マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価
2022年9月13日
染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。
異数性は、人間の早期流産の主な遺伝的原因です。染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生します。したがって、卵母細胞の紡錘体アセンブリチェックポイントを評価することは、卵母細胞がエラーが発生しやすい理由を理解するために重要です。
ここでは、ライブイメージングと免疫蛍光の組み合わせを使用してチェックポイントでのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞のSAC完全性を包括的に評価する3つの手法について説明します。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるセシリア・ブレンジーニ博士です。原稿に記載されているように、対照としてDMSOを含むノコダゾールおよびリバーシンを含む1ミリリットルの培養培地を調製し始める。
卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で事前に温めた96ウェルプレートを使用します。そして、第1、第2および第3のウェルにそれぞれ150マイクロリットルのコントロールDMSO、ノコダゾールおよびノコダゾールプラスリバーシン処理をロードした。原稿に記載されている条件下でプレートをインキュベーター内に保ちながら。
筋成熟を開始するには、DMSOを含む100マイクロリットルのミリノン遊離培養培地6滴を通して卵母細胞を順次移すことによってミリノンを除去します。そして、それらを96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。手または口内ピペットを用いて、実体顕微鏡下で卵母細胞を観察した。
摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度80%の制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像をキャプチャします。卵の隣と共有透明帯内の小さな細胞で非対称サイトカインを通過する細胞を特定することにより、極体を押し出す卵母細胞の数を定量化した後。
イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します。前期1の停止卵母細胞に、事前に調製したセクリン-gfp cRNAのマイクロリットルあたり100ナノグラムをマイクロインジェクションします。マイクロインジェクション後、卵母細胞を二酸化炭素インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳します。
次に、5マイクロモルのノコダゾールの有無にかかわらず、150マイクロリットルの培養培地をロードします。0.5マイクロモルのリバーシンを含む150マイクロリットルの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルに入れた。マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミルリノン遊離培養培地で洗浄し、卵母細胞の3分の1を各処理に移します。
ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%二酸化炭素と80%湿度で摂氏37度でインキュベーター内のプレートを維持します。インキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞の成熟の画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して、セクリン-gfp破壊を定量化し、時間0.1から開始してGFPチャネルの画像を開きます。
目的の解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域を生成します。同じ関心領域を使用して、後で減算する背景領域を選択し、すべての時点で各関心領域のGFPピクセル強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、バックグラウンドにおける関心領域の測定値を差し引きます。
減数分裂を3つのグループに分割した後、減数分裂の各グループを100マイクロリットルのミルリノン遊離培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーターに3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期1期、後期前中期1期、中期1期に到達します。割り当てられた時点で、9ウェルガラス皿を使用して室温で20分間、PMEバッファー中の500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒド滴に移して卵母細胞を固定します。
次に、細胞を500マイクロリットルのブロッキング溶液を含むきれいなウェルに移します。MAD2検出を継続するには、500マイクロリットルの透過処理液滴を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートした後、細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートします。
卵母細胞を抗MAD2抗体と抗セントロメア抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移し、室温で2時間インキュベートします。細胞を0.5%Tritonを添加した30マイクロリットルのPMEバッファーに移した後、過剰な一次抗体を洗浄するために、加湿チャンバー内で10分間インキュベートします。細胞を、抗ヒト633および抗ウサギ568などの二次抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移す。
そして室温で1時間インキュベートする。顕微鏡スライドに細胞をマウントするには、DAPIを含む10マイクロリットルの封入培地に細胞を移します。カバースリップの各角にワセリンの小さなドットを追加します。
それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して配布します。透明なマニキュアを使用してカバースリップをスライドにシールします。40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用した画像運動原体。
そして抗セントロメア抗体シグナルを用いて、染色体領域全体のイメージングを可能にするZ範囲を決定する。DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンからの放出後約14時間で極性体を押し出した。SAC活性化後、ノコダゾール処理卵母細胞は中期1で停止し、極性体を押し出さなかった。
しかし、SAC活性化がない場合、卵母細胞は動原体微小管付着がないにもかかわらず極性体を押し出した。筋成熟時のセクリン-gfp分解速度を評価した。前記コントロールDMSO処理卵母細胞セクリン-gfp強度は、ミルリノンウォッシュアウト後約10時間で減少し始める。
SAC活性化剤、ノコダゾール、セクリン-gfpレベルの存在下で卵母細胞を成熟させると、筋成熟の全期間にわたって安定していた。対照的に、リバーシン処理でSAC活性化を予防した場合、セクリン-gfpパターンは加速し、分解はSAC阻害と一致するミルリノンウォッシュアウトの約4時間後に始まりました。.共焦点イメージングを使用して、前中期初期、後期前中期1、中期1に成熟した卵母細胞のセントロメアとMAD2を検出しました。
SAC信号の強度を評価するために、動原体局在化し、MAD2画素強度を定量化した。動原体へのMAD2動員の有意なレベルは、ほとんどの動原体が微小管に付着していなかった前中期初期に発生します。MAD2のレベルは、後期中期に減少し、すべての動原体が微小管に安定して付着した中期1ではほとんど存在しませんでした。
これらの手法にはそれぞれ制限と解釈があることを強調することが重要です。また、これらの方法を組み合わせて実行して、SAC の整合性を評価することをお勧めします。これらの3つのエッセイにより、研究者は卵母細胞の嚢の厳密さを評価し、ヒト卵子の異数性の潜在的な原因についての洞察を得ることができます。
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概要
この研究は、アヌプロイディーを引き起こす染色体分離誤りを理解するために不可欠なマウス卵母細胞における紡錘体組立チェックポイント（SAC）を調査します。この論文では、ライブイメージングと免疫蛍光を用いてSACの完全性を評価する3つの技術を概説しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- アヌプロイディーは人間の早期流産の主な原因です。
- 染色体分離の誤りは主に卵母細胞の減数分裂時に発生します。
- SACを理解することは、卵母細胞が誤りに陥りやすい理由を特定するために不可欠です。
- この研究は、これらのメカニズムのモデルとしてマウス卵母細胞に焦点を当てています。
研究の目的
- マウス卵母細胞における紡錘体組立チェックポイントの完全性を評価すること。
- 様々な技術を用いてチェックポイント評価の重要なステップを特定すること。
- 卵母細胞の成熟とそれが妊孕性に与える影響についての理解を深めること。
使用された方法
- 制御された環境下での卵母細胞成熟のライブイメージング。
- SACに関与する特定のタンパク質を検出するための免疫蛍光技術。
- 卵母細胞成熟と極体外出の定量化。
- 減数分裂中のsecurin-gfp分解の分析。
主要な結果
- 対照群の卵母細胞は、milrinoneの放出から約14時間後に極体を外出させました。
- Nocodazoleで処理された卵母細胞は、極体外出なしに第1中期で停止しました。
- SACの活性化がなくても、卵母細胞はキネトコア微小管付着がないにもかかわらず極体を外出させました。
- Nocodazoleで処理された卵母細胞では、成熟中のsecurin-gfpレベルは安定でした。
結論
- この研究は卵母細胞における染色体分離メカニズムについての洞察を提供します。
- SACの完全性を理解することは、人間の生殖におけるアヌプロイディーに対処するために不可欠です。
- 説明された技術は、生殖生物学のさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Evaluating spindle assembly checkpoint (SAC) integrity in mouse oocytes addresses a critical bottleneck in understanding the origins of aneuploidy, a major cause of early miscarriage. This protocol enables mechanistic de-risking at the earliest stages of reproductive biology, supporting predictive confidence in target validation for chromosome segregation fidelity. Integrating these assays into discovery pipelines informs risk-adjusted decisions for translational research and reproductive health portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of SAC function to clarify mechanisms underlying chromosome segregation errors.
- Supports biological de-risking by quantifying checkpoint stringency in oocytes.
- Provides functional target validation for pathways implicated in aneuploidy.
- Facilitates predictive confidence in selecting targets for further reproductive biology research.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live imaging and immunofluorescence assays for SAC activity.
- Standardizes quantitative readouts such as securin degradation kinetics and MAD2 recruitment.
- Enables reproducible assessment of checkpoint integrity across experimental conditions.
- Prepares robust biological systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant models of aneuploidy risk.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of SAC-modulating interventions.
- Informs biomarker strategies for reproductive health and fertility research.
- De-risks translational advancement by clarifying checkpoint failure mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative checkpoint assessment in oocytes.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of SAC activation, silencing, and protein recruitment.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for checkpoint integrity and oocyte maturation.
- Analytics: Delivers measurable readouts such as polar body extrusion rates and MAD2 intensity for condition comparison.
- Translational Research: Connects checkpoint integrity to preclinical models of aneuploidy and reproductive failure.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating SAC function across genetic backgrounds or interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in chromosome segregation studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assays for checkpoint evaluation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of reproductive health targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and triage of early-stage reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oocyte handling, live imaging, and immunofluorescence techniques.
- Demands access to advanced microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and data interpretation.
- May require adaptation for different genetic backgrounds or model systems.
- Interpretation of results must consider assay-specific limitations and biological context.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Nocodazole Treatment and Live Imaging
2:41
Monitoring the Pattern of Securin-GFP Degradation During Meiotic Maturation
4:42
Recruitment of MAD2 at Kinetochores by Immunofluorescence During Meiotic Maturation
7:26
Results: Evaluating Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes
9:33
Conclusion
