Name: CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いた胚性幹細胞での高効率遺伝子ターゲティング法。マウスモデル開発において薬剤選択不要で大規模DNAノックインを実現し、基礎生命科学から応用医学研究まで幅広く貢献する革新的プロトコルです。

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特定非営利活動法人バイオテクノロジー研究開発法人大阪大学の西岡紗希さん、東京大学医科学研究所の菊池美緒さん、坂本玲子さんの優れた技術支援に感謝します。本研究は、文部科学省/日本学術振興会科研費助成事業(JP19H05750、JP21H05033)、MO(20H03162)の支援を受けて行われました。科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業(CREST) 助成 (JPMJCR21N1)ユーニスケネディシュライバー国立小児保健人間発達研究所からMI(R01HD088412);ビル&メリンダゲイツ財団からMI(グランドチャレンジ探検助成金INV-001902);大阪大学微生物病研究所の共同研究プロジェクトのための助成金からMI、およびMO。

すべてのマウス実験は、東京大学の施設内動物管理・利用委員会(承認番号PA17-63)および大阪大学(承認番号Biken-AP-H30-01)によって承認され、それらのガイドラインおよびARRIVEガイドライン(https://arriveguidelines.org)に従って実施されました。
1. ターゲティングベクター構築
<ol><li>KIカセット(ここではCreERT、PCR用のテンプレートDNAはもともと市販の遺伝子合成会社からのものです)と5'または3'-相同性アームの約1 kbフラグメントをPCRで増幅します。DNAクローニング(ステップ1.3)では、各PCRプライマーの5'末端に15量体のオーバーラップ配列を追加します。PCR用DNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、続いてDNA精製キットを用いてDNA断片を抽出した。</li>
	<li>クローニングのためにマルチクローニングサイトのどこかで一意に消化する適切な制限酵素を使用して、バックボーンプラスミド(pUC19やpBSなど)を線形化します。次いで、DNA精製キットを用いて消化プラスミドを精製する。</li>
	<li>各PCRフラグメント(例えば、5'-ホモロジーアーム、3'-ホモロジーアーム)およびKI配列を同時に、製造元の指示に従ってDNAクローニングキットを使用して消化されたプラスミドにクローニングします。</li>
	<li>構築したプラスミドを使用してコンピテントセルを形質転換し(ステップ1.3)、水浴中で42°Cで1分間加熱し、アンピシリンやカナマイシンなどの抗生物質を適切な濃度で含むLBプレートに播種します。それらを一晩培養して、耐性クローンを選択します。</li>
	<li>200 μLのピペットチップを使用して数個(4〜8個)の個々のコロニーをピックアップし、適切な抗生物質(100 μg/mLアンピシリンまたは20 μL/mLカナマイシン)を含む3 mLの液体LBにチップを移し、振とうしながら37°Cで一晩培養します。</li>
	<li>翌日、エンドトキシンフリーグレードの市販プラスミド精製キットを使用して、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。プラスミド中のクローニング配列をサンガーシーケンシングにより確認する。ヌクレアーゼフリーの水を使用して、プラスミド濃度を1 μg DNA/μLに調整します。プラスミドを遺伝子ターゲティングベクターとして使用します。</li>
</ol>2. ESCのフィーダー細胞としてのマウス胚性線維芽細胞(MEF)の作製
<ol><li>8〜10週齢の妊娠中のICR雌マウス(性交後14.5日)を頸部脱臼によって犠牲にする。滅菌に70%(v / v)エタノールを使用して腹部をよく拭き、眼窩ハサミと鉗子を使用して腹部を切断し、胎児を含む子宮を回復します。</li>
	<li>子宮を、100 U / mLペニシリンと100 μg / mLストレプトマイシンを含む10 mLのリン酸ウシ血清(PBS)を含む100 mmディッシュに入れます。眼窩はさみと鉗子を使用して胎児から胎盤と胚外組織を取り除きます。眼窩ハサミを使用して胎児をミンチし、ミンチした胎児細胞を含むPBS溶液を50mLのコニカルチューブに移します。</li>
	<li>280 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。10 mLの0.25%(w/v)トリプシン-EDTA溶液を加え、ピペッティングでよく混合した後、トリプシン消化用のウォーターバスを使用して37°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>20 mLのMEF培地(10%(v/v)ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むDMEM)を加えて酵素反応を停止し、穏やかな反転によってよく混合し、280 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引して廃棄し、MEF培地を10mL加え、ピペッティングでよく混合します。</li>
	<li>細胞懸濁液をいくつかの新しい100 mmディッシュに播種します(100 mmディッシュ1枚に対して10 mLのMEF培地で胎児の数と同じ数のディッシュを準備します)。播種後4〜5時間で培地を交換して、付着していない細胞を取り除き、付着したMEFを成長させます。細胞が~80%のコンフルエントに達したら、トリプシンを使用して細胞を継代します。</li>
	<li>増殖するMEFを含む培養皿をMEF培地に入れ、播種後約12〜15日目に、X線照射装置に入れる。MEFを50 Gy(合計)のX線で露光し、製造元の指示に従って細胞周期を停止させます。</li>
	<li>照射したMEFを100 mmディッシュ1枚に2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えて37°Cで5分間トリプシン処理し、次に4 mLのMEF培地を加えてトリプシン消化を停止し、細胞懸濁液を新しい50 mLチューブに回収します。</li>
	<li>MEFを新鮮なMEF培地で280 x g で4°Cで5分間遠心分離して洗浄し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞数をカウントし、細胞凍結培地中で1.6 x 106 細胞/チューブで凍結します。使用するまで保管してください。細胞は液体窒素中で数年間安定して保存することができます。</li>
</ol>3. Cas9-RNP-DNA混合物の調製
<ol><li>tracrRNAおよびcrisprRNAをピペッティングにより希釈バッファー(各RNA濃度200 μM)に溶解します。tracrRNA溶液、crisprRNA溶液、および希釈バッファー(容量比2:2:5)を穏やかにタッピングして混合し、サーマルサイクラーを使用して95°Cで10分間アニールした後、温度が4°Cに達するまで1°C/分の降圧サイクルを行います。 注:gRNA配列は、クリスポール http://crispor.tefor.net を使用して設計されました。</li>
	<li>アニーリングしたRNA、10 μg/μLのCas9ヌクレアーゼ、およびエレクトロポレーションバッファーを容量比5:3:2で混合し、37°Cで20分間インキュベートし、Cas9-RNP複合体を形成します。ルーチンワークでは、1遺伝子座ゲノム編集のために、1.25 μLのアニーリングRNA、0.75 μLのCas9ヌクレアーゼ、および0.5 μLのエレクトロポレーションバッファーを混合してインキュベートします。</li>
	<li>1.5 mLチューブで次の材料を混合します:10 μLのエレクトロポレーションバッファー、1 μLのCas9-RNP複合体(ステップ3.2)、および1 μLの円形ターゲティングベクター(1 μg/μL、ステップ1.6)。Cas9-RNP-DNA混合物の総量は12μLである。 Cas9-RNP-DNA混合物をエレクトロポレーションまで氷上に保管してください。 注:KI後のgRNAの再切断を防ぐために、KIドナーの組み込みによってgRNA認識配列が分割される位置にgRNAを設計してください。そのような場所でgRNAを設計できない場合、アミノ酸配列が変化しないいくつかのヌクレオチドサイレント変異がKIドナーのプラスミドに含まれる。</li>
</ol>4. ESCの遺伝子ターゲティング
<ol><li>ゼラチンコーティングされた細胞培養ディッシュを調製するには、60 mmディッシュの場合は2 mL、24ウェルプレートの場合は500 μL、96ウェルプレートの場合は100 μLの0.1%(w/v)ゼラチン溶液を加え、湿度の高いインキュベーターで2時間インキュベートします。ゼラチン溶液を取り出し、同量のPBSで2回洗浄し、使用するまで室温で保存します。</li>
	<li>37°Cの水浴を用いて有糸分裂的に不活化した凍結MEFストックを1分間解凍し(ステップ2.2)、ESC播種の1日前にゼラチンコーティングされた60 mmディッシュ(2つの60 mmディッシュに対して1.6 x 106 セルを含むMEFの1つの凍結ストックチューブ、ステップ2.2)にMEFを置きます。</li>
	<li>凍結したESCストックチューブ(2 x 10 5 ESC /チューブで保存、セルカウントはセルカウンターを使用して実行)を37°Cの水浴で1分間解凍し、1 x 105 ESCを播種済みのMEFを含む60 mmディッシュに置きます(ステップ4.1)。</li>
	<li>4 mL ESC培地(ESCM、15%(v/v)ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン基質、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、白血病抑制因子、およびESC11の多能性を維持するt2i(0.2 μM PD0325901および3 μM CHIR99021)を、ESCが50%から70%のコンフルエントに達するまで5%CO2 で37°Cで培養します。 注:ESCの3つの異なる行を使用します:JM8。B6NからA3、B6-129 F1からV6.5、および自社開発のBALB/c ESCです。この原稿の同じKIプロトコルがすべてのESCラインに使用されています。</li>
	<li>培養中のESCを4 mLのPBSで洗浄し、800 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液で37°Cで5分間処理して消化します。1 mLのESCMを加えてトリプシンを不活性化し、ピペッティングによってESCを単一細胞に解離させます。</li>
	<li>ESC含有溶液を280 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、新鮮な1 mLのESCMにESCを再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞数をカウントします。1 x 10 5 ESCを新しい1.5 mLチューブに移し、500 x g、4°Cで遠心分離することによりPBSで3回洗浄します。</li>
	<li>ESCペレットを12 μLのCas9-RNP-DNA混合物に再懸濁し(ステップ3.3)、泡立ちを避けるために穏やかなピペッティングでよく混合します。再懸濁したESCをエレクトロポレーション用に提供します。エレクトロポレーションシステムは、Cas9-RNP-DNA形質導入に1,400 Vおよび30 msの単一パルスを使用します(図1)。</li>
	<li>有糸分裂的に不活性化されたMEFを含む4 mLのESCMを含む60 mmディッシュでエレクトロポレーションされたESCを培養します(セクション4.2)。培地は毎日交換してください。</li>
	<li>エレクトロポレーションの3〜5日後にESCを4 mLのPBSで洗浄し、800 μLの0.25%トリプシン-EDTAで処理し、湿潤インキュベーターで37°Cで5分間培養して消化します。2 mLのESCMを加えてトリプシン消化を停止し、細胞混合物を280 x g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を廃棄し、ESCを1 mLの新鮮なESCMに再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを用いて細胞濃度をカウントします。ESCMとフィーダーMEFを含む60mmディッシュあたり1 x 103 ESCでESCを通過させます。コロニーが回復するまで毎日培地を交換してください。 注:ESCがピックアップ前に一度通過する理由は、ESC分裂後もゲノム編集が起こり続ける可能性があるため、多くの場合、最初のコロニーが必ずしもクローンであるとは限らないためです。したがって、コロニーピックアップ前のESCの最初の通過は、単一クローンをピックアップするための必須ステップである。</li>
</ol>5. 標的ESCのPCRジェノタイピング
<ol><li>最初の継代の5〜7日後にESC培養皿からESCMを吸引し(ステップ4.9)、4mLのPBSを添加する。実体顕微鏡下で20 μLのピペットを使用して、5 μLのPBSを含む単一のESCコロニーをピックアップします(30倍から40倍の倍率)。個々のコロニーを、15 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を含む丸底96ウェルプレートのウェルに入れます。</li>
	<li>48個の個々のコロニーがピックアップされるまで、96ウェルプレートを氷上に置いておきます。96ウェルプレートを37°Cの湿度5%CO2 インキュベーターで5分間インキュベートした後、80 μLのESCMを加えてトリプシン消化を停止し、ピペッティングによってESCコロニーを単一細胞に解離させます。 注:この方法のKI効率は通常10%〜50%であるため、私たちは日常的に48個のクローンをピックアップし、そのうち24個を使用して最初にジェノタイピングを実行します。この時点で複数のKIクローンを取得できない場合は、残りの24クローンを使用してKIをさらにスクリーニングします。</li>
	<li>40 μLのESC懸濁液を、PCRジェノタイピングのためにウェルあたり50 μLのESCMを含むゼラチンコーティングされたフィーダーフリー96ウェルプレートに移します(ステップ5)。残りの60 μLのESC懸濁液を、500 μLのESCMとフィーダーMEFを含むゼラチンコーティングされた24ウェルプレートのウェルに移し、凍結ESCストックを作成します。</li>
	<li>個々のESCクローンを24ウェルプレートで培養し(ステップ5.3)、60%〜80%のコンフルエントに達するまでストックします。上記のようにトリプシン処理によって個々のESCクローンを回収し、新しい1.5 mLチューブに細胞を回収し、280 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を500 μLの細胞凍結培地に再懸濁し、-80°Cのディープフリーザーを使用して凍結します。</li>
	<li>PCRジェノタイピングの場合、ESCクローンを96ウェルフィーダーフリープレートで培養します(ステップ5.3)ESCが90%以上のコンフルエントに達するまで。吸引により各ウェルからESCMを除去し、100 μLのPBSで2回洗浄します。</li>
	<li>PBSを吸引し、プロテイナーゼKを含む100 μLの溶解バッファーを加えてよく混合し、ESCライセートを新しい1.5 mLチューブに移します。加熱チャンバーを使用して、ESCライセートを65°Cで少なくとも1時間加熱します。従来のフェノール-クロロホルムDNA精製法を用いてゲノムDNAを抽出・精製した後、エタノール沈殿法で精製する。</li>
	<li>沈殿したDNAを20 μLのDNaseフリー水に溶解し、分光光度計を使用してDNAの純度と濃度を測定します。遺伝子座特異的プライマーセットを使用してゲノムPCRを実行し、標的領域を増幅します。次に、シーケンスを確認し、目的のKIシーケンスを持つESCクローンを選択します。</li>
</ol>6. 8細胞期胚の作製とESCのマイクロインジェクション
<ol><li>5IUの妊娠牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に成人ICR女性に注射します。.48時間後、5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を同じ女性に注射し、ホルモン処理された女性をICRオスと交配させます。翌日(胚の日0.5、ED0.5)に膣内の交尾プラグを確認してください。 注:コートの色の比率でキメラを評価するには、黒またはアグーチのコートの色の背景を持つESCのレシピエントとしてICR株の胚盤胞を使用するか、アルビノの背景を持つESCのレシピエントとしてC57BL / 6株の胚盤胞を使用します。</li>
	<li>ED1.5で卵管を収集し、HEPES緩衝培地(FHM)ドロップに入れます。眼底に挿入されたフラッシング針を使用してFHMで卵管をフラッシュすることにより、2細胞または4細胞期の胚を回収します。</li>
	<li>収集した胚をマウスピペットを使用していくつかの新鮮なFHMドロップに移して洗浄します。50 μLのKSOMドロップで、鉱物油で覆われた35 mm細胞培養皿上で、37°C、5%CO2 インキュベーターで、8細胞または桑実胚期(ED2.5)に達するまで1日間培養します。</li>
	<li>次の採取日に胚を使用しない場合は、CARDプロトコル(http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html)に従ってガラス化保存し、使用するまで液体窒素で保存します。</li>
	<li>プーラーとマイクロフォージを使用して、胚を保持するためのガラスピペット(外径80〜100 μm)とESC注射(直径約13 μm)を準備します。</li>
	<li>FHMを含む保持ピペットをマイクロインジェクターに接続し、マイクロマニピュレーターの左側に設置するキャピラリーホルダーに統合します。インジェクションピペットを別のマイクロインジェクターに接続し、右側に設置します。2つのピペットを顕微鏡の視野にまっすぐ合わせます。</li>
	<li>FHM培地中の12%(w / v)ポリビニルピロリドン(PVP)の5 μL滴とFHMの5 μL滴を60 mmディッシュの同じ蓋に並べて分注し、滴をミネラルオイルで覆います。5 μLのFHMドロップに胚を移し、胚を含むFHMドロップに1〜5 μLのESC懸濁液を加えます。 注:ドロップを準備する前に、ESCおよびMEF懸濁液を60mmの培養皿上の4 mL ESMに30分間放置します。MEFはESCよりも早く底に付着するため、この30分間のインキュベーションにより、上清中の未付着ES細胞の濃度が可能になります。</li>
	<li>インジェクションピペット内をPVPで洗浄し、胚とESCを含むドロップに移動します。</li>
	<li>細胞分裂が終了したばかりの3つのECSダブレット(6つのセル)をインジェクションピペットでピックアップします。圧縮が完了した8細胞または桑実胚を吸引ピペットで保持します。圧電パルス(強度:3、速度:3)で透明帯に穴を開けます。 透明帯内の6細胞ESCを排出し、ピペットを胚から引き出します。</li>
	<li>ESC注入した胚をマウスピペットを使用して数滴のKSOM滴で穏やかに洗浄し、胚が胚盤胞期に発達するまで、37°C、5%CO2 の鉱物油で覆われた新しい50μLのKSOMドロップでインキュベートします。</li>
	<li>10個のESC注射された胚盤胞を偽妊娠雌マウスの各子宮角に移します(性交後2.5日、頭あたり20個の胚盤胞)。</li>
	<li>代理母が出産した後、キメラ比が最も高い(毛色で確認される70%以上)オスのキメラを少なくとも2つ選択し、適切な系統のメスと交配してF1ヘテロ接合KIを得る。</li>
	<li>個々のKIマウスを適切なパートナーと交配して、研究に適した望ましい遺伝子型または遺伝的背景を持つマウスを取得します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、開示する競合する利益を持っていません。

ESCの遺伝子ターゲティングとそれに続くキメラ産生は、遺伝子操作マウスの開発に従来から用いられてきた。それにもかかわらず、ターゲティングベクターが陽性または陰性の薬物選択遺伝子カセットを有する長い(通常>数kb)相同性アームを含むにもかかわらず、遺伝子ノックイン効率は低いままである。私たちのプロトコルは、薬物選択カセットのない環状プラスミドをターゲティングベクターとして使用して、Cas9-RNPを介したゲノム編集を日常業務に許容できる効率で使用した長い外因性DNAのチューンアップESC KI法を導入しました。したがって、このプロトコルは、従来のESCターゲティングと比較して、遺伝子改変キメラマウスの作製にかかる時間を大幅に短縮するのに役立つ可能性があります。
このプロトコルでは、CRISPR/Cas9-RNPを使用してゲノムの部位特異的二本鎖切断を誘導し、直鎖化プラスミドの代わりに環状プラスミドをターゲティングベクターとして使用しました。直鎖化プラスミドは、ゲノム組み込みの効率が高いため、従来、遺伝子KIのターゲティングベクターとして使用されています8,9,10。しかし、ベクターに相同アームが含まれているにもかかわらず、多くのゲノム統合は非特異的です9。一方、環状プラスミドは、ESC12または線維芽細胞13のゲノムへの組み込みが困難な特徴のため、ターゲティングベクターとして使用されることはめったにありません。したがって、CRISPR/Cas9を介したゲノム編集を伴うターゲティングベクターとして環状プラスミドを適用すると、非特異的なランダム統合が最小限に抑えられますが、ESCゲノムへの部位特異的な組み込みが最大になる可能性があります。CRISPR/Cas9による二本鎖切断の誘導効率が非常に重要であることは注目に値する14ため、高効率で二本鎖切断を誘導するgRNAを使用することが不可欠である。KI効率が低すぎる場合は、gRNAを再設計することを検討する必要があります。図2に示すケースでは、ESCクローンの40.9%がKI特異的バンドを示した。実際、当研究所のコアラボとして、ここで説明した方法でESCを用いた遺伝子ターゲティングを日常的に行っており、遺伝子座によって多少のばらつきはありますが、Cre、CreERT、蛍光レポーターなどの1〜2 kb配列で10%〜50%のKI効率を達成しています。この方法を用いてKIに成功した最長のDNA配列は、Rosa26遺伝子座に約11.2 kbで、効率は12.2%でした(分析された41コロニーのうち5KIコロニー)。
また、このプロトコルでは、ESCマイクロインジェクションのレシピエントとして8細胞または桑実胚を使用しますが、胚盤胞期の胚は使用しないことにも注意してください。本論文では比較実験を行っていませんが、8細胞または桑実胚へのESCの注入は、胚盤胞へのESC注射と比較して、キメラ子孫へのESC寄与の効率を有意に改善することがいくつかの報告されています15,16,17,18。.実際、C57BL / 6、B6-129 F1、およびBALB / cを含むさまざまなESC株のESC注射は、一般的に、すべてではありませんが、一部の子孫で高い毛色のキメラの発達をもたらしました(図4を参照)。この方法の限界は、着床前胚に注入されたESCがキメラ19,20の生殖細胞に常に寄与するとは限らないことである。ESCの生殖細胞系列伝達は、各ESCクローンの品質に依存する19。したがって、安定したキメラマウス産生のためのバックアップとして複数のESCクローン株を開発することが有利であろう。結論として、ここで提示されたプロトコルは、薬剤耐性カセットなしでKIの各相同性アームと関心のある遺伝子のみを含む単純なターゲティングベクターを使用します。したがって、ベクター構築ははるかに容易であり、従来のESCターゲティング技術と比較して培養期間を短縮することができます。これは、将来の生命科学における解析のために、さまざまな種類の遺伝子改変マウスを迅速かつ容易に作製するのに役立ちます。

遺伝子改変マウスを作製し、その表現型を解析することで、生体内で特定の遺伝子機能を詳細に理解することができます。遺伝子改変動物モデルを用いて、ライフサイエンス分野で多くの重要な知見が明らかにされています。さらに、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術の報告以降1、遺伝子改変マウスを用いた研究は急速に多くの研究室に広まった2,3。CRISPR/Cas9によるマウス接合体のゲノム編集は、インデル変異指向遺伝子ノックアウト4、一塩基置換、またはノックイン(KI)ドナーとして一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を使用した短いペプチドタグ挿入などの短いDNA修飾を開発するための許容可能な効率を達成しました5。一方、ゲノム編集による接合子への大きなDNA断片のKIは、短サイズDNA修飾と比較して低い効率にとどまっています6,7。また、免疫学などの特定の研究分野にとって重要な株であるBALB/cなどのマウス系統は、着床前胚がin vitro操作を受けやすいため、接合子ベースのゲノム編集に使用することは困難です。
遺伝子改変マウスモデルを開発する別の方法は、胚性幹細胞(ESC)ターゲティング技術を使用し、その後着床前胚にESC注射してキメラ8,9,10を産生することであり、これは現在でも従来の方法として日常的に使用されている。従来のESCターゲティング法では、正確なKI-ESCクローンを取得するための取得率はそれほど高くありませんが、ESCターゲティングは、特に長いDNA KIの場合、接合子ゲノム編集と比較していくつかの利点があります。例えば、接合子ゲノムへの長いDNA断片(>数kb)のKI効率はあまり明らかではなく6,7、KIマウスの1系統でも多くの接合子が必要であり、現在の動物実験の観点からは望ましくない。接合子ゲノム編集とは対照的に、ESCへの長いDNA標的化とそれに続くキメラ産生は、接合子ゲノム編集よりも有意に少ない胚を必要とする。さらに、BALB/cからの着床前胚はin vitro操作の影響を受けやすいが、それらのESCは他の有能な129またはF1バックグラウンドESCと同様にin vitro11で維持および処理できるため、キメラ産生に適用可能である。しかしながら、ターゲティングベクターがポジティブまたはネガティブ選択のための5'および3'相同アームおよび薬剤耐性遺伝子カセットを含むとしても、ESCの従来のKI効率は一般に不十分であり、ランダムゲノム統合の頻度が高いため8,10、したがって、正確なESCターゲティング効率を有する改良された方法が必要とされる。最近、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を用いたチューンアップESC KI法により、従来のターゲティング法よりも高いKI効率を達成したことを報告しました11。ここで説明する方法は、この手順に基づいており、長いDNA(数〜10 kb>)のKIからESCまで、薬物を選択せずに日常業務に許容できる効率で行うことができます。したがって、ベクター構築手順ははるかに簡単で、より短い期間を必要とするか、または細胞培養期間も大幅に短くなります。

<table><tbody><tr><td>BALB/c ESC</td><td>-</td><td>-</td><td>BALB/c株</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>CS-02-001</td>細胞<td>凍結培地から開発されたESC。セクション 2.6 およびその他の場所</td></tr>、<tr><td>Cas9、Nuclease V3</td>、<td>IDT</td><td>1081059</td><td>セクション 3.2、およびその他の場所。</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>富士フイルム和光</td><td>038-23101</td><td>Section 4.3</td></tr><tr><td>CreERT gene fragment</td><td>GeneWiz</td><td></td><td>Section 1.1.</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 crisprRNA</td><td>IDT</td><td></td><td>のcrisprRNA。セクション 3.1 およびその他の場所。</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072534</td><td>tracrRNA。セクション 3.1 およびその他の場所。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ナカライ</td><td>08458-45</td><td>MEFミディアム。セクション2.3およびその他の場所</td></tr>:<tr><td>二本鎖</td><td>バッファーIDT</td><td>1072534</td><td>RNA希釈バッファー。セクション 3.1 およびその他の場所。</td></tr><tr><td>FastGene Gel/PCR Extraction Kit</td><td>日本ジェネティクス</td><td>FG-91302</td><td>セクション 1.1 および 1.2.</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー35-050-061</td><td>L-グルタテン基質</td></tr><tr><td>hCG</td><td>ASKA動物衛生</td><td></td><td>セクション6.1。</td></tr><tr><td>In-Fusion HDクローニングキット</td><td>Clontech</td><td>639648</td><td>DNAクローニングキット。セクション1.3およびその他の場所</td></tr><tr><td>JM8。A3</td><td>ESC EuMMCR-ESC</td><td></td>は、<td>C57BL/6N株</td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>10829018</td><td>セクション4.3などから開発された、DMEMベースの改変商用媒体です。</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>メルク</td><td>MR-121-D</td><td>セクション6.3および6.9。</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>富士フイルム和光</td><td>125-05603</td><td>セクション 4.3.プロバイダから単位濃度データは提供されません。このプロトコルでは1,000倍希釈を使用しました。</td></tr><tr><td>ネオンエレクトロポレーションシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MPK5000</td><td>セクション3.2、4.5など。このシステムには、セクション3.2で使用されているエレクトロポレーションバッファーが含まれています。</td></tr><tr><td>NucleoSpin プラスミドトランスフェクショングレードの</td><td>Takara</td><td>U0490B</td><td>セクション 1.6.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>富士フイルム和光</td><td>162-25291</td><td>セクション 4.3</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>あすか 動物衛生</td><td></td><td>セクション 6.1.</td></tr><tr><td>テール溶解バッファー</td><td>Nacalai</td><td>06169-95</td><td>セクション 5.5.</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Nacalai</td><td>32777-15</td><td>セクション2.2と他の</td></tr><tr><td>場所V6.5 ESC</td> <td>-</td><td></td> <td>B6J-129 F1ひずみ</td></tr><tr><td>X線照射装置</td><td>日立</td><td>MBR-1618R-BE</td><td>セクション2.6</td></tr>から開発されたESC。</tbody></table>

crispr/cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

CRISPR/Cas9システムは、受精接合子を用いた直接ゲノム編集により、遺伝子改変マウスの開発を可能にしました。しかし、小さなインデル変異を誘導して遺伝子ノックアウトマウスを開発する効率は十分ですが、大きなサイズのDNAノックイン(KI)を作るための胚ゲノム編集の効率はまだ低いです。したがって、胚における直接KI法とは対照的に、胚性幹細胞(ESC)を用いた遺伝子ターゲティングとそれに続く胚注入によるキメラマウスの開発には、依然としていくつかの利点がある(例えば、 インビトロでのハイスループットターゲティング、多対立遺伝子操作、 およびCre および flox 遺伝子操作を短期間で行うことができる)。さらに、BALB/cなどの in vitroで扱いにくい胚を持つ株もESCターゲティングに使用できます。このプロトコルは、CRISPR/Cas9を介したゲノム編集とそれに続くキメラマウスの作製を適用して遺伝子操作マウスモデルを開発することにより、ESCにおける大型DNA(数kb)KIの最適化された方法を記述します。

我々は、ESCの特定の遺伝子を標的とし、続いてキメラ産生を行い、以前の原稿11に従って遺伝子操作マウス産生を開発しました。ESCジェノタイピング(セクション4に記載)は、プライマーを用いたPCRによって日常的に行われる。プライマーは、相同性アームの外側のゲノム配列およびKI DNA断片中の特定の配列に基づいて設計されています(図2A)。その場合、野生型対立遺伝子は増幅されませんが、特定のサイズのPCRアンプリコンは、標的外因性DNAが標的遺伝子座でKIである場合にのみ検出されます。代表的なジェノタイピングPCR結果を 図2Bに示す。この場合、22クローン中9クローン(40.9%)がKI特異的バンドを示した。 図2に示す結果を含む3つの代表的なターゲティング結果を 表1に示す。これらの結果は、ここに示す方法が、薬物選択なしで遺伝子KIに対して効率的かつ再現性があることを示しています。
ESCをインジェクションピペットでピックアップし、圧電プラスを使用して透明帯に穴を開け、ESCを胚細胞間で放出します(図3)。技術的には、8細胞または桑実胚にESCを注入するこのプロトコルは、多くのマウス施設で一般的に使用されている胚盤胞へのESC注射のプロトコルに似ています。代表的なキメラマウスを 図4に示す。キメラの毛色評価には、ICR株の胚(アルビノ、白髪)をB6またはB6-129 F1 ESCのレシピエントとして使用し、B6胚をBALB/c ESCのレシピエントとして使用しました(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig01.jpg"> 図1:ESCゲノムの特定の遺伝子座へのCRISPR/Cas9リボ核タンパク質(RNP)を介した環状プラスミド組み込みの概略図。 エレクトロポレーションは、環状プラスミドをターゲティングベクターとしてCas9-RNPのESCに導入します。略語:GOI =目的の遺伝子、HA =相同性アーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig02.jpg"> 図2:標的ESCクローンのKIスクリーニングのためのゲノムPCR分析 。 (A)KI特異的PCRプライマーは、相同性アームの外側(順方向)およびKI DNA断片の特異的配列(逆方向)のゲノム配列上に設計される。(B)代表的なジェノタイピングPCR結果。野生型ゲノムを陰性対照として用いた。略語:GOI =目的の遺伝子、HA =相同性アーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig03.jpg"> 図3:8細胞期胚注入の代表的な画像 。 (A)マイクロインジェクションの場合、ESCの3つのダブレット(6つのセル、矢じり)がピックアップされます。(B)圧電パルスで透明帯に穴を開け、各割球の間にESCを排出します。表示されているスケールバーは50μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig04.jpg"> 図4:キメラマウスの代表的な画像。 (A,B) C57BL/6Nに由来するESC (JM8.A3、アグーチヘア;A)またはB6-129 F1(アグーチヘア;B)ICR(アルビノ、白髪)胚に注入し、続いて胚を母代理母に移す。(C)BALB/c(アルビノ、白髪)由来のESCをC57BL/6J(黒毛)胚に注入し、母代理母に移植する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プロジェクト ID</td>
			<td>コロモソーム</td>
			<td>5'HAの長さ(bp)</td>
			<td>3'HAの長さ(bp)</td>
			<td>チップサイズ (bp)</td>
			<td>分析されたクローンの数</td>
			<td>KIクローンの数</td>
			<td>効率(%)</td>
			<td>備考</td>
		</tr><tr><td>R26-CC*</td>
			<td>Chr6</td>
			<td>965</td>
			<td>1006</td>
			<td>5321</td>
			<td>23</td>
			<td>2</td>
			<td>8.7%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>R4-03*</td>
			<td>Chr8</td>
			<td>1000</td>
			<td>997</td>
			<td>3070</td>
			<td>22</td>
			<td>6</td>
			<td>27.3%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>P4-01※</td>
			<td>Chr15</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
			<td>2569</td>
			<td>22</td>
			<td>9</td>
			<td>40.9%</td>
			<td>図2に示す</td>
		</tr></tbody></table>表1:ESCの3つの独立したゲノム遺伝子座におけるKI効率。 *これらのプロジェクトは今のところ公開されていません。これらの遺伝子の名前は、将来、独立した原稿で開示される予定です。

ここでは、胚性幹細胞を用いた遺伝子改変マウスモデル、特に大型DNAノックイン(KI)の開発のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して調整されているため、従来の相同組換えを介した直鎖状DNAターゲティング法と比較して、KI効率が大幅に向上します。

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

遺伝子改変マウスを作製し、その表現型を解析することで、生体内で特定の遺伝子機能を詳細に理解することができます。遺伝子改変動物モデルを用いて、数多くの重要な知見が明らかにされている。ここで説明する方法は、長いDNAが薬物選択なしで許容可能な効率で幹細胞を移植することを可能にする。この手法は、基礎生命科学だけでなく、医学や動物科学などの応用科学にも実装されます。手順のデモンストレーションは、助教の江森千尋先生と、私の研究室の小澤学准教授です。マウス胚性線維芽細胞を調製した後、原稿に記載されているようにゼラチンコート細胞培養皿を調製し、湿潤インキュベーター内で2時間インキュベートする。ゼラチン溶液を取り出し、PBSで皿を2回洗浄し、使用するまで室温で保存します。有糸分裂的に不活性化された凍結MEFストックを、摂氏37度で1分間焼き戻した水浴を使用して解凍します。ESCシードの1日前に、ゼラチンでコーティングされた60ミリメートルの皿にMEFを置きます。前に示したように冷凍ESCストックチューブを解凍し、事前にシードされたMEFを含む60ミリメートルの皿に10〜5番目のESCを1回置きます。次に、4ミリリットルのESC培養培地を追加し、ESCが50〜70%コンフルエンシーに達するまでディッシュをインキュベートします。培養したESCを4ミリリットルのPBSで洗浄した後、800マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液で摂氏37度で5分間消化します。トリプシンが1ミリリットルのESCMで不活性化されたら、1ミリリットルの新鮮なESCMを細胞に加え、培地をチューブに移し、280Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞を1ミリリットルの新鮮なESCMに再懸濁した後、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを用いて細胞濃度を計数する。10〜5番目のESCを新しい1.5ミリリットルのチューブに1回移し、遠心分離によってPBSで3回洗浄した後、ESCペレットを12マイクロリットルのCas9 RNP DNA混合物に再懸濁し、泡立ちを避けるために穏やかなピペッティングでよく混合します。次に、懸濁したESCをエレクトロポレーションに提供します。次に、有糸分裂不活化MEFを含む4ミリリットルのECSMを含む60ミリメートルディッシュでエレクトロポレーションされたESCを培養し、培地を毎日交換し続けます。エレクトロポレーションの3〜5日後に、ESCを4ミリリットルのPBSで洗浄し、800マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTAで消化し、湿度の高いインキュベーターで培養します。その後、2ミリリットルのESCMを加えてトリプシン消化を停止します。細胞混合物がペレット化されたら、ペレットを1ミリリットルの新鮮なESCMに再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞濃度をカウントします。ESCMおよびフィーダーMEFを含むディッシュ10個あたり60ミリメートルディッシュにつき10個目にESCを継代する。コロニーが回復するまで、必ず培地を交換してください。最初の継代から5〜7日後、ESCMをESC培養皿から吸引したら、4ミリリットルのPBSを追加します。20マイクロリットルのピペットを使用して、実体顕微鏡下で5マイクロリットルのPBSを含む単一のESCコロニーをピックアップします。個々のコロニーを、15マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液を含む丸底96ウェルプレートのウェルに入れます。96ウェルプレートをインキュベートした後、80マイクロリットルのESCMを添加し、ピペッティングによってESCコロニーを単一細胞に解離させることで、トリプシン消化を停止します。PCRジェノタイピングでは、40マイクロリットルのESC懸濁液を、ウェルあたり50マイクロリットルのESCMを含むゼラチンコーティングされたフィーダーフリーの96ウェルプレートに移します。凍結ESCストックを作るには、残りの60マイクロリットルのESC懸濁液を、500マイクロリットルのESCMとフィーダーMEFを含むゼラチンコーティングされた24ウェルプレートのウェルに移します。24ウェルプレートで培養した個々のESCクローンを60〜80%のコンフルエンシーに達するまでストックし、前述のようにトリプシン処理によって個々のESCクローンを回収します。遠心分離により細胞ペレットを得た後、500マイクロリットルの細胞凍結培地に再懸濁し、マイナス80°Cで細胞を凍結させた。PCRジェノタイピングでは、前述のようにESCクローンを培養し、吸引によって各ウェルからESCMを除去してから、100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。PBSを吸引した後、プロテイナーゼKを含む溶解バッファー100マイクロリットルを加えてよく混合します。次に、ESCライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏65度のヒートチャンバーに少なくとも1時間保管します。ゲノムDNAを20マイクロリットルのDNaseフリー水に溶解したら、分光光度計を使用してDNAの純度と濃度を決定します。遺伝子座特異的プライマーセットを使用してゲノムPCRを実行して標的領域を増幅した後、配列を確認し、目的のノックイン配列を持つESCクローンを選択します。ホルモン処理された雌とICR雄を交配させ、卵管を採取した後、採取した卵管をFHMドロップに入れ、眼底に挿入されたフラッシング針を用いてFHMで卵管を洗い流すことで、2細胞または4細胞期の胚を回収します。収集した胚をマウスピペットを使用していくつかの新鮮なFHMドロップに移して洗浄します。50マイクロリットルのKSOMドロップで胚を、8細胞または桑実胚期に達するまで1日間、鉱油で覆われた35ミリメートルの細胞培養皿で培養します。胚を保持するためのガラスピペットを準備し、プーラーとマイクロフォージを使用してESC注射を行います。マイクロインジェクターに接続されたキャピラリーホルダーにFHMを含む保持ピペットを組み込んだ後、マイクロマニピュレーターの左側に設置します。インジェクションピペットを別のマイクロインジェクターに接続し、右側に設置します。2つのピペットを顕微鏡の視野にまっすぐ合わせます。5マイクロリットルの12%ポリビニルピロリドンと5マイクロリットルのFHMの滴を60ミリメートルの皿の同じ蓋に並べて作ります。滴を鉱油で覆います。胚を5マイクロリットルのFHMドロップに移し、1〜5マイクロリットルのESC懸濁液を胚含有FHMドロップに加える。インジェクションピペットをポリビニルピロリドンで洗浄したら、インジェクションピペットを胚とESCを含むドロップに移動します。インジェクションピペットで細胞分裂を終えたばかりの3つのESCダブレットを選びます。保持ピペットを使用して、吸引による締固めが完了した8細胞または桑実胚を保持し、圧電パルスで透明帯に穴を開けます。透明帯内の6細胞ESCを排出し、ピペットを胚から引き出します。ESCを注入した胚をマウスピペットを使用して数個のKSOMドロップで穏やかに洗浄し、前述のように、胚が胚盤胞段階に発達するまで、鉱油で覆われた新しい50マイクロリットルのKSOMドロップでインキュベートします。ノックインターゲットに特異的なサイズのPCRアンプリコンが得られ、22クローン中9クローンがノックイン特異的バンドを示した。これらの結果は、薬物選択なしで遺伝子ノックインに対して効率的かつ再現性があります。ESCコロニーの最適なサイズを拾うことは、この手順にとって非常に重要です。大きすぎたり小さすぎたりするコロニーの選択は避けてください。接合子を用いたCRISPR Cas9を介した直接ゲノム編集は、単純な遺伝子ノックアウトマウスの作製に適用可能である。このCRISPR Cas9を介したESC遺伝子ターゲティングプロトコルは、ライフサイエンスにおける将来の解析のために、さまざまな遺伝子改変マウスの作製を容易にします。

crisprcas9-mediated-highly-efficient-gene-targeting-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。...

アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) 法の効率は、ドナーの女性から接合子を採取し、偽妊娠中の女性に移植する必要がある従来のマイクロインジェクションに匹敵します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9 誘発変異を染色体 6 上の ROSA26...

ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

学ぶCRISPR/Cas9を用いた胚性幹細胞での高効率遺伝子ターゲティング法。マウスモデル開発において薬剤選択不要で大規模DNAノックインを実現し、基礎生命科学から応用医学研究まで幅広く貢献する革新的プロトコルです。

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

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