Name: アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:50:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学ぶアテローム硬化性プラークのコラーゲン構造と機械的性質の相関解析法。多光子顕微鏡と一軸引張試験を統合し、組織破壊予測に寄与する機能的関連を解明します。

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この作業は、NWO-Vidi助成金(18360)によって資金提供されました。

著者は開示する利益相反を持っていません。

現在の研究は、線維性アテローム硬化性プラーク組織の局所的なコラーゲン配向と分散、局所的な機械的特性、および破裂挙動の間の相関を研究するためのメカノイメージングパイプラインの開発に焦点を当てました。本明細書に記載されるプロトコルは、いくつかの理由で革新的である。まず、機械的負荷下での線維性プラーク組織の局所変形を測定するためにデジタル画像相関が適用されたのはこれが初めてです。第二に、このプロトコルは、局所変形パターンと線維性プラーク組織の局所コラーゲン構造との関連を分析するために必要な情報を提供する。局所評価の重要性は、組織の不均一な性質を示す結果セクションに提示された菌株データとコラーゲンデータの両方によって強調されています。したがって、このプロトコルで利用されているような局所評価を可能にする技術の使用は、線維性プラーク特性の将来の研究に推奨されます。
テストサンプルの準備は、このプロトコルの重要なステップの1つです。頸動脈プラークは主にコラーゲン組織です。しかしながら、それらは、全体的なプラーク機械的挙動に影響を及ぼすと考えられる石灰化を含み得る36、37。この研究はプラークの線維組織成分に焦点を当てているため、μCTイメージングを使用することにより、テストサンプルの石灰化が回避されます38。μCTが利用できない場合は、MRIやOCT39 などの他のイメージング技術を使用して、プラークの石灰化領域を検出できます。石灰化がなく、機械的試験に機能する十分な大きさの線維組織試験サンプルを入手することは、重度に石灰化している、または分散した石灰化を含むプラークにとって困難な作業になる可能性があります。プロトコルのもう一つの課題は、デジタル画像相関のための最適なスペックルパターンを生成することです。最適なDICには、50:5028 の白黒比が必要であり、適切な品質を確保するために3〜5ピクセルのサイズ29 の斑点があります。これらの要件を満たさないと、局所ひずみ測定が不正確になる可能性があります。最後に、組織の自然なランドマークが明確でない場合、破裂位置をSHG画像にマッピングすることは困難な場合があります。このようなサンプルでは、イメージング前に組織にいくつかの基準マーカーを適用すると役立ちます。
現在のプロトコルで使用されているMPM-SHG技術は、比較的大きな浸透深さを有する高解像度で非破壊的な技術であるため、他の多くのコラーゲンイメージング技術よりも優れています。しかし、MPM-SHGの浸透深さ(<400μm)は、0.5〜2mmの範囲の試験サンプルの厚さ全体をイメージングできないため、制限があります。拡散テンソル磁気共鳴画像法(DT-MRI)を用いた最近の研究では、プラーク組織のより深い部分における優勢な線維配向が、組織のより表在性の管腔部分におけるものとは異なる可能性があることを実証した14。したがって、厚い繊維状プラーク組織サンプルのより深い部分における局所コラーゲン構造と局所組織力学との関係を調査するために、さらなる研究が必要である。この目的のために、偏光空間周波数領域イメージング(pSFDI)を利用することができる。この最近開発された光学イメージング技術は、僧帽弁尖12の0.8mmの深さの繊維配向を測定する可能性があることが報告されています。また、pSFDIは高速アクイジションを提供し、現在のプロトコルのようにタイルの選択だけでなく、サンプル領域全体の視覚化を容易にすることもできます。現在のプロトコルのもう一つの制限は、表面変形のみを識別できることです。将来の研究では、ミラーアシストマルチビューDIC40 またはデジタル体積相関(DVC)41 をこのプロトコルに含めて、体積、地下ひずみに関する追加情報を得ることができます。
現在の実験プロトコルは、プラーク破裂のメカニズムおよびその基礎となる微細構造との関係に関する追加情報を得るために、いくつかの方法でさらに拡張または変更することができる。まず、現在のプロトコルには、円周方向の一軸引張試験が含まれています。このタイプの機械的試験は、プラークが主に in vivoで円周方向に引張り伸張を受けるために選択されました。より包括的な機械的特性評価のために、このプロトコルをさらに拡張して、インフレーション試験、二軸試験、または長手方向の一軸引張試験を組み込むことができます。第二に、現在のプロトコルは、DICを通じて局所株を取得することのみに焦点を当てています。ただし、プラークの機械的挙動のより完全なビューは、プロトコルに局所応力解析も含めることによって取得できますが、これには局所剛性の特性評価が必要です。現在挑戦的であるが、これは逆有限要素法42、43 および仮想場法44などの計算技術によって達成することができる。実験的な適応とは別に、いくつかの追加の後処理ステップを現在のプロトコルに追加することもできます。まず、破断箇所を特定するだけでなく、得られた高速カメラ画像 から 亀裂伝播経路を特定することができます。この伝搬経路は、局所的な構造的および機械的パラメータと相関させることができます。第2に、破断開始位置を、記載されたプロトコルにおいて視覚的に同定した。非生物学的組織に関する以前の研究では、DICひずみ測定の不連続性を使用して破裂を検出しました45。このような自動破裂検出をプラーク組織に適用することで、破裂検出の精度が向上する可能性があります。最後に、他のコラーゲンイメージング技術と比較したMPM-SHGの大きな利点は、個々のコラーゲン線維を視覚化できることです。したがって、このプロトコル を介して 得られたデータは、コラーゲン含有量などの追加の局所コラーゲン特性を調査するためにも使用できます。
このプロトコルは、in vivoでプラーク破裂で機械的に失敗する成分である線維性プラーク組織の局所的特徴をよりよく理解するために使用できます。この情報は、患者のプラーク破裂を予測する新しい構造的および機能的イメージングマーカーを確立するために必要です。以前に示唆されたリスクバイオマーカーは、将来の臨床事象に対して最適ではない予測値を有することが示されているので、これらの新しいマーカーが必要である5,6。将来、OCTおよびps−OCTは、動脈系における線維組織を同定し定量することができる可能性がある46、47、48。また、菌株は局所プラーク組成物49の代理マーカーとみなした。したがって、インビボひずみ測定49は、患者におけるプラーク安定性の同定に役立つ可能性がある。ただし、得られた結果をin vivoプラーク破裂に直接変換する場合は注意が必要です。第一に、線維性プラーク組織は、このプロトコルで使用される一方向の引張荷重よりもin vivoでより複雑な負荷を経験します。第二に、アテローム硬化性プラークは多成分構造です。線維性プラーク組織におけるin vivoストレスおよびひずみ分布は、石灰化37などの他のプラーク成分の存在および位置によって影響を受ける可能性がある。
このメカノイメージングパイプラインは、他のコラーゲン組織の研究にも利用できます。コラーゲンのグローバルな機械的試験と構造イメージングは、すでに生体組織に広く使用されています。ただし、不均一な繊維組織の正確な機械的特性評価には、コラーゲン構造だけでなく、破損前および破損特性の局所評価が重要です。この新しいプロトコルの構造は、いくつかの生物学的組織の微細構造と力学の間の相互作用へのさらなる洞察を提供すると期待しています。

虚血性脳卒中は、頸動脈のアテローム硬化性プラーク破裂によって引き起こされることが多く、世界中の死亡率と罹患率の主要な原因の1つです1。ただし、頸動脈アテローム性動脈硬化症関連の脳卒中を予防するための現在の外科的治療計画戦略には、プラーク破裂リスク評価は含まれていません2。これは主に、プラークキャップの厚さ3や脂質コアのサイズ4など、以前に示唆されたリスクバイオマーカーが、将来の臨床イベントに対して最適ではない予測値を有することが示されているためです5,6。プラークの破裂リスク評価を最適化し、アテローム硬化性プラークの新しいリスクマーカーを特定するには、プラークのメカニズムと破裂メカニズムをよりよく理解する必要があります。
プラーク破裂は、高線維性プラーク組織が血圧によって及ぼされる機械的負荷に耐えられず、その構造的完全性を失う局所的な機械的事象です7。それにもかかわらず、プラーク破裂イベントのメカニズムとその下にある微細構造との関連はよく理解されていません8。プラーク組織破壊の特徴を特徴付けるいくつかの実験的研究9,10,11,12,13は、組織の構造的均一性を仮定して導き出された、総機械的破断特性(すなわち、極限引張破壊ひずみおよび強度)を報告した。しかしながら、線維性プラーク組織は構造的に不均一であり、おそらく主にコラーゲン線維構造14の局所的な変動に起因する。さらに、プラーク組織の機械的障害特性とコラーゲン構造との関連は、Johnstonらによる最近の研究でのみ調査されました。著者らは、優勢な繊維配向にインタープラークの違いを示し、主に円周方向の繊維配向を有する線維性プラークキャップサンプルについて、より高い極限応力とより低い極限ひずみを報告した15。しかし、この研究はまた、総機械的および構造的特性に限定されていました。
本研究では、線維性プラーク組織の局所的なコラーゲン構造と局所的な機械的特性に関する重要な情報を明らかにするために、メカノイメージングパイプラインを開発しました。この ex vivo パイプラインにより、局所コラーゲン繊維の方向と分散液、および局所破裂株の定量が可能になります。パイプラインには、プラーク組織のコラーゲン線維を画像化するためのSHGによるMPMイメージングと、組織の破裂特性を定量化するためのDICおよび一軸引張試験が含まれます。
多光子顕微鏡-秒高調波発生(MPM-SHG)は、生体組織中のコラーゲンを研究するための一般的な技術となっています16。この手法には、組織学17、拡散テンソルイメージング(DTI)14、小角光散乱(SALS)15などの他のコラーゲンイメージング技術と比較して多くの利点があります。まず、MPM-SHGイメージングは非破壊的であるため、機械的試験と組み合わせるのに理想的です18。第二に、SHGシグナルはコラーゲンに特異的であるため、組織の染色は必要ありません。励起波長が長い(近赤外)ため、侵入深さは他の顕微鏡技術よりも大きくなります16。SHGイメージングで達成される高解像度(μmレベル)により、個々のファイバーの視覚化も可能です。これは、コラーゲン線維の数の局所定量化、コラーゲン線維の配向、分布など、多くの可能性を提供します19。
機械的試験と組み合わせたデジタル画像相関(DIC)は、生体組織20の局所的な機械的特性を得るために広く使用されている方法である。DICでは、機械的試験中に取得した高速カメラ画像を比較することにより、組織表面に塗布されたスペックルの変位を追跡します20。この画像後処理方法は、標本20 の全磁場表面ひずみを推定するために使用され、組織21の破断挙動を研究するためにも使用できます。

<table><tbody><tr><td>10mm延長リング</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>CML10</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>20x APO 水浸対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>507701</td><td></td></tr><tr><td>3D スライサー ソフトウェア</td><td>N/A</td><td>バージョン 4.11</td><td></td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>エアブラシ ピストル AB 430- ノズル径 0.3 mm</td><td>コンラッド</td><td>4.01614E+12</td><td></td></tr><tr><td>ブラックアウト、ナイロン生地ポリウレタンコーティング</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラックティッシュ染料</td><td>Polysciences inc</td><td>24113-2</td><td></td></tr><tr><td>カメラレンズ、焦点距離 50 mm</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td></td>MVL50M1</tr><tr><td>カメラスタンド</td><td>VWR</td><td>241-0093, 241-7311</td><td></td></tr><tr><td>カメレオン ウルトラ多光子レーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンプレッサー+エアホース</td><td>JUN-AIR, Conrad</td><td>B07GB9HC62, 4016138577198</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Version 2208</td><td></td></tr><tr><td>フォームテープ 両面, 1.9×150cm</td><td>パテックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングバス</td><td>N/A</td><td></td><td>オーダーメイド</td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ+イメージングソフト</td><td>Pixelink-Navitar Inc.</td><td>PL-D725</td><td></td></tr><tr><td>ヒト頸動脈アテローム性動脈硬化性プラーク(頸動脈内膜切除術から)</td><td>該当なし</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像J</td><td>国立衛生研究所</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>LAS-AF</td><td>ライカ</td><td>バージョン2.3</td><td>イメージングソフトウェア 多光子顕微鏡</td></tr><tr><td>ライカ TCS SP5 II</td><td>SHGイメージングに用いる</td><td>ライカ</td><td></td>顕微鏡</tr><tr><td>照明システム</td><td>AMZ機器</td><td>LED-60TB</td><td>高速カメラで鮮明な画像を取得するために使用されます</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>バージョンR2021A</td><td></td></tr><tr><td>MATLABベースのFibLabソフトウェア</td><td>アイントホーフェン工科大学</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>MATLABベースのFOA(繊維配向解析)ツール</td><td>アイントホーフェン工科大学</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>MATLABベースのNcorrソフトウェア</td><td>ジョージアInstitute of Technology</td><td>Version 1.2</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>エメラルド</td><td>BDAM302986</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ (直径 10cm)</td><td>VWR</td><td>BRND452000</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>ELKA127-P511-000</td><td></td></tr><tr><td>Quantum GX2 マイクロコンピュータ断層撮影 (&mu;CT)スキャナー+ Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS149276</td><td></td></tr><tr><td>定規</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1800030</td><td></td></tr><tr><td>サンドペーパー(P180)</td><td>コンラッド</td><td>4.00932E + 12</td><td></td></tr><tr><td>サイドカッター</td><td>コンラッド</td><td>4.25084E + 12</td><td></td></tr><tr><td>シリコンエラストマーベースと硬化剤(シルガード184)</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td></td></tr><tr><td>引張試験機+ソフトウェア+クランプ</td><td>N/A</td><td></td><td>円筒形リニアアクチュエーター(EACM2E10AZAK、オリエンタルモーター社製)、10Nロードセル(LCMFD-10N、オメガエンジニアリング社製)を使用して自社製</td></tr><tr><td>トルクドライバー</td><td>ギャラント、ホフマングループ</td><td>659906</td><td></td></tr></tbody></table>

アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue

冠状動脈および頸動脈におけるアテローム硬化性プラークの破裂は、致命的な心血管イベントの主な原因である。しかし、不均一な高コラーゲンプラーク組織の破裂メカニズム、およびこれが組織の線維構造とどのように関連しているかはまだわかっていません。プラーク力学を研究するための既存のパイプラインは、組織の構造的均質性の仮定に基づいて、プラーク組織の肉眼的機械的特性のみを得ることに限定されている。しかしながら、線維性プラーク組織は構造的に不均一であり、おそらく主にコラーゲン線維構造の局所的な変動によるものである。
ここで説明するメカノイメージングパイプラインは、不均一な構造的および機械的プラーク特性を研究するために開発されました。このパイプラインでは、組織の局所コラーゲン構造は、第2高調波発生(SHG)を備えた多光子顕微鏡(MPM)を使用して特徴付けられ、組織の破壊挙動は、デジタル画像相関(DIC)分析を使用して一軸引張試験条件下で特徴付けられます。この実験パイプラインにより、コラーゲン線維配向の局所的な優勢な角度と分散、破裂挙動、および線維性プラーク組織のひずみフィンガープリントの相関が可能になります。得られた知識は、アテローム硬化性プラーク破裂イベントをよりよく理解、予測、および防止するための鍵となります。

組織採取と検査サンプル調製 組織収集により、プラーク線維組織標本が得られ、構造イメージングおよび一軸引張試験のために個々の試験サンプルに解剖することができます。理想的には、収集された線維組織サンプルには、裂傷がほとんどまたはまったくない領域(図5A)およびマクロ石灰化(図5B)が含まれています。これらの裂け目および石灰化が過剰になると(図5C)、前述のWL 1のサンプル寸法要件を満たさないプラークサンプルにつながる可能性があります。
多光子顕微鏡イメージング SHGイメージングと画像後処理は、画像化された各タイルからのMIPを提供します(図6A、B)。繊維検出によるさらなる後処理(図6C)により、繊維配向ヒストグラム(図6D)が得られ、そこからコラーゲン構造パラメータを抽出できます(図6E)。さらに、プラークサンプル全体にわたる局所構造コラーゲンパラメータを示すカラーマップを視覚的分析のために得ることができる(図6F、G)。図6の代表的な試験サンプルでは、構造コラーゲンパラメータに大きなサンプル内変動が見られます(平均± SD μ p = -34°± 32°; σp = 21°± 4°;Pani = 0.49 ± 0.14、円周方向が0°と定義されている場合)。このサンプル内変動は、均質性を仮定するのではなく、局所的な構造パラメータを取得することの重要性を強調しています。
機械的試験 破裂挙動 高速カメラは、機械的試験中のプラークサンプルの変形と破裂挙動の画像を提供します(図7)。これらの画像から、破断開始位置と破断伝播経路を特定することができます。破裂の識別結果は、カメラ画像に気泡または反射が存在する場合、または破裂の伝播が速すぎて選択したフレームレートでキャプチャできない場合に最適ではありません。
局所ひずみパターン 一軸引張試験中に取得したカメラ記録のデジタル画像相関分析により、 図8に示すGreen-Lagrangeひずみマップなどの局所組織変形マップが得られます。これらのマップには、破断開始前のフレームにおける3つのひずみ成分(εxx、εxy、およびεyy)が表示されます。これらのひずみマップから、関心領域内の平均ひずみと、破断場所などのスポットにおける局所ひずみを抽出することができます。
図8の代表的なサンプルについては、局所ひずみデータは大きなサンプル内変動を示しています。図8の代表的な試験サンプルでは、局所株に大きなサンプル内変動が見られます(観察された菌株の範囲は次のとおりです:εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40)。これは、組織の均質性を仮定して得られた総平均値ではなく、ローカルデータを取得することの重要性を強調しています。
機械的および構造的組織情報の相関 上記の結果は、組織の局所的な変形および破裂挙動をコラーゲン構造に関連付けることを可能にする。カメラ記録で破裂位置が特定されると(図9A)、参照カメラ画像(図9B)および顕微鏡タイルスキャン(図9C)にマッピングすることができます。これにより、破裂が発生したMPM-SHGタイルと、このタイルで見つかった構造パラメータが提供されます(図9D)。図9に示す代表的なサンプルで破裂が発生したタイルに見られる構造パラメータは、μ p = 28°、σp = 19°、およびPani = 0.6です。同じ手順を、破裂していない組織位置にも適用できます。ラプチャーフレームからの参照画像上のラプチャー位置のマッピングは、スペックルパターンが悪く、自然のランドマークが不明瞭な場合、困難な場合があることに注意することが重要です。さらに、組織の自然のランドマークが十分に明確でない場合、タイルスキャンオーバーレイと高速カメラ画像の同時登録が困難になる可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig01.jpg"> 図1:提示した実験プロトコルのワークフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig02.jpg"> 図2:タイルスキャンからのSHGイメージング用のタイルの選択 。 (A)シリコンにピン留めされたテストサンプル。(B)明視野顕微鏡で得られた被検試料のタイルスキャン。SHG イメージング用に選択されたタイルは、青い四角形でマークされます。(C)SHGを使用したMPMの最大強度投影。スケールバー= 140μm(C)。略語:SHG =第2高調波発生。MPM = 多光子顕微鏡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig03.jpg"> 図3:多光子顕微鏡の対物レンズの下に置かれたプラークサンプル。 プラークサンプルの位置は、リン酸緩衝生理食塩水で満たされたペトリ皿によって確保されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig04.jpg"> 図4:さまざまなコンポーネントが示されているカスタム設計の一軸引張試験機 。 (A)システムの全体像。クランプのサンドペーパーインサートは、下部クランプのみが取り付けられているため、表示されることに注意してください。(B)試験片を試験の準備ができている引張試験機のクランプの拡大画像。略語:PVC =ポリ塩化ビニル;LED = 発光ダイオード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig05.jpg"> 図5:代表的なサンプルからの組織採取とサンプル調製の結果 。 (A)頸動脈内膜剥離手術を受けた同意患者から回収された新鮮で無傷のプラークサンプル。(B)μCTスキャンからの3D再構成。石灰化した組織は水色で示され、石灰化していない組織は赤で示されています。石灰化した組織のない最適なサンプルは、青い線の間の領域から得ることができました。(C)過剰の石灰化組織を伴う次善のプラークを示すμCTスキャンからの3D再構成。スケールバー= 3 mm。略語:μCT =マイクロコンピュータ断層撮影。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig06.jpg"> 図6:代表的なサンプルからのMPM-SHGの結果 。 (A)タイルスキャンの概要。イメージング用に選択したタイルは青色で表示されます。(B)さまざまなタイルからのMIP。(C)選択したタイルからのFOAツールによるファイバー検出。(D) 選択したタイルからの繊維配向ヒストグラム。(E)繊維配向ヒストグラム+ガウスフィット、そこからコラーゲン構造パラメータを選択したタイルから抽出できます。(F)プラークサンプル全体にわたるμp (配向黒線)およびσp (背景色)の表現。(G)プラークサンプル全体にわたるμp (配向黒線)およびPani (背景色)の表現。スケールバー= 140μm(B、C)。略語:MPM-SHG =多光子顕微鏡-第2高調波発生;MIPs = 最大強度投影。FOA = 繊維配向解析;μp =優勢な繊維角。Pani =異方性分率;σp =ファイバー 角分布の標準偏差。Piso =等方性分率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig07.jpg"> 図7:引張試験手順中のプラーク組織サンプルにおける破裂の開始と伝播.1) 伸張前の状態、無傷の組織。 2) 破裂開始-破裂が観察される最初のフレーム。破裂開始位置は赤い四角でマークされています。 3 )および 4) 破裂伝播。 5) プラークサンプルの完全な破裂。スケールバー= 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig08.jpg"> 図8:DIC分析で得られた、破断前のフレームにおける代表サンプル(εxx、εxy、およびεyy)の緑-ラグランジュひずみパターン。 プラーク全体の平均と標準偏差が、破裂位置のひずみとともに与えられます。略語:DIC =デジタル画像相関。εxx =縦ひずみ;εxy = せん断;εyy =引張ひずみ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig09.jpg"> 図9:画像上の破断箇所(赤四角)のオーバーレイ画像。 (A)破断が特定された高速度カメラ画像(破断フレーム)。(B)プリストレッチのみが適用された高速度カメラ画像(参照フレーム)。(C)顕微鏡 で 得られたタイルスキャン画像。(D)さまざまなタイルでの局所コラーゲン構造パラメータを示す色分けされたマップ。プラークサンプル全体のμp (配向黒線)とPani (背景色)が提示されます。略語:μp =優勢な繊維角。Pani =異方性分率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、不均一な構造的および機械的アテローム硬化性プラーク特性を研究するためのメカノイメージングパイプラインを開発しました。このパイプラインにより、コラーゲン線維配向の局所的な優勢な角度と分散、破裂挙動、および線維性プラーク組織のひずみフィンガープリントの相関が可能になります。

The rupture of atherosclerotic plaques in coronary and carotid arteries is the primary cause of fatal cardiovascular events. However, the rupture ...

このプロトコルにより、線維性プラーク組織のコラーゲン構造と機械的障害特性の両方の局所評価が可能になります。構造評価と機械的評価の両方が同じ組織サンプルに対して行われたため、この手法により、組織の構造評価と機械的評価の間の機能的リンクを解明することができます。線維性プラーク組織の構造と障害特性に関するこのプロトコルで得られた知識は、アテローム硬化性プラーク破裂によって引き起こされる臨床的致命的なイベントを防止および予測するための鍵となります。まず、外科用ハサミとピンセットを使用して、動脈の縦軸に沿ってプラークを切り開きます。プラーク標本から長方形のテストサンプルを切り取り、涙や石灰化を含む組織領域を避けながら、サンプルができるだけ大きくなるようにします。次に、プラークテストサンプルを採取し、組織に針を固定して、その両端をシリコーンに固定します。機械的試験中に引張試験装置のクランプ内にあるサンプルの領域に針を挿入します。安全メガネをかけます。サイドカッターを使用して針を短くし、サンプル表面から数ミリメートル未満突き出し、顕微鏡対物レンズの損傷を防ぎます。サンプルが水没するまで、ペトリ皿にPBSを入れます。次に、顕微鏡システムの電源を入れ、多光子キーを回して、顕微鏡の操作ソフトウェアを開きます。試験サンプルの入ったペトリ皿を対物レンズの下に置き、顕微鏡対物レンズを下げます。ライブスキャンモードをオンにします。スマートパネルのノブを使用して対物レンズをサンプルの隅に移動し、タイルスキャンパネルのマーク位置記号をクリックします。正しく実行すると、イメージング用に選択されたすべてのタイルを含むグリッドがオレンジ色で表示されます。次に、画面の右下隅にある[開始]をクリックして、サンプル表面全体のタイルスキャンを作成し、サンプルジオメトリの概要を取得します。タイル スキャン後、自動的に表示される [タイル スキャン] パネルの左上のタイルの左上隅の X 座標と Y 座標を確認します。スプレッドシートでこれらの座標をメモします。[タイル スキャン] パネルで、[スキャンフィールド] というボックスの X 方向と Y 方向のタイルの数を確認します。スプレッドシートのタイル スキャンのサイズをメモします。タイルのサイズを加算または減算して、他のタイルの座標を計算します。タイルスキャンから、第2高調波生成またはSHGイメージングでイメージングするタイルを選択します。選択のために、クランプ内のタイルを避け、縦方向と円周方向の両方で選択した各タイルの間に1つのタイルを残します。次に、このスプレッドシートで計算された座標を使用して、画像化するタイルの位置を特定します。指定されたボックスに座標を入力し、[Enter]をクリックして、目標が右側のタイルに移動します。ライブスキャンモードをオンにします。上部パネルのスライダーとビームパス設定を使用して多光子(MP)レーザー出力を増やし、大幅な漂白なしで可能な限り最高のレーザー出力を取得します。次に、スマートパネルのノブを使用するか、検出器の名前とビームパス設定および追加チャネルをクリックして、検出器のゲインを調整して、飽和ピクセルのない明るい画像を取得します。検出器のゲインの一般的な値は500〜800ボルトです。スマートパネルのZ位置ノブを使用して、フォーカスプレーンを調整します。次に、サンプルの上部に移動し、3番目のパネルの[取得]タブの下にあるZスタックパネルの矢印をクリックして、Zスタックの上部の位置を設定します。次に、SHG信号が検出されなくなるまでサンプルに焦点を合わせます。もう一度、Zスタックパネルの矢印をクリックして、この位置を設定します。終了したら、ライブスキャンモードをオフにします。2 番目のパネルの [取得] タブで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 ヘルツに保ち、ライン平均を 2 に設定し、解像度を画像あたり 512 x 512 ピクセルに設定します。双方向Xスキャンボタンをオンに切り替えます。Zスタックパネルでzステップサイズをクリックし、ボックスに3ミクロンのzステップサイズを入力します。画面の右下隅にある[開始]をクリックして、Zスタックを作成します。完了したら、タイルの座標をファイル名に保存するか、各タイルに番号を付けます。イメージング後、サンプルは機械的試験にさらされます。スパックルパターンを生成するには、組織染料で満たされたエアブラシを試験サンプルから約30センチメートル離して保持し、内腔表面にスプレーします。次に、一軸引張試験では、サンプルの円周方向を引張延伸方向に合わせ、サンプルの内腔側を上に向けて、サンプルを引張試験機のクランプに配置します。ストリップの幅と長さの比率が1未満になるように初期ゲージ長が設定されていることを確認します。トルクドライバーを使用して20センチトンメートルのトルクを加えてグリップのネジを締めます。サンプルが水没するまでPBSを加熱浴に加えます。ロードセルを引き裂き、ロードセルと引張試験機のアクチュエータからのグローバルな力と変位の測定値の記録を開始します。サンプルのたるみを取り除くために、0.05ニュートンのプレストレッチを適用してサンプルをまっすぐにします。プレストレッチの適用後のアクチュエータによるゲージ長測定に基づいて、最大10%ひずみのプレコンディショニングを10サイクル実行します。高速度カメラでサンプルの変形のビデオを記録しながら、サンプルが完全に破損するまで一軸引張試験を開始します。故障後、グローバルな力と変位の測定値の記録を停止します。多光子顕微鏡(MPM)で得られたZスタックを画像JのSHGで開き、各Zスタックの最大強度投影(MIP)を作成します。オープンソースのMATLABベースの繊維配向解析ツールを使用して各MIPを分析し、タイルに存在する個々のコラーゲン繊維の配向角を測定します。別の MATLAB ベースのツールである FibLab を使用して、ガウス分布を角度分布ヒストグラムに適合させます。ガウス分布プロットから、分布のモードである優勢繊維角、繊維角分布の標準偏差、異方性分率などの構造パラメータを抽出します。カメラ画像の目視検査を実行して、破裂開始が発生したフレームを特定します。破裂場所を視覚的に特定します。引張試験中に記録されたカメラ画像を使用して、MATLABベースのソフトウェアncorrを使用してデジタル画像相関、DIC、分析を実行します。最終延伸前の最後のフレームを基準画像として選択します。現在の画像では、最終ストレッチの開始から破断開始が発生したフレームの前の最後のフレームまでのすべての画像を選択します。サンプル表面を関心領域またはROIとして選択します。クランプの近くにある領域を除外します。パラメータのサブセット半径を30ピクセル、サブセット間隔を3ピクセル、反復カットオフを50、差分ベクトルカットオフのノルムを10の5乗、ひずみ半径を5、自動伝搬ステップを5に設定して、DICを実行します。ncorrを使用したDIC解析から、ROIのグリーン-ラグランジュまたはオイラーひずみ分布を取得します。これらのひずみ分布を使用して、破断前の最後のフレームにおけるプラークサンプル表面全体の平均Green-LaGrangeひずみを計算します。破断位置でのグリーン-ラグランジュひずみを計算します。テストサンプルの自然のランドマークを使用して、参照画像とタイルスキャンのオーバーレイを作成し、タイルスキャンの破裂位置を特定します。破裂が発生した MPM-SHG タイルを特定します。MPM-SHGでスキャンしたタイルに破裂がない場合は、破裂位置に最も近いタイルを特定します。破裂が発生したタイルで見つかった構造パラメータを取得します。涙やマクロ石灰化がほとんどまたはまったくない新鮮で無傷のプラークサンプルがここに示されています。プラークサンプルは、これらの涙や石灰化を含まない領域から採取できます。SHG イメージングとイメージの後処理は、イメージ化された各タイルから MIP を提供します。繊維検出によるさらなる後処理により、コラーゲン構造パラメータを抽出できる繊維配向ヒストグラムが得られます。さらに、プラークサンプル全体にわたる局所構造コラーゲンパラメータを示すカラーマップが視覚的分析のために取得されます。これらの試験サンプルから、構造コラーゲンパラメータの大きなサンプル内変動が観察された。引張試験中のプラーク組織サンプルにおける破裂の開始と伝播がここで実証されています。デジタル画像相関解析は、Green-LaGrangeひずみマップなどの局所組織変形マップを提供します。これらの菌株マップから、局所株に大きな試料内変動が観察された。カメラの記録で破裂位置が特定されると、参照カメラ画像と顕微鏡タイルスキャンにマッピングすることができます。これにより、破裂が発生した MPM-SHG タイルと、このタイルで見つかった構造パラメータが提供されます。石灰化がなく、機械的試験に十分な大きさの線維組織サンプルを入手することは、重石灰化したプラークにとって困難な作業になる可能性があります。機械的または構造的特徴が線維性プラーク組織障害の予測因子として特定されると、この特徴を測定するin vivoイメージングシステムにより、患者のプラーク破裂リスクを予測できるようになります。

a-method-to-study-correlation-between-local-collagen-structure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

大動脈洞と上行大動脈の精密切片化と組織化学的および免疫組織化学的分析を組み合わせて、マウスモデルのアテローム性動脈硬化病変を定量化し、特徴付ける手順について説明します。...

マウス大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の病変の定量分析とキャラクタリゼーション

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。...

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

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デジタル画像相関を使用すると、血管の組織標本のローカル株を特徴づけるために、

同時に機械的テストを記述し、孤立の動脈壁の 3 D イメージング生きる人間の抵抗動脈とエラスチンとコラーゲンの組織およびボリュームの空間密度の定量化のためのフィジーと Ilastik...

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

動物解剖、組織を埋め込む、断面、染色、腕頭動脈の分析の体系的な方法を含む後期マウスの動脈硬化病変の細胞構成を特徴づけるための標準化されたプロトコルを提案します。atheroprone 平滑筋細胞系譜トレース...

平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルは、分子レベルで病原性経路を調査するのに有用なツールであるが、病変発症の標準化された定量化を必要とする。このプロトコルは、大動脈根、大動脈アーチ、および高潔な動脈を含む主要な動脈血管の病変サイズを決定するために最適化された方法を記述する。...

マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化

心筋梗塞が起こる前に介入を導くために冠状血管系でどのアテローム硬化性病変が進行するかを決定する必要がある。この記事では、この進行を予測するのに役立つ市販の有限要素ソルバーで流体構造相互作用技術を使用した光コヘレンス断層撮影による動脈の生体力学的モデリングについて概説します。...

冠動脈動脈硬化の光コヘレンス断層撮影法による生体力学的流体構造相互作用解析

In vivo Cine Invascular 超音波画像は、さまざまな圧力負荷条件に対応する冠動脈断面の動きを示しています。有限要素モデルに基づいて、反復スキームを使用して、計算モデルと医用画像からの冠状動脈の動きを一致させることにより、 in vivo で冠状動脈の患者固有の機械的特性を決定しました。...

ヒト冠動脈のin vivo機械的特性を定量化するための血管内超音波画像ベース有限要素モデリングアプローチ 

このプロトコルは、アテローム性動脈硬化症のプラークの定量分析のための包括的な方法論を提供し、アテローム性動脈硬化症のメカニズムと進行に関するより詳細な研究を促進します。...

アテローム性動脈硬化症マウスモデルにおける大動脈弓および大動脈基部病変の単離と解析

生理学的および病理学的圧力の条件に心臓弁組織を施すことのできる周期的圧力のバイオリアクターを設計されています。...

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

学ぶアテローム硬化性プラークのコラーゲン構造と機械的性質の相関解析法。多光子顕微鏡と一軸引張試験を統合し、組織破壊予測に寄与する機能的関連を解明します。

アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

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