推進力です。
自然免疫PCDにおけるカスパーゼの役割は、開始カスパーゼであるカスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10が実行者カスパーゼ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7を活性化して細胞死を引き起こすアポトーシスで最初に確認されました8,9,10,11,12。イニシエーターカスパーゼは、多様なシグナル伝達カスケードによって活性化することができる。外因性経路は細胞外リガンド誘発性死受容体シグナル伝達を介してカスパーゼ-8を活性化し、内因性経路はミトコンドリア完全性の破壊を介してカスパーゼ-9を活性化します13。活性化された開始カスパーゼは、実行者カスパーゼの大小の触媒サブユニットを分離するリンカーを切断して、それらの活性型を生成します。次に、死刑執行者のカスパーゼは基質を切断して細胞を分解し、DNA分解、膜ブレッブ、核断片化、およびアポトーシス体の放出をもたらします14,15。このプロセスは典型的には、エフェロサイトーシスによる死にかけている細胞の即時クリアランスと相まって、非溶解性および非炎症性の細胞死の形態で終わる16。しかし、エフェロサイトーシスの欠陥または食細胞の欠如は、アポトーシス細胞の蓄積につながる可能性があり、その後、溶解性および炎症性細胞死を経験します17,18。
カスパーゼ-1(ヒトおよびマウス)、カスパーゼ-4およびカスパーゼ-5(ヒト)、およびカスパーゼ-11(マウス)を含む炎症性カスパーゼは、パイロトーシスと呼ばれる炎症性自然免疫PCD(III-PCD)の形態の間に活性化されることが発見されている。カスパーゼ-1の活性化は、細胞質自然免疫センサー、アダプター分子(CARD[ASC]を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)、およびカスパーゼ-1を含む多タンパク質複合体であるインフラマソームの形成に関連しています。この複合体の形成により、カスパーゼ-1は近接媒介自己タンパク質分解を受けてその活性型を放出し、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18、および孔形成分子ガスダーミンD(GSDMD)を含む標的基質を切断することができます19,20,21,22,23。.カスパーゼ-11、カスパーゼ-4、およびカスパーゼ-5は、リポ多糖(LPS)19,20などのPAMPを感知した後、インフラマソームの上流形成なしにGSDMDを活性化することもできます。これらのカスパーゼは、細胞質LPSに結合すると、二量体化とそれに続くオリゴマー化および自己切断を受けて活性化され、非標準的なインフラマソーム活性化24,25,26およびカスパーゼ-1活性化を細胞内因性的に誘導してIL-1βおよびIL-18成熟を誘導する20。これらの炎症誘発性サイトカインの成熟と放出は、これらのカスパーゼを「炎症性」として特徴付けます。さらに、アポトーシスカスパーゼ-8はインフラマソームに局在し、アポトーシスプロセスとパイロトーシスプロセスの間のリンクを提供することがわかっています。研究によると、アポトーシスカスパーゼ-8は、ネクロプトーシスと呼ばれる別の形態のPCDを調節するためにも重要であることがわかっています。カスパーゼ-8の喪失は、自発的に受容体相互作用するセリン-スレオニンキナーゼ3(RIPK3)媒介混合系統キナーゼドメイン様シュードキナーゼ(MLKL)活性化をもたらし、ネクロトーシスのIII-PCD経路を駆動します27,28,29,30,31,32,33,34,35。
カスパーゼは歴史的に、カスパーゼが開始する細胞死の種類に基づいて「アポトーシス」または「炎症性」に分類されてきましたが、カスパーゼを介した自然免疫PCD経路の間に広範なクロストークがあることを示唆する証拠が増えています3,4。例えば、インフラマソーム由来の炎症性カスパーゼ−1は、その標準的な活性化部位34でアポトーシスカスパーゼ−7を切断する。カスパーゼ-1の活性化は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP1)36などのアポトーシス基質の切断にもつながります。GSDMDを欠く細胞では、カスパーゼ-1はカスパーゼ-3を切断することもできる37,38。さらに、標準的にアポトーシスカスパーゼ-3は、ガスデルミンE(GSDME)を切断してPCD17,18を誘導し、GSDMDを不活性型40に処理することもできます。さらに、インフラマソーム複合体へのカスパーゼ-8の動員が観察されており39、40、41、42、43、44、45、およびカスパーゼ-8は、標準的および非標準的なインフラマソーム活性化の重要な調節因子である39。また、多くの炎症状態においてカスパーゼ-8およびカスパーゼ-1には重複した冗長な役割があり、パイロトーシス、アポトーシス、およびネクロトーシス成分の活性化を特徴とする自然免疫PCDは、疾患スペクトル全体で発生します39、46、47、48、49、50。
炎症性カスパーゼとアポトーシスカスパーゼのクロストークに基づいて、自然免疫とPCDの機構的理解における重要なギャップが特定され、PANoptosisの発見につながりました。PANoptosisは、病原体、PAMP、DAMP、および恒常性の変化に応答して活性化され、他の細胞死経路からの成分を統合する多面的な高分子複合体であるPANoptosomesによって制御されるIII-PCDのユニークな形態です44,50,51,52,53,54,55.PANoptosisの生物学的効果の全体は、パイロトーシス、アポトーシス、またはネクロトーシスだけでは個別に説明できません3,4,35,36,39,46,47,48、PANoptosisは、カスパーゼ-1、カスパーゼ-11、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、および/またはカスパーゼ-7を含む複数のカスパーゼの活性化によって特徴付けられるためです。コンテキストに応じて44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 .PANoptosisは、感染症や炎症性疾患、癌やがん治療にますます関与しています3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 、54、56 、57,58,59,60,61,62,63,64,65,66。
アポトーシス、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなど、細胞死経路全体でカスパーゼが果たす重要な役割を考えると、それらの活性化を特徴付け、PCD経路の完全な複雑さを理解するための技術を開発することが重要です。ここでのプロトコルは、細胞を刺激し、その後のカスパーゼの活性化を測定する方法を詳述しています(図1)。この方法は、カスパーゼの活性化に一般的に必要とされるカスパーゼのタンパク質分解切断を、カスパーゼの研究手段として活用しています。ウェスタンブロッティングにより、タンパク質サイズを決定できるため、不活性なプロカスパーゼとその活性化された切断型を明確に可視化して区別することができます。
このプロトコルの主な利点は、1)内因性細胞の単一集団から複数のカスパーゼの活性化を並行して評価して、PCD活性化をより正確に決定できること、および2)広範なトレーニングや高価な機器を必要としない比較的単純なラボ技術の使用です。これまでのプロトコルでは、ウェスタンブロッティング、蛍光レポーター、または抗体染色を使用して、培養上清、細胞および組織溶解物、全細胞中のカスパーゼ活性化を顕微鏡検査、およびin vivoでモニターしていました67、68、69、70、71ですが、これらの手法は通常、サンプル中の1つまたは2つのカスパーゼのみをモニターします。さらに、切断時に蛍光を発するカスパーゼ切断部位を含む合成ペプチド基質が、細胞または組織ライセート69におけるカスパーゼ活性化をモニターするために使用されてきたが、これらの基質はしばしば複数のカスパーゼによって切断される可能性があり、この系における個々のカスパーゼの特異的活性化を決定することは困難である。さらに、蛍光レポーターや他のタグベースの方法を使用するのではなく、ウェスタンブロッティングを使用することで、研究者はレポーター遺伝子を持つ特定の細胞株を作成するのではなく、内因性細胞を使用することができます。内因性細胞を使用することには、多くの不死化細胞株が重要な細胞死分子72,73が不足しているという事実を含む複数の利点があり、結果に影響を与える可能性があります。さらに、内因性細胞を使用することで、単一の系統ではなく、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞などの多様な細胞タイプの評価が可能になります。ウェスタンブロッティングは比較的シンプルで費用対効果の高い手法でもあり、大型で高価な装置や複雑なセットアップを必要とせずに、世界中のラボで実施できます。
このプロトコルは、カスパーゼの細胞死依存性および細胞死非依存性機能の両方を理解するために、他の炎症性シグナル伝達経路におけるそれらの足場の役割および機能を含む、生物学全体に広く適用可能である74。この方法を適用することで、自然免疫PCD経路と疾患および状態全体の炎症シグナル伝達の研究における統一されたアプローチが可能になり、このプロトコルを使用して、将来の治療戦略の開発に情報を提供する重要な調節プロセスと機構的接続を特定できます。

<table><tbody><tr><td>0.45 μ;m フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>12% ポリアクリルアミドゲル 10 ウェル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18G 針&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス305195</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G針&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50mLチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 組織培養皿</td><td>コーニング</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182cm2 組織培養フラスコ</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>アクセサリー ホワイト トランストレイ</td><td>サイティバ</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>アンチ&ndash;カスパーゼ-1抗体</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;カスパーゼ-11抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>抗...カスパーゼ-3抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;カスパーゼ-7抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;カスパーゼ-8抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;カスパーゼ-9抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;切断されたカスパーゼ-3抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>アンチ&ndash;切断されたカスパーゼ-7抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>アンチ&ndash;切断されたカスパーゼ-8抗体&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスHRP標識二次抗体&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギHRP標識二次抗体&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>抗ラットHRP標識二次抗体&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>抗&ndash;&beta;-アクチン抗体 (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL トリプチカーゼ 大豆ブロス</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>ビーズバス</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>バイオフォトメーター D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence Imager (Amersham 600)&nbsp;</td><td>サイティバ</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;チャンバー</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>キュベット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (U112 strain)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Gel releaser&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>単純ヘルペスウイルス 1 (HF 株)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>高グルコースDMEM&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>人間の反&ndash;カスパーゼ-1抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>人間反&ndash;カスパーゼ-8抗体</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーター&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>インフルエンザAウイルス(A/プエルトリコ/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>Hoffmann et al.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>細胞株 L929馴染培地</td></tr><tr><td>L-システインを作製&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP 基質</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>標準感度 HRP 基質</td></tr><tr><td>MDCK 細胞</td><td>IAV ウイルス力価測定用</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td> 細胞株</tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 溶液&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>ロシュ</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>電源&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングシェーカー</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS Sigma</td><td></td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S9888</td><td></td></tr>デ<tr><td>オキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>スクエアシャーレ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>ストリッピングバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>スーパーシグナルフェムト HRP 基質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>34580</td><td>高感度 HRP 基質</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロットセミドライシステム&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌由来の超高純度リポ多糖(LPS) 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps Vero</td><td></td></tr><tr><td>cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>cell line for determining HSV1 viral titer</td></tr></tbody></table>

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

自然免疫は、病原体や無菌の侮辱に反応して重要な第一線の防御を提供します。この応答の重要な機構的要素は、感染または損傷した細胞を排除し、免疫応答を伝播するための自然免疫プログラム細胞死(PCD)の開始です。しかしながら、過剰なPCDは炎症および病理学と関連している。したがって、PCDの活性化と調節を理解することは、自然免疫応答を特徴付け、疾患スペクトル全体で新しい治療標的を特定するための中心的な側面です。
このプロトコルは、アポトーシス、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなどの多様なPCD経路に関連することが多いシステイン依存性プロテアーゼのファミリーであるカスパーゼをモニタリングすることにより、自然免疫PCD活性化を特徴付ける方法を提供します。最初の報告では、カスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10が開始カスパーゼとして、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7がアポトーシスのエフェクターカスパーゼとして特徴付けられましたが、後の研究では、炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、およびカスパーゼ-11がパイロトーシスを引き起こすことがわかりました。カスパーゼと他の自然免疫および細胞死分子との間には、以前に定義されたPCD経路全体で広範なクロストークがあることが現在知られており、自然免疫とPCDの機構的理解における重要な知識ギャップを特定し、PANoptosisの特性評価につながります。PANoptosisは、他の細胞死経路からのカスパーゼを含む成分を組み込んだPANoptosome複合体によって調節されるユニークな自然免疫炎症性PCD経路です。
ここでは、様々な刺激に応答したカスパーゼの活性化を評価するための方法が提供される。これらのメソッドは、活性化カスパーゼがタンパク質分解切断を受け、最適な抗体とブロッティング条件を使用したウェスタンブロッティングによって視覚化できるため、 in vitro および in vivoの両方でPCD経路の特性評価を可能にします。同じ細胞集団からの複数のカスパーゼの活性化の評価を可能にするプロトコルとウェスタンブロッティングワークフローが確立されており、PCDプロセスの包括的な特性評価を提供しています。この方法は、発生、恒常性、感染、炎症、および癌の研究分野に適用して、健康と疾患の細胞プロセス全体にわたるPCD経路を評価することができます。

PANoptosisは、多数の細菌、ウイルス、真菌の感染やその他の炎症性刺激に応答して、ならびに癌細胞で観察されています44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62<sup ...

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo (マウス)モデルの両方に応答して、カスパーゼ活性化(カスパーゼ-1、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11)を評価するための包括的な方法について説明しています。

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

このプロトコルは、細胞死プロセスの活性化に関する多面的な理解を提供し、疾患メカニズムへの重要な洞察を提供し、治療戦略に情報を提供することができます。このプロトコルは、より単純な技術の使用に依存しており、活性化を大きく決定するために内因性細胞の単一集団から必須の複数のカスパーゼの活性化にアクセスする。自然免疫細胞死は、感染症から炎症性疾患、癌まで、疾患スペクトル全体に関係しています。カスパーゼ活性化による細胞死の分子メカニズムを理解することは、疾患プロセスへの重要な洞察を提供することができます。研究室のポスドク研究員であるJulieann博士が手順を実演します。骨髄を分離し、BMDMを分化させた後、細胞にインフルエンザAウイルスを感染させます。20プラーク形成単位の感染の多様性で必要なウイルス量を計算します。BMDMから培地を取り出し、500マイクロリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。熱不活化FBSを含まない高グルコースDMEM中の450マイクロリットルのインフルエンザAウイルスを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で加湿インキュベーターで1時間インキュベートして吸収させます。1時間のインキュベーションの終わりに、50マイクロリットルの熱不活性化FBSを加え、プレートを摂氏37度で合計12時間インキュベーターに戻します。12時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出します。上清150マイクロリットルを吸引し、これを廃棄するか、上清分析のために保存します。残った上清は取り除かないでください。次に、ウェルあたり50マイクロリットルのカスパーゼ溶解バッファーと100マイクロリットルの4つのXSDSバッファーを組み合わせて、タンパク質収集溶液を作成します。次に、150マイクロリットルのミックスを各ウェルに加えます。各ウェルについて、混合物をピペットで、溶解した細胞および上清を回収する。ピペッティング中に、ピペットチップでウェルの底をこすり、細胞を破壊します。スクレイピングとピペッティングの後、タンパク質ライセートを標識された1.5ミリリットルチューブに集めます。ヒートブロックを使用して、すべてのチューブを摂氏100度に12分間加熱します。チューブをヒートブロックから取り出し、室温で14, 500 Gで30秒間遠心分離して、不溶性成分をペレット化します。10ウェルを有する12%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動装置を調製する。電気泳動装置にランニングバッファーを満たし、ゲルコームを取り外します。次に、サンプルを摂氏100度で5分間加熱します。ロードする前に、サンプルを室温で14, 500 Gで30秒間遠心分離します。次に、30マイクロリットルのサンプルを各ウェルにゆっくりとロードします。カスパーゼ1、3、7、8ブロットには上清とタンパク質ラ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。...

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

このビデオは、インフルエンザウイルスによる刺激による骨髄由来マクロファージの複数のカスパーゼ活性化の評価を示しています。マクロファージ溶解、ライセートの熱不活性化、および遠心分離に続いて、細胞内カスパーゼを回収し、その後の免疫学的分析を行います。...

マクロファージにおける複数のカスパーゼの活性化の評価

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。...

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。...

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。...

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

インフルエンザAウイルス(IAV)感染は、宿主およびウイルスタンパク質を切断するカスパーゼを活性化し、次に、プロウイルスおよび抗ウイルス機能を有する。阻害剤、RNA干渉、部位特異的突然変異誘発、およびウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR技術を採用することにより、宿主コルタクチンおよびヒストンデアセチラーゼを切断する感染哺乳類細胞におけるカスパーゼが同定された。...

A型インフルエンザウイルス感染時にタンパク質を切断するカスパーゼとそのモチーフの同定

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in...

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

学ぶ自然免疫細胞死におけるカスパーゼ活性化の評価法。インフルエンザAウイルス感染モデルを用いて、ピロプトーシス・アポトーシス・ネクロプトーシスなどの細胞死経路を解析し、疾患メカニズムと治療戦略への洞察を得る。

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

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