ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。

iPS由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に重要な供給源であり、健康と疾患におけるミクログリア生物学を研究するための重要なツールです。成長因子の使用を最小限に抑え、高い純度と収量を達成する簡単なミクログリア分化プロトコルを紹介します。また、完全にヒト化された食作用アッセイを実証します。

iPS細胞由来のミクログリア様細胞は、培地の蒸発に非常に敏感です。細胞培養プレートの隅にあるウェルの使用は避け、生存率を向上させるためにすべての空のウェルを水で満たす必要があります。人工多能性幹細胞(iPSC)が80%コンフルエントになったら、1ミリリットルのDPBSで洗浄し、1ミリリットルの解離試薬を摂氏37度で2分間添加してコロニーを解離させます。

細胞リフターを使用してコロニーを複数回こすり落とし、単一の細胞懸濁液を作成します。懸濁液を収集し、9ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を500倍gで1分間遠心分離し、上清を除去し、1ミリリットルの胚様体(EB)培地に再懸濁します。

10マイクロリットルの細胞を取り、トリパンブルーで1〜2個に希釈します。血球計算盤で細胞を数え、細胞数に基づいて、細胞ストックを100マイクロリットルあたり10, 000細胞の最終希釈まで希釈します。プレーティングセルの場合は、ウェルあたり100マイクロリットルの希釈セルを低接着性の丸底96ウェルプレートに追加します。

プレートを125倍gで3分間遠心分離し、摂氏37度と5%二酸化炭素で4日間インキュベートします。2日目に、マルチチャンネルピペットを使用して、古いハーフEB培地を新しい培地と交換します。プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)を生成するには、1ミリリットルの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。

次に、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2時間、または一晩インキュベートします。EB分化の4日目に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、EBをマトリゲルコーティングされたウェルに移します。ピペットを上下に動かして、EBを井戸から取り除きます。

次に、プレートを傾けたままにして、EBがウェルの端に落ち着くようにします。すべてのEBが落ち着いたら、3ミリリットルの新しく調製したPMP完全培地でEBをウェルの端に保ちながら、静かにピペットで古い培地を交換します。プレートを手動で左右に、そして前後にシャッフルして、ウェル内の細胞を均等に分配します。

次に、プレートを7日間インキュベートして、EBがウェルの底に付着できるようにします。7日後、EBをライトフィールド顕微鏡で4倍の倍率で検査し、ウェルの底に付着していることを確認します。ハーフ培地交換を行い、21日目に完全培地を3ミリリットルのPMP完全培地と交換する。

28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探します。次に、EBを乱すことなく、10ミリリットルのピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を収集します。培地中のPMPを15ミリリットルの円錐管に移します。

採取したPMPを200倍gで4分間遠心分離し、上清を吸引してから、1〜2ミリリットルのミクログリア様細胞またはIMG基礎培地に再懸濁します。次に、前述のように血球計算盤で細胞を数えます。残りの細胞を遠心分離し、PMPを所望の濃度に希釈します。

次いで、新たに調製したIMG完全培地を用いて細胞培養処理プレート上に1平方センチメートル当たり10〜5細胞の濃度で細胞を播種する。生細胞食作用アッセイでは、10〜4番目のPMPを20〜30倍の96ウェルプレートと100マイクロリットルのIMG完全培地にプレートし、分化プロセスを10日間追跡します。アッセイ当日、1ウェルあたり40マイクロリットルの培地を除去し、10マイクロリットルの核染色溶液を加える。

プレートを2時間インキュベートします。標識されたシナプトソームを氷上で解凍し、1分間水超音波処理器を使用して穏やかに超音波処理します。繰り返しますが、すぐにシナプトソームを氷の上に置きます。

標識シナプトソームをIMG完全培地で希釈し、培地50マイクロリットルあたりシナプトソーム1マイクロリットルで希釈する。陰性対照のために、アクチン重合、ひいては食作用を阻害するためにIMG完全培地中に60マイクロモルのサイトカラシンDを調製する。次に、この溶液を10マイクロモルの最終濃度で各ウェルに10マイクロリットル加え、30分間インキュベートします。

プレートをインキュベーターから取り出し、摂氏10度で10分間インキュベートします。プレートを氷上に保ち、シナプトソームを含む培地を50マイクロリットル加えます。プレートを摂氏10度で270倍gで3分間遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に維持します。

プレートをライブセルイメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。次に、20倍の対物レンズを選択します。次に、明視野チャンネルと青色チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)、強度、積分時間、ゲインを調整します。

シナプトソーム蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。ウェルごとにモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します。井戸の中央にある16枚のタイルを取得し、井戸の総面積の約5%を画像化します。

温度を摂氏37度に設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。次に、分析ソフトウェアを開きます。次に、画像を含む実験を開き、[データ削減] アイコンをクリックします。

メニューで、「画像処理」の下の「イメージングスティッチング」を選択し、モンタージュ内の 4 x 4 の個々のタイルから、テキスト原稿に記述されているパラメーターを使用して完全な画像を作成します。これらの画像の DAPI チャネルと RFP チャネルを使用して、強度のしきい値を定義します。画像を開き、[分析] をクリックします。

[分析] で [セルラー分析] を選択し、[検出チャネル] で DAPI チャネルまたは RFP チャネルのいずれかでステッチされた画像を選択します。次に、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、DAPIチャネルの細胞核、またはRFPチャネルのシナプトソーム信号を適切に選択するしきい値とオブジェクトサイズの値を確立します。核の数をカウントするには、[データ削減]メニューに移動し、[画像分析]で[細胞分析]を選択します。

もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でDAPIステッチ画像を選択し、テキスト原稿に記載されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[セル数] を選択します。次に、シナプトソームシグナルの領域を取得するには、[データ削減]メニューに移動し、[分析]で[細胞分析]を選択します。

もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でRFPステッチ画像を選択し、テキスト原稿に詳述されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[オブジェクトの合計領域] を選択します。[データ削減]タブで、[OK]をクリックして、ソフトウェアが取得したすべての画像を分析できるようにします。

画像が分析されたら、各時点の[オブジェクトの合計面積]と[セル数]の値をエクスポートします。次に、オブジェクトの合計面積をセル数で除算して、時間ポイントごとの正規化面積を計算します。複数の治療法または遺伝子型を比較する場合は、指定された式を使用して食作用指数を計算します。

未分化iPS細胞は、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示します。解離したiPS細胞はEBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化4日目までサイズが大きくなりました。EBがPMP生成のためにメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます。

28日目に、大きな細胞質対核比を有する丸い細胞が懸濁液中に現れる。iPS細胞は、ラミニン521コーティングプレートの方がPMP収率が高いため、マトリゲルではなくラミニン521コーティングプレートで培養することを強くお勧めします。PMPをIMG培地に曝露した後、細胞は細長い突起の存在下で小さな細胞質を有するミクログリア様形態を獲得する。

また、ミクログリアの同一性は免疫蛍光染色により検証した。典型的には、細胞の95%以上がIB1を発現し、約90%の細胞がP2RY12およびTMEM119を発現する。ウェスタンブロット解析により、iPSCはヒトシナプトソーム発現シナプスマーカー、シナプトフィジンおよびシナプス後密度タンパク質95の下位運動ニューロンに由来することを確認しました。

対照では、最初の時点と比較して、10時間までに、ほとんどのシナプトソームが飲み込まれ、酸性の細胞内コンパートメントに局在していたため、赤色蛍光シグナルは堅牢でした。サイトカラシンD処理IMGでは、赤色シグナルが0時間および10時間にわたって大幅に減少した場合、検出されたシグナルは貪食イベントに起因することが示されました。取り込まれたシナプトソームの面積は、16時間までの時間とともに増加しました。

しかし、サイトカラシンD処理細胞からの赤色シグナルの面積は時間とともに増加しなかった。iPS由来のミクログリア様細胞は、貪食作用や炎症反応など、神経発達疾患や神経変性疾患の研究など、さまざまな用途に利用できます。