Name: アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ接触過敏症のマウスモデルによるアレルギー性接触皮膚炎の研究法。ハプテン感作と耳浮腫測定でT細胞依存性免疫応答を評価し、新規治療法開発に貢献する。

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この研究は、subvention SUBZによって支持された。ヴロツワフの医科大学のA020.22.060, ポーランド, 科学高等教育省からの助成金によって N N401 545940 MSとIP2012 0443 72 MMSに.

<ol><li>Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+and+irritant+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Allergic and irritant contact dermatitis.</a> European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).</li>
<li>Hertl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominance+of+epidermal+CD8%2B+T+lymphocytes+in+bullous+cutaneous+reactions+caused+by+beta-lactam+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).</li>
<li>Martin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-mediated+immune+responses+to+chemical+haptens+and+metal+ions%3A+implications+for+allergic+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).</li>
<li>Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+sensitization+potency+of+isoeugenol+and+its+dimers+evaluated+by+a+non-radioisotopic+modification+of+the+local+lymph+node+assay+and+guinea+pig+maximization+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test.</a> Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).</li>
<li>Nakamura, K., Aizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+genetic+control+of+picryl+chloride+contact+hypersensitivity+reaction+in+inbred+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats.</a> Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).</li>
<li>Asherson, G. L., Ptak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+and+delayed+hypersensitivity+in+the+mouse.+I.+Active+sensitization+and+passive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer.</a> Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).</li>
<li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model%3A+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).</li>
<li>Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+langerhans+cell-deficient+mice+develop+enhanced+contact+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity.</a> Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerin+expressing+cells+promote+skin+immune+responses+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions.</a> Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th1+and+CD8%2B+type+1+cytotoxic+T+cells+both+play+a+crucial+role+in+the+full+development+of+contact+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity.</a> Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivities+to+hapten+are+controlled+by+IFN-gamma-upregulated+keratinocyte+Th1+chemokines+and+IFN-gamma-downregulated+langerhans+cell+Th2+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).</li>
<li>Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+and+irritant+contact+responses+to+DNFB+in+BN+and+LEW+rat+strains+with+different+TH1%2FTH2+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles.</a> Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).</li>
<li>Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+kinins+in+dinitrochlorobenzene+contact+dermatitis+of+guinea-pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Allergologica%22%5BJournal%5D)">Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs.</a> Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).</li>
<li>Maibach, H. I., Maguire, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+delayed+hypersensitivity+%28DNCB+contact+dermatitis%29+in+markedly+panleukopenic+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).</li>
<li>Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+animal+models+of+atopic+dermatitis+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+Journal+of+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).</li>
<li>Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effect+of+qingpeng+ointment+in+atopic+dermatitis-like+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).</li>
<li>Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleeding+the+laboratory+mouse%3A+Not+all+methods+are+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal.</a> Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).</li>
<li>Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90">https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90</a> (2011).</li>
<li>Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunization+with+TNP-Ig+and+Zymosan+induces+TCR%CE%B1%CE%B2%2B+CD4%2B+contrasuppressor+cells+that+reverse+skin-induced+suppression+via+IL-17A%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).</li>
<li>Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunization+with+DNP-BSA+induces+CD4%2B+CD25%2B+Treg+cells+that+inhibit+Tc1-mediated+CS%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS.</a> Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).</li>
<li>Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: 
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<li>Colvin, R. B., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+clotting+system+in+cell-mediated+hypersensitivity.+II.+Kinetics+of+fibrinogen%2Ffibrin+accumulation+and+vascular+permeability+changes+in+tuberculin+and+cutaneous+basophil+hypersensitivity+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions.</a> Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).</li>
<li>Szczepanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+contact+sensitivity+in+non-obese+diabetic+%28NOD%29+mice+by+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity.</a> Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).</li>
<li>Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+iNKT+cells+in+the+early+and+late+components+of+Tc1-mediated+DNFB+contact+sensitivity%3A+Cooperative+role+of+%CE%B3%CE%B4-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).</li>
<li>Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunization+with+protein+antigen+induces+antigen-non-specific+suppression+of+CD8+T+cell+mediated+contact+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reports%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity.</a> Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).</li>
<li>Van Loveren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+micrometers+and+calipers+to+measure+various+components+of+delayed-type+hypersensitivity+ear+swelling+reactions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice.</a> Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).</li>
<li>Tsuji, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell-dependent+T+cell+responses%3A+IgM+antibodies+are+required+to+elicit+contact+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).</li>
<li>Campos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+immunization+rapidly+activates+liver+invariant+Valpha14+NKT+cells+stimulating+B-1+B+cells+to+initiate+T+cell+recruitment+for+elicitation+of+contact+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).</li>
<li>Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+of+a+fat-enriched+diet+causes+the+loss+of+resistance+to+contact+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity.</a> Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).</li>
<li>Bour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((histocompatibility+complex+class+I-restricted+CD8%2B+T+cells+and+class+II-restricted+CD4%2B+T+cells%2C+respectively%2C+mediate+and+regulate+contact+sensitivity+to+dinitrofluorobenzene%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene.</a> European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).</li>
<li>Majewska-Szczepanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+aggravates+contact+hypersensitivity+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice.</a> Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).</li>
<li>Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+contact+hypersensitivity+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice.</a> Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).</li>
<li>Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+hypersensitivity+in+MHC+class+II-deficient+mice+depends+on+CD8+T+lymphocytes+primed+by+immunostimulating+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+immunization+indicates+that+CD8%2B+T+cells+are+the+dominant+effector+cells+in+trinitrophenyl-specific+contact+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Vennegaard, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+exposure+to+nickel+induces+nickel+allergy+in+mice+via+a+MyD88-dependent+and+interleukin-1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway.</a> Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

CHSは、皮膚中の自己タンパク質抗原に結合し、ネオ抗原を生成するハプテン を介して 誘導される。CHSは、循環抗原特異的CHSエフェクターT細胞の局所的な血管外動員によって媒介され、これは、チャレンジ組織において腫脹をもたらし、二次皮膚を同じハプテンに曝露してから24時間後にピークに達する6。組織の腫脹は、主に、白血球および白血球依存性フィブリン沈着24の浸潤によって引き起こされる。これらの変化は、ハプテン感作およびチャレンジドマウスと偽感作およびチャレンジドマウスの耳の腫れを測定するマイクロメーターで検出することができる。
CHSはまた、耳の重さの比較によって決定することができる。次いで、耳重量決定のために利用される耳パンチを、さらなる試験に使用することができる。炎症を起こした耳に浸潤する細胞は、サイトカイン産生Tリンパ球およびMPO陽性好中球からなる。耳組織ホモジネートにおいて、MPO活性または炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IFN−γ、IL−17A、ま...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64329">Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis</a>. The Protocol and Representative Results sections were updated.
Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
to:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
Figure 1 of the Representative Results has been updated from:
<img alt="Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64329/64329fig01.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64329/64329fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64329/64329fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64329/64329fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Figure 2 of the Representative Results has been updated from:
<img alt="CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64329/64329fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64329/64329fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64329/64329fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64329/64329fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64329">Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis</a>. The Protocol&#160;and Representative Results sections were updated.

Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、ハプテンと呼ばれる低分子量化学物質への曝露に起因するIV型過敏反応によって引き起こされる先進国における一般的な皮膚炎症性疾患である。ヒトにおける接触感作を引き起こす物質には、重金属イオン(クロム、ニッケル、鉄、コバルト)、テルペンチン、化粧品中に存在する香料、染料、および防腐剤(例えば、パラフェニレンジアミン)、いくつかの薬物(例えば、ネオマイシン、ベンゾカイン)、βラクタム系抗生物質(すなわち、ペニシリン)、植物によって産生される化学物質(ペンタデカカテコール、ポイズンツタに存在する物質)、ならびに写真産業で使用されるヒドロキノンが含まれる1,2.ACD病因薬は、産業だけで100,000以上の化学物質が使用され、毎年2,000の新しい化学物質が合成されているため、非常に高いです。現在までに、ハプテン/アレルゲンに接触している可能性のある3,700以上の分子が同定されています3。接触過敏反応(CHS)は、マウス、モルモット、ラットで研究することができ、有機溶媒に溶解した反応性化学ハプテンの局所皮膚適用によって誘発され得るACDの実験モデルである4,5,6。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を記述することを目的としている。
CHSは感作(誘導)相とエフェクター(チャレンジ)相からなる。動物モデルでは、ハプテンはまず体内のタンパク質に共有結合してネオ抗原を作り出します。感作期の間、活性化ケラチノサイトは、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン1β(IL-1β)7を産生することにより、皮膚樹状細胞(sDC)の遊走および成熟を促進する7。表皮ランゲルハンス細胞(LC)は、CHS誘導およびエフェクター相8の間に抗原を提示する。感作中にハプテンに曝露されたLCは、調節細胞およびエフェクター細胞の両方の誘導を促進する9。いくつかの研究からの証拠の増加は、CHS応答が、CD4+ MHCクラスII制限性Th1細胞、特徴的な炎症性浸潤物を採用するためにインターフェロンγ(IFN-γ)を局所的に放出すること、IFN-γも放出することができるが、ほとんどがケラチノサイトへの細胞傷害性損傷を媒介するCD8+ MHCクラスI制限性Tc1リンパ球、および現在インターロイキン17(IL-17)産生Th17細胞10によって媒介され得ることを示唆している。11.
様々な種1 2、13、14およびハプテンを用いたいくつかの異なるCHSモデルが開発されている(異なるハプテン、溶媒、および適用時間の詳細な比較は表1に要約されている)。頻繁に使用される実験種であるマウスは、CHSの研究においていくつかの利点を提供する。マウスには他の種に比べて系統、ノックアウト(KO)、トランスジェニック動物が多く、非常に魅力的な動物となっています15。さらに、CHSモデルには多くの動物が必要であり、マウスはここでより経済的です。動物モデルは、すべての面でACDを模倣するわけではない。特に、彼らは人間には一般的ではない痂皮と落屑を示しています16,17。慢性疾患の特徴は、主に記載されたモデルが長期間にわたってハプテンの適用を想定していないため、再現が困難である。しかし、ACDの重要な側面の多くが再現されていることがここで確認されています。また、ヒトと同様に、これらの特徴は局所アレルギー反応と関連していることも示されている。このプロトコルで概説されているハプテン、その溶媒、およびその用途の選択は、結果が多数のインビトロ試験によって確認されており、現在のバージョンが確立されるまで長年にわたって実験室で試験および修正されたという事実によって決定された。マウスモデルは、ACDの発症に関与し、新しい治療法の前臨床評価に不可欠な細胞サブセットまたはサイトカインの分析を可能にする。

<table><tbody><tr><td>70% エタノール</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>65350-M</td><td>表面消毒用</td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート、ポリプロピレン</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria</td><td>655101</td><td>for MPO and Evans blue measurement - プレートはポリプロピレン製で、結合能力が低いため、タンパク質やDNAが</td></tr><tr><td>アセトン(ACS試薬、&ge;99.5%)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>Z185140</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany</td><td>PRACTUM224-1s, 29105177</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India</td><td>MTP-E-212</td><td>パラフィン</td></tr><tr><td>BD Vacutainer SST II Advance(血清を得るためのゲル付きチューブ)</td>で組織サンプルを固定、脱水、透明化、浸潤することにより、組織サンプルを自動的に調製します<td>Becton Dickinson (BD)、Franklin Lakes、NJ、USA</td><td>BD</td><td></td></tr> 366882 <tr><td>タンパク質測定用ビシンコニン酸キット</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>ビオチンラット抗マウスIgG1</td><td>Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>553441</td><td></td></tr><tr><td>BSA (ウシ血清アルブミン)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>A9418</td><td>protein assays & analysis, 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Cell strainer, pore size 70 &mu;m</td><td>BIOLOGIX, 中国</td><td>15-1070</td><td>50 mLチューブに適しています</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR, Radnor, Pennsylvania, United States</td><td>631-1583</td><td>24 mm, しかし、異なるサイズを使用することが可能</td></tr><tr><td>使い捨てピペット容量: 5 mL, 10 mL, 25 mL</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>Z740301, Z740302, Z740303</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&prime;リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>ThermoFisher Scientific,&nbsp;ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>14190144</td><td>カルシウムなし、マグネシウムなし、哺乳類細胞培養</td></tr><tr><td>組織学のためのDPXマウンタント</td><td>メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>H-Eのための6522</td><td>マウンティングメディアは、他のいくつかの例えば、カナダのバルサム</td></tr><tr><td>デュモン5ピンセット - ストレート</td><td>Animalab、ポズナン、ポーランド</td><td>11251-10FST</td><td>マウスの手順のための手術器具(滅菌する必要があります)</td></tr><tr><td>デュモン7ピンセット - 曲がった</td><td>Animalab、ポズナン、ポーランド</td><td>11272-50FST</td><td>マウスの処置用手術器具 (滅菌する必要があります)</td></tr><tr><td>Eosin Y 溶液、アルコール性</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td><td>Eppenforf、ドイツ</td><td>3,01,20,086</td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes、2.0 mL</td><td>Eppenforf、ドイツ</td><td>3,01,20,094</td><td>ポリプロピレン、丸底(均質化ビーズは簡単に移動できます)</td></tr><tr><td>エタノール100%(絶対アルコール)</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1.07017</td><td></td></tr><tr><td>エタノール96%</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1.59010</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>ThermoFisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州、米国<td></td><td></td>A3160802</tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド 99.5% (GC)</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫 -20 &deg;C</td><td>ボッシュ、ドイツ</td><td>GSN54AW30</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫 +4 >C /冷凍庫-20°;C</td><td>Bosch, Germany</td><td>KGV36V10</td><td>mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL</td></tr><tr><td>Glass microskope slides, SuperFrost Plus</td><td>VWR, Radnor, Pennsylvania, United States</td><td>631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449</td><td>接着材料やタンパク質コーティングを施す必要をなくし、染色中の組織切片の損失を防ぐスライドです。</td></tr><tr><td>グラフパッド プリズム</td><td>グラフパッドソフトウェア株式会社</td><td>v. 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>灰色の石鹸</td><td>Pollena Ostrzesz&oacute;w、Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o.、Sp. K.、ポーランド</td><td>Bialyジェレンソープバー</td><td>グレーソープバーナチュラル低アレルギー性。一般入手可能な製品</td></tr><tr><td>H2SO4 (硫酸) 1 mol/l (1 M)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.60313</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin solution</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR, Avantor, U.S.A</td><td>612-5719</td><td>手動計数室をお勧めします</td></tr><tr><td>。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム</td><td>Merck KGaA, Darmstadt,</td><td>Germany H5882</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>QIAGEN Hilden, Germany</td><td>Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234</td><td>ホモジナイザー ステンレス鋼ビーズ (直径 5 mm) 2 mL 遠心分離管用</td></tr><tr><td>西洋わさびペルオキシダーゼ ストレプトアビジン (HRP ストレプトアビジン)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA</td><td>SA-5004-1</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液 (H202)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Heracell 150i</td><td>Thermo Electron LED Gmbh, Germany</td><td>41071068</td><td>37 oC 5% CO2, 65 0</sup/sup>C 組織学用切片</td></tr> ケ<tr><td>タミン 100 mg/mL, 注射用溶液</td><td>Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland</td><td>cat.# 利用不可</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (リン酸二水素カリウム) 99.995% 無水ベース</td><td>Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>1.05108</td><td></td></tr><tr><td>実験室用遠心分離機</td><td>Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, ドイツ</td><td>B00013899</td><td>速度 300 x g, 冷却 4 0C</td></tr><tr><td>実験室用遠心分離機</td><td>ヘレウスフレスコ21、サーモサイエンティフィック、ドイツ</td><td>75002425</td>速度<td>3,000 x gまで、4 0C</td></tr><tr><td>マスク(FFP2)</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルベニア州、米国</td><td>111-0917</td>オル<td>トジアニシン二塩酸塩マウスと協力するための生物</td></tr><tr><td></td><td>医学科学部、健康科学部、ヤギェウォ大学医科大学の育種ユニット、 クラクフ、ポーランド</td><td>CBA/J、C57BL/6</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメータ</td><td>三ツ豊市、東京、日本</td><td>193-111</td><td>桁 外マイクロメータ、ラチェットストップ、0-25mm 範囲、0.001mm 目盛り、+/-0.002mm 精度、https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロプレート、96ウェル、マイクロロン、高結合(ELISA試験用)</td><td>Greiner Bio-One GmbH、クレムスミュンスター、オーストリア</td><td>655061</td><td>、maxi-sorp結合面により、比色アッセイで信頼性と再現性のある結果が得られます</td></tr><tr><td>顕微鏡と対物レンズ</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH, Germany</td><td>DM1000, 294011-082007</td><td>この論文で発表された組織型は、ThermoFisher Scientific EVOS M5000 イメージングシステムの下で実施され、目的:FL 20X LWDPH、0.40NA/3.1WD および FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD</td></tr><tr><td>ヒト白血球由来のミエロペルオキシダーゼ(MPO 標準)</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>M6908</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 7 H2O (リン酸ナトリウム二塩基性七水和物)</td><td>Merck KGaA、 ダルムシュタット、ドイツ</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>オリーブ油</td><td>メルク KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>75343</td><td>純粋で自然な</td></tr><tr><td>OptEIA マウス IFN-&gamma;ELISA Set</td><td>Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555138</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-dianisine dihydrochloride</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>D3252</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>76242</td><td>beads, waxy solid</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>ThermoFisher Scientific,&nbsp;米国マサチューセッツ州ウォルサム</td><td>20012027</td><td>pH 7.2、哺乳類細胞培養</td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>Elmetron、ポーランド</td><td>CP-401</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、チップ付き可変容量</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>EP3123000900-1EA</td><td>3パック、オプション 1、0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL、epT.I.P.S.</td></tr> を含む<tr><td>かみそりの刃</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルベニア州、アメリカ合衆国</td><td>PERS94-0462</td><td>スクレーパーとカッターの刃、片刃、アルミ背骨、100枚/箱、個包装</td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム</td><td>MRC Laboratory-Instruments、エセックス、CM20 2HU UK</td><td>HIS-202A</td><td></td></tr><tr><td>はさみ - ストレート、シャープ/シャープ</td><td>Animalab、ポズナン、ポーランド</td><td>14060-10FST</td><td>マウスの処置用手術器具(滅菌する必要があります)</td></tr><tr><td>スクリューキャップ(オープントップ)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>27056</td><td>黒色ポリプロピレン製穴キャップ, 22&nbsp;20-400糸の分光</td></tr><tr><td>光度計</td><td>BioTek Instruments、米国</td><td>201446</td><td>ユニバーサルマイクロプレート分光光度計:ラムダ;範囲:200 - 999 nm、吸光度測定範囲:0.000 - 4.000 ABS</td></tr><tr><td>皿を染色 ラック付きスライド20</td>枚 <td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>S6141</td><td>例:カバー、スライドラック、ハンドル付き20枚のスライド染色皿</td></tr><tr><td>滅菌使い捨て生検パンチ 6mm</td><td>Integra LifeSciences、プリンストン、ニュージャージー州、米国</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Animalab、ポズナン、ポーランド</td><td>52138-46</td><td>マウスの処置用手術器具 (滅菌する必要があります)</td></tr><tr><td>組織処理カセット</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>Z672122</td><td>組織処理/蓋付きカセット</td></tr><tr><td>埋め込み TMB Substrate Reagent Set</td><td>ベクトン・ディキンソン (BD Biosciences)、ニュージャージー州フランクリンレイクス、米国</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>TNCB (2,4,6-トリニトロクロロベンゼン)</td><td>東京化学工業株式会社</td><td>C0307</td><td></td></tr><tr><td>TNP-BSA (ウシ血清アルブミンと2,4,6-トリニトロフェニルを結合)</td><td>Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA</td><td>T-5050</td><td></td></tr><tr><td>T-PER (tissue protein extration reagent)</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>78510</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 15 mL sterile</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>CLS430055 (Corning)</td><td>polypropylene, 円錐底</td></tr><tr><td>Tubes 50 mL, 滅菌済み</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>CLS430290 (Corning)</td><td>polypropylene, 円錐底</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>27173</td><td>ハプテンの調製のために、それが蒸発しないようにねじ込まれる</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>AJL Electronic, Poland</td><td>LW102</td><td></td></tr><tr><td>Wax (paraffin) dispenser</td><td>VWR, Radnor, Pennsylvania, United States</td><td>114-8737</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection</td><td>Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland</td><td>cat.# 利用できない</td><td></td></tr><tr><td>キシレン (組織学的グレード)</td><td>Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症

Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

接触過敏症(CHS)は、マウスで研究することができるアレルギー性接触皮膚炎(ACD)の実験モデルである。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を提示することを目的としている。CHSを誘導するために、「0」日目に、マウスをアセトン - エタノール混合物中のハプテン2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)による腹部皮膚塗装によって予め剃毛したスポット上で感作し、一方、陰性対照マウスは、ビヒクル単独 - アセトン - エタノール混合物で偽感作した。「4」日目に、試験群および対照群の両方で希釈TNCBで両耳を塗ることによってCHSの惹起(チャレンジ)の前にベースライン耳厚をマイクロメーターで測定した。24時間後、耳の腫れをマイクロメーターで測定した。CHSは、炎症を起こした組織に腫脹を引き起こすT細胞媒介性免疫応答の一例であり、同じハプテンによる皮膚チャレンジの24時間後にピークに達する。耳水腫の増加は、耳の体重の増加、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性、耳抽出物中の前炎症性サイトカイン濃度、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加、および耳の血管透過性と相関した。対照マウスと比較した場合、試験群の血清中のTNP特異的IgG1抗体の濃度も増加した。さらに、CHSは、以前にTNCBで感作されたドナーから得られたCHSエフェクター細胞を用いて首尾よく転写することができる。CHSエフェクター細胞をナイーブレシピエントマウスに静脈内投与し、その後、同じ希釈ハプテンでチャレンジした。耳の腫れは、24時間後にマイクロメーターで測定した。

CHS誘導のために、動物を、150μLの5%TNCBまたは偽物を用いて、ビヒクル単独で感作した皮膚塗装(腹部) を介して 感作した。「4」日目に、TNCBで以前に接触感作したマウス(試験群)および対照群マウス(偽感作)の両マウスにおいて、0.4%TNCBの10 μLによる接触塗装(チャレンジ)により両耳の耳膨潤応答を誘導した。提示されたデータは、TNCBで感作し、4日後にチャレンジしたマウスが、同様にチャレンジされた偽感作マウスと比較して有意に増加した耳の腫れを発症したことを示している(図3、 表2、試験対対照群)。耳の腫れの結果は、さらなる研究において完全に検証され、マイクロメーターで決定された耳水腫の増加が、増加した耳の重量(図4)、MPO活性(図5)、耳抽出物中のIFN-γ濃度(図6)、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加(<strong...

接触過敏症(CHS)は、アレルギー性接触皮膚炎(ACD)のマウス実験モデルである。CHSは、胸部および腹部の剃毛された皮膚を塗ることによって反応性ハプテンによる感作に基づいており、その後の耳の皮膚の課題を希釈ハプテンで、様々な方法で評価される腫脹反応を引き起こす。

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an ...

ここで紹介する客観的な実験室の方法は、ヒトのアレルギー性接触皮膚炎を模倣するマウスの接触過敏反応を研究するのに役立つ可能性があります。接触過敏反応は、耳浮腫だけでなく、この反応に関与する細胞メカニズムの研究を可能にする様々な実験室試験によっても測定することができる。より接触性のある過敏症モデルは、さまざまな環境要因と新しい物質をテストして、テストされた要因がT細胞依存性免疫応答を調節するかどうかを示すことができ、新しい治療法の実施に使用できます。かみそりの刃でマウスの皮膚を剃り、足にラベルを付けることから始めます。接触過敏症(CHS)の誘発の6時間前に、灰色の石鹸を水で塗り、マウスの胸部と腹部の2センチメートル四方の領域を剃ります。同じ日に、以前に剃った場所に150マイクロリットルの新しく調製した5%ハプテンを適用してマウスを感作します。コントロールマウスでは、車両のみを適用します。動物をケージに戻す前に、ハプテンスポットを30秒間乾燥させます。4日目に、実験群を知らない観察者がゼロ時間でマイクロメーターを使用して麻酔をかけたマウスの耳の厚さを測定します。次に、テストグループとコントロールグループの耳の両側に10マイクロリットルの作りたての04%ハプテンを塗布し、30秒間乾燥させます。前回の0.4%ハプテン塗布から24時間後の5日目に、24時間測定のために耳の厚さの測定を繰り返します。耳の厚さ測定の24時間後、マウスがまだ深い麻酔下にあるときに、ハサミを使用して頭蓋骨のできるだけ近い耳を切り落とします。耳の遠位側で、生検パンチを使用して直径6ミリメートルのパンチを作ります。分析天びん上で各耳生検の重量を測定し、ミリグラムで表します。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイでは、耳生検をステンレス鋼ビーズを備えた2ミリリットルの微量遠心チューブに入れ、500マイクロリットルの調製バッファーを追加します。生検をホモジナイザーで10分間ホモジナイズし、次にサンプルを摂氏4度で15分間冷却してから、再び10分間ホモジナイズします。生検が均質化されたらビーズを取り出します。ホモジネートを摂氏マイナス20度で30分間凍結します。サンプルを解凍してボルテックスし、均質化と凍結の手順を3回繰り返します。完了したら、ホモジネートを3, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清をピペットで回収してMPO活性を測定し、タンパク質1ミリグラムあたりの単位で表します。血管透過性試験を行うには、0日目にマウスを感作し、4日目に、前述の手順を使用して耳にハプテンを適用して直接挑戦します。23時間後、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に1%エバンスブルー染料をグラム体重あたり8.3マイクロリットルを麻酔したマウスに静脈内注射します。1時間後、マウスに再度麻酔をかけ、前述のように耳生検を採取する。組織から色素を抽出するには、1ミリリットルのホルムアミドを含むチューブ内で生検を摂氏37度、5%二酸化炭素の雰囲気中で18時間インキュベートします。耳の生検を収集した後、マウスがまだ深い麻酔下にあるときに、ピンセットで眼球を取り除きます。マウスに穏やかな圧力をかけ、後眼窩洞から血清採取のためにチューブに血液を採取します。チューブを6回反転させ、血液が凝固するまで30分待ちます。次に、チューブを1, 300〜2, 000 Gで室温で10分間遠心分離します。前述の手順を使用して、0日目にTNCBハプテンでドナーマウスを感作します 4日目に、皮膚を消毒した後、鉗子を使用して麻酔をかけたマウスから腋窩リンパ節と鼠径リンパ節(ALN)を分離し、続いて脾臓を分離します。2つの顕微鏡スライドのつや消しの端の間で組織をマッシュし、細胞懸濁液を孔径70マイクロメートルのセルストレーナーに通します。次に、1%ウシ胎児血清を添加したDPBSで細胞を洗浄し、摂氏4度で10分間300Gで遠心分離します。上清をデカントし、残りの細胞ペレットを1〜5ミリリットルのDPBSに再懸濁します。ALNと脾臓の1:1の混合物を調製して、200マイクロリットルのDBPSで10〜7番目の細胞の7.0倍までの濃度を達成してから、麻酔をかけたマウスにCHSエフェクター細胞の混合物を静脈内注射します。ゼロ時間とチャレンジの24時間後に耳の厚さを測定します。データは、TNCBに感作し、4日後に耳に挑戦したマウスは、偽感作され、同様に挑戦された対照マウスと比較して、耳の腫れが有意に増加したことを示しました。試験群における耳浮腫の増加は、耳重量、MPO活性、耳抽出物中のインターフェロンガンマ濃度、組織学的検査における真皮浮腫の変化、および耳血管透過性の増加をもたらし、対照動物と比較した場合、試験マウスの血清においてTNP特異的IgG1抗体が上昇した。以前にTNCBで感作したドナーからCHSエフェクター細胞を投与された動物は、細胞を受け取らなかった動物と比較して、有意に増加した耳の腫れを示しました。最も重要な瞬間は、接触過敏症を引き起こすことです。ハプテン溶液は非常に揮発性で光に敏感であるため、動物の皮膚にすばやく塗布する必要があります。単離されたエフェクター細胞に対して追加の試験を実施することができる。例えば、細胞培養物は、抗原の存在下で増殖する能力を評価するために確立され得る。

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