Name: ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶiPS細胞由来ミクログリア様細胞の分化法とヒトシナプトソームを用いた貪食アッセイ。神経炎症や神経変性疾患の研究に有用な生細胞イメージング手法を習得できます。

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著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。

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<li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li>
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<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).</li>
<li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+and+its+regulation%3A+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).</li>
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<li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).</li>
<li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).</li>
<li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可能になります。とはいえ、このプロトコルの制限は、iMGの歩留まりによって特定のアプリケーションが制限される可能性があることです。異なる週からのPMPを蓄積し、分化プロセスを一度に進行させるのに十分な前駆細胞が収集されるまで懸濁液中で均質な培養を維持するために、追加の修飾を実施することができる18。あるいは、EBの分化は、PMPの産生を増加させるために、より高い面積の細胞培養プレートを使用することによってスケールアップすることができる。
分化プロセスを開始するには、ラミニン521コーティングプレートで培養したiPS細胞を使用することを...

ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。
iPS細胞からのミクログリア分化のための複数のプロトコルが、最近、文献6、7、8、9、10に出現した。いくつかのプロトコルの潜在的な欠点には、長期間または長期間の分化、複数の成長因子の追加、および/または複雑な実験手順が含まれる6、9、10。ここでは、iPS細胞をプリミティブマクロファージ前駆体(PMP)と呼ばれる前駆細胞に分化させることで、ミクログリア個体発生の側面を再現する「ユーザーフレンドリーな」分化方法が実証されています7,11。PMPは、前述のように生成され、いくつかの最適化が本明細書12に提示される。PMPは、MYB非依存性の卵黄嚢由来のマクロファージを模倣しており、血液脳関門閉鎖の前に脳に侵入することにより、胚発生中にミクログリアを引き起こします13。PMPをiMGに最終的に分化させるために、HaenselerらとBrownjohnらのプロトコルに基づく高速で簡略化された単一培養法を使用し、iMGがミクログリア富化マーカーを堅牢に発現する効率的なミクログリア分化法を生成するためにいくつかの変更を加えました7,8。この分化法は、iPS細胞の培養に関する専門知識を持ち、ヒトモデルシステムを用いたミクログリア生物学の研究を目的とした研究目標を持つ研究室で再現することができます。
iPS細胞由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に関連する供給源であり、食作用を含むミクログリアの標準機能を調査するための重要なツールです。ミクログリアは、脳とCNSの専門的な食細胞であり、細胞の破片、凝集したタンパク質、および分解されたミエリンを取り除きます14。ミクログリアはまた、シナプスを飲み込むことによるシナプスリモデリングや、病原体の食作用による外部感染に対する防御にも機能します15,16。このプロトコルでは、iMGによる食作用は、iMG巻き込みの材料としてヒトシナプトソームを使用して評価されます。この目的のために、ヒトi3LMNsに由来するシナプトソームを単離するための記載が記載されている。i3LMN由来のヒトシナプトソームは、pH感受性色素で標識されており、in vitroでのファゴソーム処理および分解中に酸性コンパートメント内に局在するシナプトソームの定量を可能にします。ミクログリア巻き込みの動的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために、生細胞顕微鏡を用いた食作用アッセイが示されています。この機能アッセイは、完全なヒトシステムを使用して、健康と病気におけるミクログリア食作用の可能性のある欠陥を調査するための基礎を確立します。

<table><tbody><tr><td>免疫蛍光分析用抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-IBA1ウサギ抗体</td><td>Wako Chemical USA</td><td>NC9288364</td><td>1:350希釈抗</td></tr><tr><td>P2RY12ウサギ抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>1:50希釈抗</td></tr><tr><td>TMEM119ウサギ抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>1:100</td></tr><tr><td>希釈ウェスタンブロット分析用抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-&β;-Tubulinウサギ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td>1:500</td></tr>希釈<tr><td>抗Synaptophysin(SYP)ウサギ抗体</td><td>Abclonal</td><td>A6344</td><td>1:1,000</td></tr>希釈<tr><td>抗PSD95マウス抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB1596</td><td>1:500</td></tr>希釈<tr><td><ストロング>ホウ酸バッファー成分</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸 (100 mM)</td><td>シグマ</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO<サブ>3</サブ>) BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (75 mM)</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;S7653</td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム (25 mM)</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m セルストレーナー</td><td>&nbsp;Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm組織培養処理</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター、ダブルエンド、フラットブレード &ナローブレード、滅菌</td><td>CELLTREAT</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>低接着性 丸底 96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 24 ウェル平底表面改変マルチウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>353847,Primaria</td><td></td></tr> <tr><td>6 ウェル セルクリア フラットボトム表面改変マルチウェル培養プレート</td><td>Corning</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 96 ウェル クリアフラット底面 Corning</td><td></td><td>353872</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>&nbsp;低</td><td>運動ニューロン分化に使用される</td>Corning <td>25058CI</td>解離試薬</tr><tr><td>TrypLE試薬</td><td>Life Technologies</td><td>12-605-010</td><td>ミクログリア分化に使用される解離試薬</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Coating reagents for cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFRメンブレンマトリックス</td><td>コーニング&trade;</td><td>354230</td><td>細胞外マトリックスコーティング試薬</td></tr><tr><td>CellAdhere Laminin-521</td><td>STEMCELL Technology</td><td>77004</td><td>ラミニン 521</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>ホウ酸緩衝液中で0.1 mg/mLに再構成</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;P3655</td><td>ホウ酸バッファー</td></tr><tr><td><ストロング> iPSC培地</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;mTeSR Plusキット</td><td>STEMCELLテクノロジー</td><td>100-0276</td><td>iPSC培地混合した成分を</td></tr><tr><td>EB培地></td><td></td><td></td><td></td>BMP-4の成分</tr>に1x</<tr><td>BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>PHC9534</td><td>最終濃度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>iPSC 培地</td><td></td><td></td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>ROCK阻害剤Y27632</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BD 562822</td><td>最終濃度10 &micro;M</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>最終濃度 20 ng/mL</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>PeproTech</td><td>100-20A</td><td>最終濃度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>PMP ベース培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td> <td>の成分Gibco</td><td>15140122</td><td>最終濃度 100 U/mL</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>ロンザ</td><td>12001-988</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>PMP complete media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>最終濃度 55 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>最終濃度 25 ng/mL</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>PMP ベース培地</td><td></td><td></td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>iMG ベース培地の成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td></td><td>最終濃度12634010 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>N2 サプリメント、100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>最終濃度 100 U/mL</td></tr><tr><td>iMG complete media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>最終濃度 55 &M</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech または Biologend</td><td>200-34 または 577904</td><td>最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>iMG ベース培地</td><td></td><td></td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>最終濃度 5 ng/mL</td></tr><tr><td>TGF-&β;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>最終濃度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td>><<</tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>N2 サプリメント、100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>最終濃度濃度 1x</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)、100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>>><<Compound</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>E</td><td>Calbiochem</td><td>565790</td><td>最終濃度 0.2 &mu;Mおよびストック試薬を1:1エタノールおよびDMSO</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>最終濃度2 &muで2 mMに再構成します。g/mL およびストック試薬を DPBS</td></tr><tr><td>Induction base 培地</td><td></td><td></td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤 Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>最終濃度 10 &mu;ニューロン</td></tr><tr><td>の MComponents of Neuron media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td><td>Gibco</td><td>A3653401</td><td>最終濃度 1x 培地およびサプリメント用</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>N2 サプリメント、100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)、100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>最終濃度 1x</td></tr><tr><td>iPSC ライン この研究で使用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLF2.1J: WT クローン B03</td><td>The Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WTC11 hNIL</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synaptosome isolation reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>87793</td> シ<td>ナプトソームの単離のための細胞溶解試薬</td></tr><tr><td>Phagocytosis assay dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Ready試薬</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo レッド スクシンイミジルエステル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;P36600</td><td>pH感受性色素</td></tr><tr><td><強>その他の細胞培養試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4% 溶液</td><td>AMRESCO</td><td>INC K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>シグマ</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>シグマ</td><td>B9285</td><td>滅菌水中で 40 mM に再構成</td></tr> サイト<tr><td>カラシン D</td><td>シグマ</td><td></td><td>最終濃度 10 & マイクロ;</td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含むM DPBS</td><td>コーニング</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まないDPBS</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>ノックアウトと呼ばれる&nbsp;DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>ヒト胚性および誘導多能性幹細胞の増殖に最適化されたDMEM-F12</td></tr> ラ<tr><td>ミニンマウスタンパク質、天然</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td>ラミニン</td></tr><tr><td><ストロング>ソフトウェアおよび機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>モデル 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 ライブセルイメージングリーダー</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 マイクロプレート リーダーおよびイメージャー ソフトウェア</td><td>Biotek</td><td>バージョン 3.03</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Heat-Shake</td><td>Benchmark</td><td></td><td>チューブ シェーカー</td></tr><tr><td>ウォーター ソニケーター</td><td>エルマ</td><td>モード トランスソニック 310</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。

このプロトコルを使用してiMGを生成するには、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示す未分化iPS細胞から始めることが重要です(図2A)。EB形成のセクションで説明したように維持された解離したiPS細胞は、EBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化の4日目までサイズが大きくなります(図2B)。EBが収集され、PMP生成に適した条件でメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます(図2C)。不健康なEBはプレートから外れるため、排除する必要があります。PMP生成の14日目から21日目まで、潜在的に異なる細胞タイプが出現し、培地中に浮遊する可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります12。28日目に、細胞質と核の比率が大きい丸い細胞が浮遊状態で現れます(図2D)、P...

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に重要な供給源であり、健康と疾患におけるミクログリア生物学を研究するための重要なツールです。成長因子の使用を最小限に抑え、高い純度と収量を達成する簡単なミクログリア分化プロトコルを紹介します。また、完全にヒト化された食作用アッセイを実証します。iPS細胞由来のミクログリア様細胞は、培地の蒸発に非常に敏感です。細胞培養プレートの隅にあるウェルの使用は避け、生存率を向上させるためにすべての空のウェルを水で満たす必要があります。人工多能性幹細胞(iPSC)が80%コンフルエントになったら、1ミリリットルのDPBSで洗浄し、1ミリリットルの解離試薬を摂氏37度で2分間添加してコロニーを解離させます。細胞リフターを使用してコロニーを複数回こすり落とし、単一の細胞懸濁液を作成します。懸濁液を収集し、9ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を500倍gで1分間遠心分離し、上清を除去し、1ミリリットルの胚様体(EB)培地に再懸濁します。10マイクロリットルの細胞を取り、トリパンブルーで1〜2個に希釈します。血球計算盤で細胞を数え、細胞数に基づいて、細胞ストックを100マイクロリットルあたり10, 000細胞の最終希釈まで希釈します。プレーティングセルの場合は、ウェルあたり100マイクロリットルの希釈セルを低接着性の丸底96ウェルプレートに追加します。プレートを125倍gで3分間遠心分離し、摂氏37度と5%二酸化炭素で4日間インキュベートします。2日目に、マルチチャンネルピペットを使用して、古いハーフEB培地を新しい培地と交換します。プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)を生成するには、1ミリリットルの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。次に、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2時間、または一晩インキュベートします。EB分化の4日目に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、EBをマトリゲルコーティングされたウェルに移します。ピペットを上下に動かして、EBを井戸から取り除きます。次に、プレートを傾けたままにして、EBがウェルの端に落ち着くようにします。すべてのEBが落ち着いたら、3ミリリットルの新しく調製したPMP完全培地でEBをウェルの端に保ちながら、静かにピペットで古い培地を交換します。プレートを手動で左右に、そして前後にシャッフルして、ウェル内の細胞を均等に分配します。次に、プレートを7日間インキュベートして、EBがウェルの底に付着できるようにします。7日後、EBをライトフィールド顕微鏡で4倍の倍率で検査し、ウェルの底に付着していることを確認します。ハーフ培地交換を行い、21日目に完全培地を3ミリリットルのPMP完全培地と交換する。28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探します。次に、EBを乱すことなく、10ミリリットルのピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を収集します。培地中のPMPを15ミリリットルの円錐管に移します。採取したPMPを200倍gで4分間遠心分離し、上清を吸引してから、1〜2ミリリットルのミクログリア様細胞またはIMG基礎培地に再懸濁します。次に、前述のように血球計算盤で細胞を数えます。残りの細胞を遠心分離し、PMPを所望の濃度に希釈します。次いで、新たに調製したIMG完全培地を用いて細胞培養処理プレート上に1平方センチメートル当たり10〜5細胞の濃度で細胞を播種する。生細胞食作用アッセイでは、10〜4番目のPMPを20〜30倍の96ウェルプレートと100マイクロリットルのIMG完全培地にプレートし、分化プロセスを10日間追跡します。アッセイ当日、1ウェルあたり40マイクロリットルの培地を除去し、10マイクロリットルの核染色溶液を加える。プレートを2時間インキュベートします。標識されたシナプトソームを氷上で解凍し、1分間水超音波処理器を使用して穏やかに超音波処理します。繰り返しますが、すぐにシナプトソームを氷の上に置きます。標識シナプトソームをIMG完全培地で希釈し、培地50マイクロリットルあたりシナプトソーム1マイクロリットルで希釈する。陰性対照のために、アクチン重合、ひいては食作用を阻害するためにIMG完全培地中に60マイクロモルのサイトカラシンDを調製する。次に、この溶液を10マイクロモルの最終濃度で各ウェルに10マイクロリットル加え、30分間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出し、摂氏10度で10分間インキュベートします。プレートを氷上に保ち、シナプトソームを含む培地を50マイクロリットル加えます。プレートを摂氏10度で270倍gで3分間遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に維持します。プレートをライブセルイメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。次に、20倍の対物レンズを選択します。次に、明視野チャンネルと青色チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)、強度、積分時間、ゲインを調整します。シナプトソーム蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。ウェルごとにモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します。井戸の中央にある16枚のタイルを取得し、井戸の総面積の約5%を画像化します。温度を摂氏37度に設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。次に、分析ソフトウェアを開きます。次に、画像を含む実験を開き、[データ削減] アイコンをクリックします。メニューで、「画像処理」の下の「イメージングスティッチング」を選択し、モンタージュ内の 4 x 4 の個々のタイルから、テキスト原稿に記述されているパラメーターを使用して完全な画像を作成します。これらの画像の DAPI チャネルと RFP チャネルを使用して、強度のしきい値を定義します。画像を開き、[分析] をクリックします。[分析] で [セルラー分析] を選択し、[検出チャネル] で DAPI チャネルまたは RFP チャネルのいずれかでステッチされた画像を選択します。次に、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、DAPIチャネルの細胞核、またはRFPチャネルのシナプトソーム信号を適切に選択するしきい値とオブジェクトサイズの値を確立します。核の数をカウントするには、[データ削減]メニューに移動し、[画像分析]で[細胞分析]を選択します。もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でDAPIステッチ画像を選択し、テキスト原稿に記載されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[セル数] を選択します。次に、シナプトソームシグナルの領域を取得するには、[データ削減]メニューに移動し、[分析]で[細胞分析]を選択します。もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でRFPステッチ画像を選択し、テキスト原稿に詳述されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[オブジェクトの合計領域] を選択します。[データ削減]タブで、[OK]をクリックして、ソフトウェアが取得したすべての画像を分析できるようにします。画像が分析されたら、各時点の[オブジェクトの合計面積]と[セル数]の値をエクスポートします。次に、オブジェクトの合計面積をセル数で除算して、時間ポイントごとの正規化面積を計算します。複数の治療法または遺伝子型を比較する場合は、指定された式を使用して食作用指数を計算します。未分化iPS細胞は、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示します。解離したiPS細胞はEBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化4日目までサイズが大きくなりました。EBがPMP生成のためにメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます。28日目に、大きな細胞質対核比を有する丸い細胞が懸濁液中に現れる。iPS細胞は、ラミニン521コーティングプレートの方がPMP収率が高いため、マトリゲルではなくラミニン521コーティングプレートで培養することを強くお勧めします。PMPをIMG培地に曝露した後、細胞は細長い突起の存在下で小さな細胞質を有するミクログリア様形態を獲得する。また、ミクログリアの同一性は免疫蛍光染色により検証した。典型的には、細胞の95%以上がIB1を発現し、約90%の細胞がP2RY12およびTMEM119を発現する。ウェスタンブロット解析により、iPSCはヒトシナプトソーム発現シナプスマーカー、シナプトフィジンおよびシナプス後密度タンパク質95の下位運動ニューロンに由来することを確認しました。対照では、最初の時点と比較して、10時間までに、ほとんどのシナプトソームが飲み込まれ、酸性の細胞内コンパートメントに局在していたため、赤色蛍光シグナルは堅牢でした。サイトカラシンD処理IMGでは、赤色シグナルが0時間および10時間にわたって大幅に減少した場合、検出されたシグナルは貪食イベントに起因することが示されました。取り込まれたシナプトソームの面積は、16時間までの時間とともに増加しました。しかし、サイトカラシンD処理細胞からの赤色シグナルの面積は時間とともに増加しなかった。iPS由来のミクログリア様細胞は、貪食作用や炎症反応など、神経発達疾患や神経変性疾患の研究など、さまざまな用途に利用できます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、人工多能性幹細胞を用いた神経芽腫のミクログリア食作用アッセイを行っています。このアッセイは、神経変性疾患におけるミクログリア機能の障害を評価するのに役立ちます。...

ミクログリア食作用アッセイ:iPS細胞マクロファージを用いた神経芽腫細胞のミクログリア食作用モデルを確立するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、ヒト多能性細胞がミクログリア様細胞に分化する手順を示しています。このプロセスには、胚様体を形成し、それらをコーティングされたウェルに移し、特定の成長因子を使用して原始的なマクロファージ前駆体への分化を誘導し、最終的にミクログリア様細胞に分化することが含まれます。...

ヒト人工多能性幹細胞のミクログリア様細胞への分化

出典:Funes, S., et.al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-Cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. (ヒトミクログリア様細胞: 誘導多能性幹細胞からの分化およびヒトシナプトソームを使用した In Vitro 生細胞食作用アッセイ).J. Vis. Exp.

ヒトシナプトソームを用いたミクログリア様細胞の生細胞食作用アッセイ

小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。...

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

このプロトコルは、アストロ サイトの貪食能を測定するライブ イメージングの in vitro貪食アッセイを提示します。精製したラット アストロ サイトやミクログリアは、pH インジケーター共役シナプトソームと共に使用されます。このメソッドは、リアルタイムの貪食・分解速度を検出することができ、アストロ...

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。...

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。...

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

ここに提示されたプロトコールは、免疫適格マウスにおける鼻腔内経路を介して誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)の脳への移植を可能にする。iPSMGの維持のための細胞の調製および経鼻移植ならびにサイトカイン混合物の投与のための方法が示されている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植

この研究は、脳の炎症の間接的な評価を可能にするヒト単球由来ミクログリア様(iMG)細胞の確立のための新しいアプローチを示しています。これは、脳の潜在的な炎症と関連する神経精神障害に焦点を当てた研究に有益である可能性のある細胞モデルを示しています。...

ヒト血液誘導性ミクログリア様細胞の改変による脳の逆翻訳研究

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

学ぶiPS細胞由来ミクログリア様細胞の分化法とヒトシナプトソームを用いた貪食アッセイ。神経炎症や神経変性疾患の研究に有用な生細胞イメージング手法を習得できます。

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

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