マウス骨細胞における負荷誘発カルシウムシグナル伝達ダイナミクスを研究するための蛍光生体内イメージングアプローチ
2023年2月24日
本稿では、マウス第3中足骨の組織レベルの機械的負荷に応答して、 in vivo で埋め込まれた骨細胞の機械的に誘導されるカルシウムシグナル伝達をリアルタイムで観察するための生体内イメージングアプローチの実施について説明しています。
このプロトコルは、骨メカノバイオロジーの研究における重要な進歩を表す、埋め込まれた骨細胞を in vivo で観察する方法を提供します。この技術の主な利点は、骨細胞の細胞および分子レベルのイベントを in vivo で観察し、骨細胞の固有の 3D 空間配置、血流、内分泌状態を維持し、in vitro 細胞実験によって通常課せられる制限を克服できることです。この手法は、マウスモデルにおける基礎科学調査用に設計されています。それらはまだ治療や診断には及ばないが、次世代の骨治療を定義する洞察を得る機会を提供する。
[ナレーター]まず、第2中足骨と第3中足骨の間の真皮をメスで切開し、遠位端から始まり、骨の長さに沿って近位に進行します。鉗子を使用して、皮膚を内側または外側の端に向かって引っ張って手術部位を開きます。まっすぐなヴァンナスハサミを使用して伸筋腱を切除し、第3中足骨を露出させます。中足骨負荷装置の中央支点ピンを、第 3 中足骨が近位指骨と接する遠位端の小さなスペースに挿入します。次に、ピンが第3中足骨の中央軸に収まるまで近位に動かします。筋肉や筋膜を除き、骨とピンの間の直接のインターフェースを保証するように特別な注意を払ってください。鉗子で足首を持ち、DPBSで満たされたウォーターバスに足を入れます。ローディングブラケットで足を所定の位置に固定し、ブラケットをアクチュエータロードセルの配置に接続します。マウスでローディングデバイスのセットアップを慎重に持ち上げ、顕微鏡プラットフォームに置きます。落射蛍光モードの低倍率対物レンズから始めて、骨の中央骨幹を特定して中央に配置します。関心領域を見つけたら、より高い水浸対物レンズ倍率に切り替え、光学系を2光子に切り替えます。ガルボ/共振領域のコントロール設定を使用して、ピクセル密度を設定します。光退色を避けるには、パワーコントロールオプションを使用してパワーを減らし、ガルボ/レゾナンススキャナーコントロール設定でPMT増幅を上げます。525ナノメートルを中心とするバンドパスフィルターを使用した緑色のチャネルで線維性骨膜自家蛍光を探して、2光子モードで骨の表面を識別します。ロード中にボーンの目に見える動きがある場合は、Y方向またはZ方向に沿って別の関心領域を選択して、中心の支点ピンの真上にあることを確認します。動きが続く場合は、第3中足骨の下にあるピンの手術位置を手動で調整します。実験計画に従って負荷をかけてZスタックイメージングを実施して形態計測シグナル伝達イベントを記録し、次に負荷をかけてTシリーズイメージングを実施して動的負荷誘発シグナル伝達イベントを記録します。GCaMp6fをin vivoで発現する中足骨骨細胞の単一平面2光子画像をここに示します。カルシウムレポーターコンストラクトの内因性発現は、インキュベーションを必要とせずに蛍光標的を提供します。2つの光子顕微鏡で捕捉されたin vivoの骨細胞の3D Z投影をこの図に示します。XY平面の横方向のカットと矢状方向のカットは、Zスタックの深さを示します。代表的な画像は、埋め込まれた骨細胞からのGCaMp6f蛍光シグナルの時間経過の例を示しています。安静時には、低レベルのノイズ変動が示されます。負荷がかかると、カルシウムの変動は大きさと規則性で増加し、多くの場合、加えられた負荷と歩調を合わせて発生します。
この方法は、研究者が、以前は in vitro または ex vivo でしか可能でなかった in vivo での骨細胞メカノバイオロジーに関する機能ベースの質問に答える道を開きます。
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概要
本記事では、in vivo での機械的負荷に応答した骨細胞内のカルシウムシグナルを観察するための生体内イメージングプロトコルを紹介します。この手法により、骨の本来の環境を維持したまま、細胞レベルの事象をリアルタイムで観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 骨のメカノバイオロジー
- 生体内イメージング技術
- 骨細胞におけるカルシウムシグナリング
背景
- 骨細胞は骨のメカノバイオロジーにおいて極めて重要な役割を果たしています。
- 従来のin vitro手法では、天然の環境における細胞応答の理解に限界がありました。
- 本手法により、3次元的な空間配置と生理学的条件を維持したまま骨細胞を観察することが可能になります。
- 得られた知見は、将来的な骨治療戦略に寄与することが期待されます。
研究目的
- 機械的負荷負荷中の骨細胞をin vivoで観察する方法を開発すること。
- 骨細胞におけるカルシウムシグナリングダイナミクスの理解を深めること。
- 骨の健康と疾患に関する今後の研究の基礎を提供すること。
使用された手法
- マウスの第3中足骨に到達するためのメスによる切開。
- 機械的ストレスを負荷するための中足骨負荷装置の使用。
- 骨細胞をリアルタイムでイメージングするための二光子顕微鏡法。
- ZスタックおよびTシリーズイメージングによって捉えられた、動的負荷誘発性のシグナル伝達イベント。
主な結果
- リアルタイムイメージングにより、負荷中の骨細胞におけるカルシウム変動が明らかになった。
- 蛍光信号の強度は、機械的ストレスに伴って増大した。
- 3Dイメージングにより、骨細胞の空間的配置に関する知見が得られた。
- 骨のメカノバイオロジーを研究する上での本手法の有効性が実証された。
結論
- このプロトコルにより、骨のメカノバイオロジー研究に大きな進展がもたらされます。
- 骨細胞のリアルタイムイメージングは、骨の健康に関する理解を深めることにつながります。
- 本手法は、骨治療における将来的な治療戦略への道を切り拓く可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
機械的負荷条件下における骨細胞のカルシウムシグナリングをin vivoで直接イメージングすることは、分子レベルでの骨のメカノトランスダクション（機械的刺激の信号変換）に関する理解における重要な空白を埋めるものです。この技術は、本来の生理学的コンテキストにおいてメカノセンシング経路をリアルタイムで観察することを可能にし、早期創薬における予測の信頼性を高めます。本アプローチは、メカニズム的なリスク低減を後押しし、骨の健康および骨格疾患ポートフォリオにおけるターゲットバリデーションに有用な情報を提供します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 生理学的に適切な環境で、骨細胞のメカノセンシング経路の解析を可能にします。
- 本来の3D構造と全身的な影響を維持することで、生物学的なリスク低減（de-risking）を支援します。
- 骨のメカノトランスダクション機構における機能的なターゲット検証を促進します。
- 骨関連ターゲットの優先順位付けにおける予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 規定の機械的負荷に応答したカルシウムシグナリング動態を定量化するための、検証済みin vivoシステムを提供します。
- 後続のアッセイ開発に向けて、骨細胞活性の再現性のある定量的な読み取りを可能にします。
- 化合物の評価に向けたメカノトランスダクションアッセイの標準化を支援します。
- 骨のメカノセンシティビティに影響を与えるモジュレーターの、スケールアップ可能なスクリーニングのための基礎を築きます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- メカニズムに関する知見を疾患に関連した骨モデルと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- in vivoのメカニズムデータに基づき、リスク調整された骨標的介入の推進を可能にします。
- 骨細胞のシグナル伝達ダイナミクスに関連するトランスレーショナルバイオマーカーの特定を支援します。
- 探索段階の知見を、完全な生体システムにおける前臨床検証へと橋渡しします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この生体内イメージング法は、初期探索と前臨床研究のインターフェースとして統合されており、生きた骨組織における直接的な仮説検証およびパスウェイの解明を可能にします。
- 発見生物学： 生体内における機械的刺激に対する骨細胞の応答に関するメカニズム的仮説の検証をサポートします。
- スクリーニング： アッセイへの適用に向けた、定量的で再現性のあるカルシウムシグナリング測定を実現します。
- アナリティクス： 動的な蛍光読み取りにより、異なる負荷条件下でのシグナリングの比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患関連モデルにおいて、分子シグナリングイベントと骨全体の機能的アウトカムを関連付けます。
- エンタープライズ再利用： 骨研究プログラム全体で活用可能な、メカノバイオロジー研究のための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：骨のメカノトランスダクション研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：再現性と拡張性を確保するため、in vivoイメージングのワークフローを標準化します。
- 戦略的価値：骨標的R&Dにおけるgo/no-go判断に情報を与え、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：骨の健康および骨格疾患資産のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 生体内イメージングおよび小動物手術技術に関する専門知識が必要である。
- 2光子顕微鏡および精密な機械的負荷装置へのアクセスが必須である。
- イメージングパラメータおよびデータ解析に関するチーム間での標準化が必要である。
- 他の骨部位やモデルに適応させる場合は、プロトコルの最適化が必要になる可能性がある。
- 現在のデータに基づき、マウスモデルを用いた基礎科学研究に限定される。
