Name: ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡法。in vivoでT細胞の腫瘍ホーミング動態と持続性を非侵襲的にモニタリングし、抗腫瘍効果を評価する技術です。

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著者らは、この記事の代表的な結果のセクションで説明されている実験で使用されたルシフェラーゼ構築物を共有してくれたウラジミール・ポノマレフ博士に感謝したいと思います。

以下の手順は、メモリアルスローンケタリングの施設動物管理および使用委員会によって評価および承認されています。
1. 293T細胞へのルシフェラーゼのトランスフェクションとウイルス上清の回収
<ol><li>293T細胞の培養<ol><li>それぞれ1リットルのDMEMに以下を加えて培地を調製します:110 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、11 mLのペニシリン-ストレプトマイシン。</li>
		<li>5 x 106 293T細胞を解凍し、上記のように調製した培地と共にT175フラスコに移します。</li>
		<li>293T細胞を3日ごとに1:10で6日間分割します。細胞が90%を超えてコンフルエントにならないようにしてください。</li>
	</ol></li>
	<li>293T細胞のトランスフェクション 注:以下の試薬量は、293T細胞の1つのT175フラスコをトランスフェクトするために計算されます。より多くのフラスコを形質導入する場合は、それに応じて調整してください。.<ol><li>ピペットを使用して、1.5 mLの培地を2本の50 mLチューブのそれぞれに移します。1本のチューブに、VSV-Gプラスミド10 μg、Gag/pol20 μg、カブトムシレッドTDトマト(CBR-TDR)ルシフェラーゼプラスミド20 μgを加えて混合します。もう一方のチューブに、100 μLのDNA インビトロ トランスフェクション試薬を加えて混合します。両方のチューブを室温(RT)で5分間インキュベートします。 注:この原稿に記載されているすべてのプラスミドは、ウラジミール・ポノマレフ博士によって提供されました。</li>
		<li>DNA in vitro トランスフェクション試薬を含む培地を、DNAプラスミドを含むチューブに滴下し(約30秒以上)、ピペットで穏やかに混合します。RTで20分間インキュベートします。</li>
		<li>この20分間のインキュベーション中に、5〜10 mLの0.05%トリプシンを添加して293T細胞を剥離します。細胞が剥離したら、10 mLの培地を加え、800 x g で5分間遠心分離します。細胞を1.5 mLの培地に再懸濁します。</li>
		<li>DNA in vitro トランスフェクション試薬と DNA プラスミドを含む培地を 293T 細胞に加え、37°C で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>T175フラスコに移し、18 mLの培地を加えます。37°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>翌日、細胞を剥離せずにガラスピペットで培地を注意深く吸引します。18 mLの新しい培地と交換してください。インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>ウイルス上清の採取<ol><li>氷の上に置いたピペットを使用してウイルス上清を除去します。800 x g で5分間遠心分離し、細胞と破片をペレット化します。 注:細胞ペレットが大きい場合、上清を除去したときに細胞がフラスコから破壊された可能性があります。これらの細胞は、新鮮な培地と共に新しいフラスコに再度プレーティングすることができる。</li>
		<li>0.22 μmフィルターを用いてウイルス上清をろ過します。</li>
		<li>ウイルス上清をすぐに使用してください。氷上または4°Cで最大24時間保管するか、-80°Cで凍結して長期保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. ルシフェラーゼによる活性化ヒトT細胞の増殖と形質導入
<ol><li>インビトロでのヒトT細胞の活性化
	<ol><li>滅菌した15 mLチューブに0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)と2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10 mLを加え、ビーズ(T細胞2個あたりビーズ1個)を加え、マグネットラックに2分間入れ、PBSを吸引してビーズを洗浄します。</li>
		<li>ステップ1.1.1で説明した培地を調製し、IL-2を最終濃度30 IU/mLまで添加し、洗浄ビーズを添加します。活性化するT細胞200万個ごとに2.5 mLの培地を作ります。</li>
		<li>血球計算盤とトリパンブルー染色を使用してT細胞(新たに精製または以前に精製、凍結、解凍、および洗浄)をカウントします。ステップ2.1.2で準備した培地にT細胞を加え、チューブを静かに反転させて混合します。T細胞は、細胞の供給源と一般的な健康状態に応じて、少なくとも20倍に拡大します。マウスの治療に必要な数を計算し、20で割ることにより、活性化するT細胞の数を決定します。ここでは、マウスあたり20 x 106個のT細胞を予備実験に基づいて使用した。</li>
		<li>200万個のT細胞、ビーズ、およびIL-2を含む培地2.5 mLを24ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレートします。加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで培養する。</li>
		<li>T細胞を次の3日間毎日20倍の顕微鏡で調べて、ルシフェラーゼで形質導入する時期を決定します。細胞が凝集して培地を使い果たし、赤/ピンクから淡いオレンジに変わると、細胞は準備が整います。</li>
	</ol></li>
	<li>レトロネクチンプレートの調製 注:レトロネクチンは、遺伝子導入15を増強するため、形質導入に使用されるプレートをコーティングするために使用されます。<ol><li>PBS中の20 μg/mLレトロネクチン2 mLを未処理の6ウェルプレートのウェルに加えます。RTで2時間、または37°Cで1時間インキュベートします。 200万個のT細胞が形質導入されるごとに1つのレトロネクチンコーティングウェルが必要です。</li>
		<li>プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引します。</li>
		<li>6ウェルプレートのウェルあたり3 mLのPBS(滅菌ろ過済み)中の2%BSAを追加します。RTで30分間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>スピノキュレーション<ol><li>プレートの底を傷つけずにBSAを吸引します。</li>
		<li>ウェルあたり3 mLのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを4°Cで一晩覆ったままにします。</li>
		<li>ウェルあたり2 mLのCBR-TDRルシフェラーゼウイルス上清(ステップ1.3で収集)を追加します。</li>
		<li>1,240 x g で 32 °C で 90 分間遠心分離します。</li>
	</ol></li>
	<li>伝達<ol><li>T細胞を数えます。</li>
		<li>プレートの底を傷つけずにウイルス上清を吸引します。</li>
		<li>30 IU/mLのヒトIL-2を含む6 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にウェルあたり200万個のT細胞をプレートします。</li>
		<li>T細胞を毎日調べます。T細胞は、コンフルエントに近いとき、通常は2日後に増殖する準備ができています。</li>
		<li>細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞を静かに洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9 mLの培地を加えて、フラスコあたり合計15 mLの培地を加えます。</li>
		<li>翌日、さらに15 mLの培地を追加します。細胞は、この培地添加の翌日にマウスに注射する準備ができているはずです。フローサイトメトリー(ルシフェラーゼコンストラクトには、PEチャネルに見えるTDトマト蛍光色素が含まれています)16を実行して、形質導入が成功したことを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 免疫不全マウスにおけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の生着
<ol><li>注射用のT細胞を準備してカウントします。<ol><li>フラスコからT細胞を取り出し、カウントします。細胞は、通常、活性化後7日目までに、20倍〜30倍に拡大したときに注入する準備ができています。</li>
		<li>T細胞を800 x g で5分間遠心分離します。2 mLの培地に再懸濁し、マグネットラックを使用してビーズを取り外します。</li>
		<li>T細胞を二重特異性抗体とは別に注入する実験では、T細胞をカウントし、最終濃度が培地100 μLあたり2,000万個のT細胞になるように再懸濁します。手順 3.2 に進みます。 ex vivo 武装T細胞(EAT)を使用した実験の場合は、ステップ3.1.4に進みます。</li>
		<li>ex vivoで武装したT細胞を用いた実験では、T細胞を数え、マウスあたり2,000万個の細胞を使用して、グループごとに個別の1.5 mLチューブに分離します。例えば、それぞれ5匹のマウスからなる3つのグループがある場合、それぞれ1億個のT細胞を含む3つの1.5mLチューブを用意する。</li>
		<li>1.5 mLチューブを800 x g で5分間遠心分離します。T細胞ペレットを乱さずに培地を慎重に取り出します。二重特異性抗体を含む50 μL以下の培地に再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。 注:この研究で実施された実験の目的のために、実験室で生成された独自のIgG-[L]-scFv T細胞関与二重特異性抗体を使用しました。T細胞アーミングには、20 x 106 T細胞あたり5 μgの抗体を使用します。市販の二重特異性抗体も使用することができる。</li>
		<li>各チューブに1,450 μLの培地を加えて、余分な抗体を洗い流します。800 x g で5分間遠心分離し、培地を注意深く吸引し、100 μL培地あたり2,000万個の武装T細胞の濃度で再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスへの注射と生着<ol><li>1 L / minの酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバーでマウスを麻酔します。.マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔される。 メモ: 手順全体を通して熱サポートを提供します。</li>
		<li>26G針を用いて、1匹のマウスあたり眼窩後方向に100μLの培地に2000万個のT細胞を注入する。</li>
		<li>1,000 U組換えIL-2を皮下投与して、 in vivoでのT細胞の生存をサポートします。</li>
		<li>二重特異性抗体を眼窩後(T細胞注射に使用しない眼内)または腹腔内に投与します。マウスが麻酔から回復し、ケージに戻るのを待ちます。 注:ここでも、ラボで生成された独自の抗体が使用されましたが、代わりに市販の抗体を使用することもできます。ここでの実験では、1用量あたりマウスあたり0.3〜10μgの抗体を投与しました。抗体を週に2回、3〜4週間投与した。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ルシフェラーゼ形質導入T細胞を生着させたマウスの in vivo イメージング
注:このステップは、イメージングの日に実行されるべきであり、必ずしもT細胞および/または抗体がマウスに投与されるのと同じ日ではない。通常、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の投与から24時間後にイメージングを行います。
<ol><li>D-ルシフェリンの調製<ol><li>1 gのD-ルシフェリンを33.3 mLの滅菌PBS(最終濃度:30 mg / mL)に溶解します。</li>
		<li>溶解したD-ルシフェリンを33 x 1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、チューブを-20°Cに保ちます。</li>
		<li>イメージング当日に、イメージングする動物の数に対して30 mg / mLのD-ルシフェリンの十分なアリコートを解凍します。1本のチューブで10匹の動物に十分です。 注意: 使用後、残りのD-ルシフェリンを再凍結してください。D-ルシフェリンは、少なくとも5回の凍結/解凍サイクルで安定しています。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスへのD-ルシフェリンの投与 注:D-ルシフェリンをマウスに投与する前に、イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化してください。カメラの冷却には数分かかる場合があり、これはマウスにD-ルシフェリンを注射する前に行い、基質の投与後5分でイメージングが確実に行えるようにする必要があります。<ol><li>1 L / minの酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバー内で最大5匹のマウスに麻酔をかけます。.マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔される。</li>
		<li>マウスが完全に麻酔されたら、26 G針による眼窩後注射により、マウスあたり100 mg / mLの30 mg / mL D-ルシフェリン(マウスあたり3 mg)を投与します。.D-ルシフェリンを次のグループに投与する前に、このグループのマウスを画像化します。前のグループが画像化されている間に麻酔されるイソフルランチャンバーにマウスの次のグループを配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>ルシフェラーゼ形質導入T細胞のイメージング<ol><li>麻酔したマウスをイメージャーの遮光チャンバーに移動し、3%イソフルランを0.5 L/minで投与し続けます。異種移植片を支える側面がカメラに向かって上を向くように、マウスを横に置きます。マウスを仰臥位にして別の一連の画像を撮影し、肺におけるT細胞の存在を評価します。</li>
		<li>画像取り込みコントロールパネルを使用して、[発光、写真、オーバーレイ]を選択します。露出時間を自動、ビニングを中、F/停止時間を1に設定します。画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露出時間と一致するように露出時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。ピクセル飽和なしで最も明るい信号を達成するための最適な露光時間を決定するために、複数の露光時間で画像をキャプチャすることが有用な場合があります。</li>
		<li>マウスをイソフルランから取り出し、ケージに戻り、目覚めて歩行可能になるまで観察します。</li>
		<li>すべてのグループがイメージ化されるまで、手順4.2.1の手順を繰り返します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gökbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50(2018).</li>
<li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-%2FCD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li>
<li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li>
<li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005(2020).</li>
<li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-%5BL%5D-scFv+T+cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315(2020).</li>
<li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li>
<li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172(2020).</li>
<li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33%2Fanti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li>
<li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114(2021).</li>
<li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626(2020).</li>
<li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li>
<li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509(2021).</li>
<li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222(2021).</li>
<li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142(2021).</li>
<li>Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li>
<li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li>
<li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors%3A+Translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li>
</ol>

NKCは、Y-mAbs Therapeuticsから商業研究助成金を受け取ったと報告しています。NKCは、MSKがY-mAbs Therapeutics、Biotec Pharmacon/Lallemand、Abpro-labsにライセンス供与した発行済み特許の発明者および所有者です。MSKとNKCはY-mAbsに金銭的利害関係を有しています。NKCは、ユーレカセラピューティクスからストックオプションを受け取ったと報告しています。HFGおよびMECには関連する開示はありません。

T-BsAbブリナツモマブはCD19陽性血液悪性腫瘍に対して承認されていますが、固形腫瘍へのT-BsAbsの実装の成功ははるかに困難であることが証明されています。上皮細胞接着分子(EPCAM)に対するT-BsAbであるカツマキソマブは、卵巣がん患者の悪性腹水の治療薬として承認されましたが、その後、商業上の理由で薬の生産が中止されました19。固形腫瘍に対して承認された他のT-BsAbsはなく、このタイプの治療に関連する課題を強調しています。サイトカイン放出症候群(CRS)による毒性は一般的な問題ですが、これはステロイドとサイトカイン阻害剤で管理できます。毒性に加えて、固形腫瘍に対するT-BsAbsの試験では有効性の欠如が一般的です。腫瘍におけるT細胞輸送と持続の誘導は、おそらくTME14のさまざまな免疫抑制因子のために困難であることが証明されています。しかし、前臨床的にさえ、 in vitro で良好に機能するT-BsAbがin vivoで腫瘍を効果的に治療できない理由は不明であることが多い。
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T細胞関与二重特異性抗体(T-BsAbs)は、1つの結合アームを介してT細胞を関与させ、別の結合アームを介して腫瘍抗原を関与させることにより、ポリクローナルT細胞に人工的な特異性を提供するために使用される操作された抗体です。この技術は血液がん(CD19を標的とするブリナツモマブ1)への適用に成功しており、さまざまな固形腫瘍に対しても多数のT-BsAbが前臨床および臨床開発中です2。T-BsAbsは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)非依存的にポリクローナルT細胞に作用するため、ヒト白血球抗原(HLA)を下方制御する腫瘍でさえ、このタイプの治療を受けやすいのです3,4。T-BsAbsは数十の異なるフォーマットで開発されており、T細胞と腫瘍結合アームの原子価と空間配置、ドメイン間距離、および半減期に影響を与え、存在する場合はエフェクター機能を誘導できるFcドメインの包含に違いがあります5。私たちの研究室での以前の研究では、これらの要因がT-BsAbsの抗腫瘍効果に大きく影響し、効力に最大1,000倍の違いがあることが示されています6。この研究を通じて、IgG-[L]-scFvフォーマットがT-BsAbの理想的なプラットフォームであることを特定し(T-BsAbフォーマットの詳細については代表的な結果のセクションを参照)、GD2(神経芽細胞腫)、HER2(乳がんおよび骨肉腫)、GPA33(結腸直腸がん)、STEAP1(ユーイング肉腫)、CD19(B細胞悪性腫瘍)、CD33(B細胞悪性腫瘍)などの標的に適用しました7。 8,9,10,11,12,13。
固形腫瘍にT-BsAb療法を成功裏に実施するための主要な課題の1つは、免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)を克服して腫瘍へのT細胞輸送を促進することです14。上記のT-BsAbの有効性に影響を与える因子は、T-BsAbsが腫瘍へのT細胞ホーミングを効果的に誘導する能力に大きな影響を与えますが、この効果を in vivo システムでリアルタイムで評価することは困難です。この原稿は、治療中の実験的免疫不全マウスモデルにおける様々な組織へのT細胞輸送を評価するためのT-BsAbsの前臨床試験におけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の使用の詳細な説明を提供する。この方法の全体的な目標は、治療中に動物を犠牲にすることなく、腫瘍および他の組織におけるT細胞浸潤を評価する手段、ならびにT細胞ホーミング動態および持続性に関するリアルタイムの洞察を提供することである。細胞免疫療法に焦点を当てる研究者の数が増えているため、前臨床動物モデルで in vivo でT細胞を追跡する能力は非常に重要です。私たちは、ルシフェラーゼ形質導入T細胞を追跡するために採用した方法の徹底的で詳細な説明を提供し、他の研究者がこの技術を簡単に複製できるようにすることを目指しています。

<table><tbody><tr><td>293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 beads</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNA in vitro トランスフェクション試薬 (polyjet)</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>、Sigma、Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td>、</tr><tr><td>FBS</td>、<td>Gibco(ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Gag/polプラスミド</td>、<td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr>、<tr><td>GFPプラスミド</td><td>、Addgene</td><td></td> 11150-DNA.cg <td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin、</td><td>Gibco(ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2</td><td>R&D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>宝</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G プラス</td><td>ミド Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

ルシフェラーゼ形質導入ヒトt細胞を用いた二重特異性抗体誘導性t細胞輸送の追跡(英語)

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T細胞関与型二重特異性抗体(T-BsAbs)は、固形腫瘍の前臨床開発および臨床試験のさまざまな段階にあります。原子価、空間的配置、ドメイン間距離、およびFc変異などの要因は、一般に腫瘍へのT細胞のホーミングに影響を与えることによって、これらの治療法の抗腫瘍効果に影響を及ぼしますが、これは依然として大きな課題です。ここでは、活性化ヒトT細胞をルシフェラーゼで形質導入し、T-BsAb療法研究中のT細胞の in vivo 追跡を可能にする方法について説明します。T-BsAbsがT細胞を腫瘍にリダイレクトする能力は、治療中の複数の時点で定量的に評価できるため、研究者はT-BsAbsの抗腫瘍効果やその他の介入を腫瘍におけるT細胞の持続性と相関させることができます。この方法は、T細胞浸潤を組織学的に評価するために治療中に動物を犠牲にする必要性を軽減し、治療中および治療後のT細胞輸送の動態を決定するために複数の時点で繰り返すことができます。

ステップ4.3で説明したように、マウスは、異なる組織におけるT細胞の存在を評価するために、画像化中に異なる位置に配向され得る。仰臥位は、注射後の早い時点で一般的である肺のT細胞の評価を可能にする。皮下異種移植片を上に向けた横方向の位置配置は、腫瘍へのT細胞輸送を最もよく評価するために使用されます。雌の C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTacマウスを、この原稿に記載されているすべての実験に使用しました。図1は、GD2陽性異種移植片を有するマウスを、GD2 BsAbでex vivoで武装したルシフェラーゼ形質導入T細胞またはルシフェラーゼ形質導入T細胞とGD2 BsAbを別々に注射して処理した実験の画像を示す17。図1Aは、武装T細胞が非武装T細胞よりも早く腫瘍に輸送され(図1B)、2日早く肺を離れることを...

ここでは、抗腫瘍効果とT細胞関与二重特異性抗体のメカニズムを評価する研究において、腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の in vivo 追跡を容易にするために、ルシフェラーゼでヒトT細胞を形質導入する方法について説明します。

ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

この方法により、ユーザーはin vivoでT細胞を簡単に追跡して、ホーミングの速度論を評価し、T細胞の持続性を監視できます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学において犠牲を必要とせずに、同じ動物上の複数の時点で繰り返すことができることである。この手法は、他の種類の免疫細胞を追跡するためにも変更できます。293T細胞を培養するには、110ミリリットルの熱不活化ウシ胎児血清と11ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを添加して1リットルのDMEMを調製します。6番目の293T細胞に10回5回解凍し、DMEMを含むT175フラスコに移します。細胞が90%以上コンフルエントになる前に、6日間、3日ごとに細胞を1〜10に分割します。トランスフェクションの場合は、ピペットを使用して1.5ミリリットルの培地を2本の50ミリリットルチューブに移します。1本のチューブに、10マイクログラムのVSVGプラスミド、20マイクログラムのギャグポール、および20マイクログラムのカブトムシレッドTDトマトまたはCBRTDRルシフェラーゼプラスミドを加えて混合します。100 マイクロリットルの DNA in vitro トランスフェクション試薬を別のチューブに添加して混合します。両方のチューブを室温で5分間インキュベートします。DNA in vitroトランスフェクション試薬を含む培地をDNAプラスミドを含むチューブに滴下し、ピペットで穏やかに混合します。室温で20分間インキュベートします。インキュベーション中に、5〜10ミリリットルの0.05%トリプシンを加えて293T細胞を剥離します。細胞が剥離したら、10ミリリットルの培地を加え、800 Gで5分間遠心分離します。細胞を1.5ミリリットルの培地に再懸濁する。DNA in vitroトランスフェクション試薬と DNA プラスミドを含む培地を 293T 細胞に加え、摂氏 37 度で 30 分間インキュベートします。インキュベーション後、懸濁液をT175フラスコに移します。18ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細胞を剥離せずにガラスピペットで培地を注意深く吸引し、18ミリリットルの新鮮な培地と交換します。繰り返しますが、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、氷上に置いたピペットを用いてウイルス上清を除去し、800Gで5分間遠心分離して細胞および破片をペレット化した。0.22ミクロンのフィルターを使用してウイルス上清をろ過し、すぐに氷の上に置きます。ヒトT細胞のin vitro活性化のために、0.1%ウシ血清アルブミンまたはBSAと2ミリモルEDTAを含む10ミリリットルのPBSを滅菌15ミリリットルのチューブに加えます。次に、ビーズを洗浄するには、ビーズをチューブに追加し、チューブを磁気ラックに置きます。2分後、PBSをチューブから取り出します。DMEMを調製した後、洗浄ビーズとインターロイキン-2またはIL-2を最終濃度30国際単位/ミリリットルになるまで加えます。ヘモサイトメーターとトリパンブルー染色剤を用いてT細胞を計数します。カウント後、必要な数のT細胞を培地に加え、チューブを静かに反転させて混合します。200万個のT細胞、ビーズ、およびIL-2を含む2.5ミリリットルの培地を24ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレートします。加湿した5%二酸化炭素中で摂氏37度で培養する。20倍の対物レンズでT細胞を3日間毎日調べて、ルシフェラーゼで形質導入するタイミングを決定します。次に、レトロネクチンプレートを作製し、PBS中のレトロネクチン1ミリリットル当たり20マイクログラムの2ミリリットルを未処理の6ウェルプレートのウェルに加え、室温で2時間インキュベートする。プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引し、6ウェルプレートにウェルあたりPBSで3ミリリットルの2%BSAを追加します。室温で30分間インキュベートします。次に、脊髄膜形成のために、BSAを吸引し、3ミリリットルのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを摂氏4度で一晩覆ったままにします。翌日、ウェルあたり2ミリリットルのCBRTDRルシフェラーゼウイルス上清を加え、1, 240 Gで32°Cで90分間遠心分離します。形質導入のために、T細胞を計数した後、ウイルス上清を吸引し、1ミリリットル当たり30国際単位のヒトIL-2を含む6ミリリットルのDMEM中にウェル当たり200万個のT細胞をプレートする。T細胞を2日間調べます。細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞を静かに洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9ミリリットルの培地を追加して、フラスコあたり合計15ミリリットルの容量にします。翌日、15ミリリットルの培地を加え、フローサイトメトリーを実施して形質導入が成功したことを確認します。マウスに麻酔をかけた後、26ゲージの針を用いて、眼窩後方向に100マイクロリットルの培地中に2000万個のT細胞を注入する。in vivoでのT細胞の生存をサポートするために、1, 000単位の組換えIL-2を皮下投与する。次いで二重特異性抗体を眼窩後または腹腔内に投与する。in vivoイメージングでは、麻酔をかけたマウスに26ゲージの針で眼窩後注射により、100マイクロリットルの3ミリグラムのD-ルシフェリンを投与します。画像をキャプチャするには、異種移植片を支える側面がカメラに向かって上を向くように、イメージャーの光密チャンバーにマウスを置きます。取り込みコントロールパネルを使用して、発光、写真、オーバーレイを選択します。露光時間をオート、ビニングを中、Fストップを1に設定して画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露出時間と一致するように露出時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。マウス仰臥位で別の画像を撮影して、肺におけるT細胞の存在を評価します。武装T細胞は非武装T細胞よりも早く腫瘍に輸送され、2日早く肺を離れました。経時的な腫瘍へのT細胞浸潤の定量は、生物発光によって測定され、腫瘍輪郭にわたって積分されたピクセルあたりの総フロックまたは放射輝度として表されました。T細胞輸送は、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の注射後28日間モニターすることができ、治療中のT細胞のホーミングと持続性を追跡することができます。DKOマウスにおけるHER2陽性ヒト乳癌患者由来異種移植片へのT細胞輸送が示されている。無サイレンシングFCによるHER2二重特異性抗体による治療は、対照された二重特異性抗体と比較して腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。対照的に、N297A変異のみを含むHER2二重特異性抗体による治療、またはK322A変異との併用は、腫瘍の成長を完全に停止させることができました。サイレンシング変異を有するグループの場合、T細胞発光シグナルは注射後3日目により高いピークに達し、対照二重特異性抗体および無消音HER2二重特異性抗体と比較してより高いレベルで持続した。神経芽細胞腫患者由来の異種移植片を有するマウスは、Ly6C陽性マクロファージの枯渇を示し、腫瘍へのT細胞ホーミングを有意に増加させ、腫瘍増殖の減少および生存期間の延長をもたらした。この効果は、骨肉腫患者由来の異種移植片でより顕著でした。腫瘍抗原STEAP1を標的とする二重特異性抗体の中で、IGGL SCFVフォーマットは、治療期間中持続したT細胞の初回投与後6日目に有意に多くのT細胞浸潤をもたらしました。このような観察は、インビトロ細胞毒性アッセイによって予測されなかった。in vivoでT細胞を追跡した後でも、ユーザーは免疫組織化学を実行して、T細胞が腫瘍または他の正常組織内のどこにあるかをより具体的に特定できます。

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Cancer Research

がん研究

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。...

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオは、マウスモデルで腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送を追跡する方法を示しています。ルシフェラーゼ形質導入エフェクターT細胞を、皮下腫瘍細胞異種移植片を有するマウスに注入する。次に、二重特異性抗体が導入され、T細胞と腫瘍細胞に結合します。T細胞の局在は、生物発光イメージングを使用して追跡され、シグナルの大きさは腫瘍へのT細胞浸潤の程度を示します。...

二重特異性抗体誘導性T細胞の腫瘍への輸送を追跡するためのin vivo技術

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。...

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

細胞沈降マニホールド/スライド装置を使用して、非接着性免疫細胞の放射状移動度をin...

ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

生存能力、機能、ラベリング安定性およびアポトーシスについて分析し、そして養子気道遅延型過敏症を有するマウスに移し、トランスジェニックマウスのT細胞受容体に結合する64のCu修飾モノクローナル抗体の調製後、T細胞は、in vivoで放射性標識されています陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）によって非侵襲的イメージングのための反応。...

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のCu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; PET / CTによる細胞輸送

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ここでは、製造とレトロ ウイルスの伝達と BALB/c マウス lymphodepleting の有無で確立された同系 A20 B 細胞リンパ腫に対する治療としての利用によってマウスの CD19 車 T...

同系マウス B 細胞リンパ腫モデル CD19 車 T 細胞の前臨床評価

このプロトコールは、臨床的に利用可能なプラットフォームを用いて 、インビボで...

[18F]テトラフルオロホウ酸陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影によるキメラ抗原受容体T細胞の動的イメージング

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。...

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

私たちは、トランスフォーミング受容体のレトロウイルス形質導入と、受容体媒介性臓器および微小環境特異的リンパ球のポジショニングを研究するための競合的ホーミングのための改善されたプロトコルを提示します。この方法は、免疫細胞の輸送メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、将来の基礎研究や治療研究への応用が期待されています。...

多様な組織微小環境におけるGPCR媒介T細胞局在の研究のための効率的なレトロウイルス形質導入と競合的ホーミング

学ぶルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡法。in vivoでT細胞の腫瘍ホーミング動態と持続性を非侵襲的にモニタリングし、抗腫瘍効果を評価する技術です。

ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

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