Name: マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶマウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイントの評価手法。ライブイメージングと免疫蛍光法を組み合わせた3つの技術で染色体分離エラーのメカニズムを解明し、不妊研究に貢献します。

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このプロジェクトの資金は、国立衛生研究所(R35GM136340からKS)によって提供されました。

これらのプロトコルで使用されたすべてのマウスは、ラトガース大学施設動物使用およびケア委員会(プロトコル201702497)および国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育および飼育されました。これらの規制機関は、動物実験を含むすべての実験手順を承認しました。本研究で使用した全てのマウスは、6〜8週齢のCF-1雌であった。
1. 実験準備
<ol><li>SAC評価を開始する前に、以前に発表された第12報告書に従ってマウス卵母細胞を採取してください。採取した卵母細胞を3つの均等なサイズのグループに分け、減数分裂の再開を避けるために、2.5 μMミルリノンを含むChatot、Ziomek、およびBavister(CZB)培養培地( 材料の表を参照)に保管します13。 注: CZB 組成: 81.6 mM NaCl;4.8 ミリリットル KCl;1.2 mM KH2PO4;1.2 mM MgSO4-7H 2O;0.27 mMピルビン酸;1.7 mM CaCl2;30.8 mM DL-乳酸;7 mMタウリン;0.1 mM EDTA;25 mM NaHCO3;ゲンタマイシン;および0.3%のBSA。</li>
	<li>前述のようにマイクロインジェクション用のcRNAを調製する12、14。マウス胚小胞卵母細胞からクローニングしたcDNAからマウスSecurin遺伝子を増幅し、続いてGfp配列15、16を含むpMDL2ベクターにサブクローニングする。<ol><li>セクリン-Gfp cRNAを調製するには、プラスミドをNde I消化で直鎖化します。T3 RNAポリメラーゼを使用し、cRNA16を精製することにより、in vitro転写を実行します。 注:cRNAは、使用するまで-80°Cで2〜3 μLのアリコートで保存してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2.ノコダゾール治療とライブイメージング
<ol><li>5 μMのノコダゾール(NOC)を含む培地(CZB)1 mL、5 μMのNOCと0.5 μMのリバーシン(NOC + REV)を含む1 mLの培地、および対照としてジメチルスルホキシド(DMSO)を含む1 mLの培地(1:2000)を準備します( 材料表を参照)。</li>
	<li>卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で37°C、5%CO2、湿度80%で予熱した96ウェルプレートを使用します。最初のウェルに、150 μLのコントロールDMSO処理を負荷します。2番目のウェルに、150 μLのNOC処理を負荷します。そして3番目のウェルに、150μLのNOC + REV処理を負荷します。必要になるまで、プレートを上記と同じ条件下でインキュベーターに保管してください。 注:96ウェルプレートでは、境界線の影が画像の品質を妨げるため、最初の行と最初の列の使用は避けてください。</li>
	<li>減数分裂成熟を開始するには、ミルリノンを除去します。30倍から64倍の倍率を使用して実体顕微鏡下で卵母細胞を観察しながら、DMSOを含む100 μLのミリノンフリー培養培地を6滴ずつ卵母細胞を順次移して培地からミリノンを洗い流し、手動または口操作のピペットを使用して96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。<ol><li>手または口で操作するピペットを使用して卵母細胞を拾い上げ、次の滴に送達して卵母細胞を数え、卵母細胞を失うことを防ぎます。卵母細胞は単一で、大きく(直径~80μm)、丸い細胞です。核は細胞の中心にボタンのように現れ、膜と透明帯が卵母細胞を囲みます。 注:卵母細胞を滴の間で移動させ、可能な限り少ない量の液体を移動します。これにより、培地からミルリノンを最適に除去することができます。卵母細胞が減数分裂を再開できない場合は、ミルリノンが効果的に除去されなかった可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>NOCおよびNOC + REV処理に対して同じプロセス(ステップ2.3)を繰り返します。</li>
	<li>37°C、5%CO2、湿度80%の条件下で制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。</li>
	<li>非対称の細胞質分裂を経る細胞を特定することにより、極体(PB)を押し出す卵母細胞の数を定量化します。その結果、卵の隣と共有透明帯内に小さな細胞(PB)ができます。イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します(ImageJ、 材料表を参照)。</li>
	<li>画像配列を画像解析ソフトウェアにインポートし、1つ以上の細胞が非対称の細胞質分裂を経験するまでフレームを進めます。全卵母細胞17のうちPBを押し出す卵母細胞の割合を算出する。</li>
</ol>3. 減数分裂成熟期のセクリン-gfp分解パターンのモニタリング
<ol><li>3 μLの セクリン-Gfp cRNAを19,283 x g で4°Cで30分間遠心分離(ステップ1.2)します 18. 注意: マイクロインジェクション中に針の詰まりを引き起こす可能性のある不純物の負荷を避けるために、上清を使用してください。</li>
	<li>以下の段階的な卵母細胞マイクロインジェクションは、参考文献12に広く記載されている。ステップ1.2で調製した100 ng/μLのSecurin-gfp cRNAを前期I-停止卵母細胞にマイクロインジェクションします。</li>
	<li>マイクロインジェクション後、卵母細胞をCO2 インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳させます。自動マルチチャンネル蛍光イメージングシステム( 材料表参照)で卵母細胞を観察して発現を確認し、GFPシグナルを表示します。</li>
	<li>ステップ2.2で説明したように、5 μMのノコダゾールの有無にかかわらず150 μLの培養培地、および0.5 μMのリバーシンを含む150 μLの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルにロードします。</li>
	<li>マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミリノンフリー培養培地で洗浄し、卵母細胞の1/3を各処理に移します。</li>
	<li>ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%のCO2 および80%の湿度で、プレートを37°Cのインキュベーターに保ちます。 注:倍率が30x〜64xの実体顕微鏡を使用して、減数分裂再開の特徴として核エンベロープの破壊を評価します。</li>
	<li>ステップ2.6に記載されるようにインキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞成熟の画像を記録する。明視野設定を使用して、ウェル内の卵母細胞を見つけます。488フィルターを使用してSecurin-gfpシグナルを検出し、細胞が過剰に露出しないように蛍光強度を調整します。<ol><li>イメージングシステムが自動化されている場合は、各ウェル内の卵母細胞の位置を保存します。Securin-gfpは細胞質に均等に分布しているため、卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。卵母細胞のグループを1枚の写真に収めるには、10倍などの低倍率の対物レンズを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>画像解析ソフトウェアを使用して、Securin-gfp破壊を定量化します。GFP チャネルの画像を開きます。時点 1 から開始します。好みの解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域(ROI)を生成します。<ol><li>同じROIを使用して、後で減算する背景領域を選択します。各ROIのGFPピクセル強度を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ3.8で生成された各卵母細胞のROIを使用して、すべての時点でGFP強度を測定します。 注意: 一部のソフトウェアプログラムでは、[分析]タブで測定機能を選択できます。<ol><li>次に、次の時間枠に進み、このプロセスを繰り返して、各時間枠におけるGFPの強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、ステップ3.8で選択したバックグラウンドでのROIの測定値を差し引きます。この分析により、各時点での各卵母細胞のSecurin-gfp強度の値が得られます。</li>
	</ol></li>
	<li>セクリン破壊のパターンから異なるパラメータを抽出する:(a)セクリン-gfp分解が始まった時間。これは、SAC サイレンシングがいつ開始されたかを示します。(b)セクリン-gfp最小シグナルの時間。これは、SACサイレンシングが閾値レベルを下回ったときに、高いAPC/C活性化と完全なSecurin-GFP分解を可能にすることを示します。(c) セクリン-gfp破壊率19.これは、SAC活性がAPC/C活性化およびSecurin-GFP分解の閾値レベルを下回る速さを示します。</li>
</ol>4. 減数分裂成熟期の免疫蛍光による動原体におけるMAD2の動員
注:卵母細胞の採取と成熟については、以前に発表されたレポート12を参照してください。
<ol><li>卵母細胞を3つのグループに分けます。卵母細胞の各グループを100 μL滴のミリノンフリー培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度80%)に3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期初期I期、後期前中期I期、中期I期に到達させます。 注意: 減数分裂成熟の定期的なタイミングに影響を与えるインキュベーターから同じ皿を数回取り出さないように、各時点を異なる皿に入れます。</li>
	<li>割り当てられた時点で、前述の9ウェルガラス皿を使用して、1x PHEMバッファー中の2%PFAの500 μL滴に卵母細胞を室温で20分間移し、卵母細胞を固定します20。次に、細胞を500 μLドロップのブロッキング溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3)を含むクリーンウェルに移します。 注:PHEM組成:60 mMパイプ;25 mM HEPES;10 mM EGTA;および2mMマグネシウムCl2。 注:この時点で停止し、免疫蛍光を完了するのに都合の良い時間まで、4°Cの9ウェルプレートのブロッキング溶液に卵母細胞を保存することができます。</li>
	<li>MAD2検出を継続するには、500 μL滴の透過処理溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3)を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートし、次いで細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートする。</li>
	<li>残りの免疫蛍光ステップでは、前述のようにくぼみのある96ウェルディッシュ蓋を使用します20。光への露出と蒸発を避けるために、加湿された暗いチャンバーを使用してください。卵母細胞を抗MAD2抗体(1:1000、ウサギ)および抗セントロメア抗体(ACA)(1:30、ヒト)を含む30 μL滴のブロッキング溶液に移し( 材料の表を参照)、室温で2時間インキュベートします。 注:96ウェルディッシュの蓋は、複数のタンパク質とグループを同時に処理するためのスペースを確保します。</li>
	<li>過剰な一次抗体を洗浄するには、細胞を0.5%トリトンを添加した1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、加湿チャンバーで10分間インキュベートします。この手順をさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>4回目の洗浄を行い、細胞を0.5%1xトリトンを含まない1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、10分間インキュベートします。</li>
	<li>抗ヒト-633(1:200)や抗ウサギ-568(1:200)などの二次抗体を含むブロッキング溶液30 μL滴に細胞を移し( 材料の表を参照)、室温で1時間インキュベートします。 注:蛍光色素の組み合わせは、顕微鏡レーザーまたはフィルターに基づいて選択してください。</li>
	<li>過剰な二次抗体を洗浄するには、手順4.5〜4.6を繰り返します。</li>
	<li>細胞を顕微鏡スライドにマウントするには、DAPI(0.1 mg/mL)を含む10 μL滴の封入培地に細胞を移します( 材料の表を参照)。カバーガラスの各角にワセリンの小さなドットを追加し、それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して分散させます。透明なマニキュアを使用して、カバーガラスをスライドにシールします。実装プロセスの詳細な説明については、参考文献20を参照してください。</li>
	<li>40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用した画像運動原体。ACAシグナルを使用して、染色体領域全体のイメージングを可能にするz範囲を決定します。 メモ: 一部のイメージングシステムでは、4.0 の光学ズームと 0.5 μm の z ステップサイズを使用できます。これらのパラメータはシステムによって異なる場合があり、最適化が必要になります。</li>
	<li>画像解析ソフトを用いて動原体におけるMAD2強度を解析します。Z スタックの最大投影を作成し、チャネルを分割します。</li>
	<li>まず、ACAチャネルを選択してACAチャネルを使用してマスクを作成し、すべての動原体信号を識別するしきい値を確立します。 編集 タブに移動し、選択を作成します。次に、この選択でROIを作成します。</li>
	<li>MAD2チャンネルを選択し、手順4.12で作成した選択範囲を取り込みます。MAD2信号によりよく適応するしきい値方式を選択します。強度を測定します。 注:対照処理で閾値法を選択し、異なる処理を分析するときは一定に保ちます。</li>
	<li>相対ピクセル強度の計算を行うには、各細胞の強度を実験中のWT卵母細胞の平均強度で割ります。</li>
</ol>

<ol><li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).</li>
<li>London, N., Biggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+the+spindle+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in the spindle checkpoint response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).</li>
<li>Kuhn, J., Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+kinetochores+count+attached+microtubules+in+a+sensitive+and+switch-like+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner.</a> Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-specific+differences+in+cell-cycle+control+create+an+innate+susceptibility+to+meiotic+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors.</a> Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).</li>
<li>Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+response+to+unaligned+chromosomes+in+mammalian+female+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).</li>
<li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).</li>
<li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li>
<li>Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+oocytes+to+assess+human+gene+function+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57442(2018).</li>
<li>Herbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologue+disjunction+in+mouse+oocytes+requires+proteolysis+of+securin+and+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1.</a> Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Solc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+requirements+of+PLK1+during+Mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation.</a> PLoS One. 10 (2), 0116783(2015).</li>
<li>Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+integrity+of+the+meiotic+spindle+assembly+checkpoint+in+females+requires+Aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B.</a> Aging Cell. 20 (11), 13489(2021).</li>
<li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li>
<li>Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age-dependent+APC%2FC-mediated+decrease+in+securin+causes+premature+sister+chromatid+separation+in+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II.</a> Nature Communications. 8 (1), 15346(2017).</li>
<li>Blengini, C. S., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+technique+to+detect+subcellular+structures+critical+to+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+I+arrest+upon+activation+of+the+Mad2-dependent+spindle+checkpoint+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes.</a> Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+human+aneuploidy%3A+where+we+have+been%2C+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Homer, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).</li>
<li>Blengini, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+A+is+essential+for+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes.</a> PLOS Genetics. 17 (4), 1009327(2021).</li>
<li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC%2FC+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li>
</ol>

著者は開示する矛盾はありません。

紡錘体アセンブリチェックポイントは、染色体分配エラーを防ぐために設計された細胞分裂中の重要な制御メカニズムです。これにより、セルは不適切なKT-MTアタッチメントを修正するのに十分な時間を確保できます。卵母細胞の減数分裂はエラーが発生しやすいプロセスであり、染色体の誤分離のほとんどは減数分裂I中に発生し、ヒトの早期流産と不妊の主な原因である異数性卵の生成につながります1,24。女性の減数分裂に誤りがある理由を解きほぐすために、いくつかの仮説がテストされています。考えられる理由の1つは、SACが体細胞よりも効率が低く、1つ以上のKTの誤付着による後期発症を可能にすることです9、10、25。したがって、卵母細胞におけるSACメカニズムの包括的な研究と主要な調節因子の特定は、倍数体卵を生成するプロセスを理解するために必要です。
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染色体分配の誤りから生じる異数性は、早期流産の主な原因であり、減数分裂の間違いと強く関連しています1。減数分裂は、DNA複製ステップを介さずに2ラウンドの細胞分裂で構成されるため、有糸分裂とは異なります。減数分裂Iでは、相同染色体は分離し、姉妹染色分体は一緒に残ります。卵母細胞では、このステップはエラーが発生しやすく、異数性卵の生成につながります2。
染色体分配エラーを防ぐために、ほとんどの細胞タイプは、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)と呼ばれる細胞周期を一時停止する監視メカニズムを活性化します。このメカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)の付着を感知し、染色体が双極性に配向すると張力が発生します3。接続されていない動原体は、SACのマスターレギュレーターであるMPS1の動原体3,4への採用から始まるSAC応答をトリガーします。MPS1は、他のSACコンポーネントのリクルートを開始し、有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)を形成するためのプラットフォームとして機能します。MCCは、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成され、細胞質に拡散し、アクチベーターCDC20を隔離することによりAPC/C活性化を阻害します。すべての動原体がMTに安定して結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、MCCがCDC20を分解して放出し、APC/C活性化が可能になります。活性APC / Cは、後期発症を引き起こす2つの重要なステップであるセクリンとサイクリンBを分解します5,6。体細胞では、SACは単一の未付着の動原体によって活性化され、細胞周期停止を誘導するのに十分であるため、厳格です6。しかしながら、卵母細胞減数分裂の間、SACはより寛容であり、卵母細胞は1つ以上の未付着の動原体6、7、8、9、10で後期Iに入ることができる。SACが卵母細胞においてより寛容である理由を理解することは、この分野で進行中の焦点分野です。SAC活性化またはSACサイレンシングに欠陥を引き起こすメカニズムは、染色体分配のエラーまたは長期の細胞周期停止および細胞死につながる可能性があります。したがって、卵母細胞のSAC完全性を維持するメカニズムを評価することは、健康な倍数体の卵を形成するプロセスを理解するために重要です。
このプロトコルは、チェックポイントのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞減数分裂におけるSAC完全性を包括的に評価する技術について説明しています。まず、SAC活性化誘導後のSAC応答の評価について説明する。この活性化は、MTs11を解重合する薬物であるノコダゾールを使用して、付着していない動原体を生成することによって達成されます。第二に、SACサイレンシングをモニタリングする方法は、卵母細胞成熟中のSecurin分解のダイナミクスを追跡することによって説明されています。最後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して、MCC成分の1つであるMAD2の動原体への動員を測定します。一緒に、これらのアッセイは、卵母細胞の減数分裂成熟中のSACの完全性を包括的に評価します。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズD1306</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ-Alexa-568</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA10042</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLオートイメージングシステム</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>ズ蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>EVOS Onstage Incubator</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Incubator Chamber</td></tr><tr><td>Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated</td><td>MatTek Corporation</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>goat-anti-human-Alexa-633</td><td>Life Technologies</td><td>A21091</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>Human anti-ACA</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234</td><td>Dilution 1/30</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 は 63&times;、1.40 NA 油浸対物レンズ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H20</td><td>Σ</td><td>M7774</td><td></td></tr><tr><td>ミルリノン</td><td>Σ</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4Σ</td><td></td> <td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Σ</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>Σ</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>パラホルマルギド (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 MAD2</td><td>バイオレジェンド</td><td>924601</td><td>希釈 1/1000; 以前はコーヴァンス #PRB-452C</td></tr><tr><td>リバーシン</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド</td><td>ベクター研究所</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

異数性は、ヒトの早期流産および妊娠不全を引き起こす主要な遺伝的異常である。異数性を引き起こす染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生しますが、卵母細胞の減数分裂がエラーを起こしやすい理由はまだ完全には理解されていません。細胞分裂中、細胞は紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)を活性化することにより、染色体分配のエラーを防ぎます。この制御メカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)付着の検出と、紡錘体繊維によって発生する張力の検出に依存しています。KTが結合解除されると、SACが活性化され、細胞周期の進行が妨げられます。SACは最初にMPS1キナーゼによって活性化され、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成される有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)の動員と形成を引き起こします。次に、MCCは細胞質に拡散し、後期促進複合体/サイクロソーム(APC / C)アクチベーターであるCDC20を隔離します。KTが微小管に付着し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、CDC20が放出され、APC/Cが活性化され、サイクリンBとセクリンの分解が引き起こされ、後期発症が起こります。体細胞と比較して、卵母細胞のSACは、KTが付着していないにもかかわらず細胞が後期を迎えることができるため、それほど効果的ではありません。 SACがより寛容である理由と、この寛容性が卵母細胞の染色体分配エラーの原因の1つであるかどうかを理解することは、さらに調査する必要があります。本プロトコルは、マウス卵母細胞におけるSAC完全性を包括的に評価するための3つの技術を記載する。これらの技術には、ノコダゾールを使用してMTを解重合してSAC応答を評価すること、セクリン破壊の速度論を追跡することによってSACサイレンシングを追跡すること、免疫蛍光によるKTへのMAD2の動員を評価することが含まれます。これらの技術を組み合わせることで、SACの完全性を完全に評価することにより、健康な卵子を生産するために必要なメカニズムを調査します。

ノコダゾール処理によるSAC応答性の評価 この実験の目的は、SACの活性化と強度を評価することです。ノコダゾールを使用して紡錘体微小管を解重合することにより、すべての動原体が付着しなくなり、SACを介した細胞周期停止を引き起こします。本画像化システムでは、DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンから放出されてから約14時間後に極性体を押し出した(図1、上パネル)。SAC活性化と一致して、ノコダゾール処理された卵母細胞は中期Iで停止し、極性体を押し出さなかった(図1、中央のパネル)。このアッセイがSAC活性の信頼できる指標であることを実証するために、MPS1阻害剤であるリバーシンを使用してSAC活性化を予防しました21。SACが活性化できない場合、卵母細胞はKT-MTアタッチメントがないにもかかわらず極性体を押し出しました(図1、下のパネル)。SACが弱体化した卵...

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

異数性は、人間の早期流産の主な遺伝的原因です。染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生します。したがって、卵母細胞の紡錘体アセンブリチェックポイントを評価することは、卵母細胞がエラーが発生しやすい理由を理解するために重要です。ここでは、ライブイメージングと免疫蛍光の組み合わせを使用してチェックポイントでのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞のSAC完全性を包括的に評価する3つの手法について説明します。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるセシリア・ブレンジーニ博士です。原稿に記載されているように、対照としてDMSOを含むノコダゾールおよびリバーシンを含む1ミリリットルの培養培地を調製し始める。卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で事前に温めた96ウェルプレートを使用します。そして、第1、第2および第3のウェルにそれぞれ150マイクロリットルのコントロールDMSO、ノコダゾールおよびノコダゾールプラスリバーシン処理をロードした。原稿に記載されている条件下でプレートをインキュベーター内に保ちながら。筋成熟を開始するには、DMSOを含む100マイクロリットルのミリノン遊離培養培地6滴を通して卵母細胞を順次移すことによってミリノンを除去します。そして、それらを96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。手または口内ピペットを用いて、実体顕微鏡下で卵母細胞を観察した。摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度80%の制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像をキャプチャします。卵の隣と共有透明帯内の小さな細胞で非対称サイトカインを通過する細胞を特定することにより、極体を押し出す卵母細胞の数を定量化した後。イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します。前期1の停止卵母細胞に、事前に調製したセクリン-gfp cRNAのマイクロリットルあたり100ナノグラムをマイクロインジェクションします。マイクロインジェクション後、卵母細胞を二酸化炭素インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳します。次に、5マイクロモルのノコダゾールの有無にかかわらず、150マイクロリットルの培養培地をロードします。0.5マイクロモルのリバーシンを含む150マイクロリットルの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルに入れた。マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミルリノン遊離培養培地で洗浄し、卵母細胞の3分の1を各処理に移します。ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%二酸化炭素と80%湿度で摂氏37度でインキュベーター内のプレートを維持します。インキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞の成熟の画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して、セクリン-gfp破壊を定量化し、時間0.1から開始してGFPチャネルの画像を開きます。目的の解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域を生成します。同じ関心領域を使用して、後で減算する背景領域を選択し、すべての時点で各関心領域のGFPピクセル強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、バックグラウンドにおける関心領域の測定値を差し引きます。減数分裂を3つのグループに分割した後、減数分裂の各グループを100マイクロリットルのミルリノン遊離培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーターに3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期1期、後期前中期1期、中期1期に到達します。割り当てられた時点で、9ウェルガラス皿を使用して室温で20分間、PMEバッファー中の500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒド滴に移して卵母細胞を固定します。次に、細胞を500マイクロリットルのブロッキング溶液を含むきれいなウェルに移します。MAD2検出を継続するには、500マイクロリットルの透過処理液滴を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートした後、細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートします。卵母細胞を抗MAD2抗体と抗セントロメア抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移し、室温で2時間インキュベートします。細胞を0.5%Tritonを添加した30マイクロリットルのPMEバッファーに移した後、過剰な一次抗体を洗浄するために、加湿チャンバー内で10分間インキュベートします。細胞を、抗ヒト633および抗ウサギ568などの二次抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移す。そして室温で1時間インキュベートする。顕微鏡スライドに細胞をマウントするには、DAPIを含む10マイクロリットルの封入培地に細胞を移します。カバースリップの各角にワセリンの小さなドットを追加します。それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して配布します。透明なマニキュアを使用してカバースリップをスライドにシールします。40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用した画像運動原体。そして抗セントロメア抗体シグナルを用いて、染色体領域全体のイメージングを可能にするZ範囲を決定する。DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンからの放出後約14時間で極性体を押し出した。SAC活性化後、ノコダゾール処理卵母細胞は中期1で停止し、極性体を押し出さなかった。しかし、SAC活性化がない場合、卵母細胞は動原体微小管付着がないにもかかわらず極性体を押し出した。筋成熟時のセクリン-gfp分解速度を評価した。前記コントロールDMSO処理卵母細胞セクリン-gfp強度は、ミルリノンウォッシュアウト後約10時間で減少し始める。SAC活性化剤、ノコダゾール、セクリン-gfpレベルの存在下で卵母細胞を成熟させると、筋成熟の全期間にわたって安定していた。対照的に、リバーシン処理でSAC活性化を予防した場合、セクリン-gfpパターンは加速し、分解はSAC阻害と一致するミルリノンウォッシュアウトの約4時間後に始まりました。.共焦点イメージングを使用して、前中期初期、後期前中期1、中期1に成熟した卵母細胞のセントロメアとMAD2を検出しました。SAC信号の強度を評価するために、動原体局在化し、MAD2画素強度を定量化した。動原体へのMAD2動員の有意なレベルは、ほとんどの動原体が微小管に付着していなかった前中期初期に発生します。MAD2のレベルは、後期中期に減少し、すべての動原体が微小管に安定して付着した中期1ではほとんど存在しませんでした。これらの手法にはそれぞれ制限と解釈があることを強調することが重要です。また、これらの方法を組み合わせて実行して、SAC の整合性を評価することをお勧めします。これらの3つのエッセイにより、研究者は卵母細胞の嚢の厳密さを評価し、ヒト卵子の異数性の潜在的な原因についての洞察を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

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