足首-距骨下複合関節不安定性のマウスモデル

ASCJ無力マウスモデルの確立に成功したことは、単純な足首障害動物モデルを拡張し、臨床的足疾患の研究のための新しい概念を提供します。より実際の臨床状況に即した動物モデルを確立し、足の病気の診断と治療に関するさらなる研究に活用しています。実験の1週間前に、マウスに平均台と歩行訓練を行い、平均台またはU字型のパイプの端から端まで、止まることなく移動します。

マウスの右後肢の足首関節の毛を麻酔して除去した後、露出した皮膚をヨウ素綿棒で消毒します。滅菌手術用パッドを使用して、マウスを顕微鏡手術動物の手術室に移します。横頸部および前距腓靭帯群については、右足首関節の上の皮膚にメスで7ミリメートルの斜め下向きの縦方向切開を行います。

そして、足首関節の前面に顕微鏡のまっすぐな鉗子でプローブします。距骨本体と腓骨の下縁にある前距腓靭帯の露出を確実にし、メスで穏やかに切ります。長腓骨腱と短腓骨腱、および長指伸筋腱を分離します。

頸靭帯を露出させ、メスで切ります。横頸靭帯と三角筋靭帯群は、右足関節の内側皮膚を縦に8ミリ切開し、DLを内側くるぶしから鈍く分離して切断します。次に、前述のように頸靭帯を切断します。

偽グループの場合、右足首関節の偽手術を行います。切開部を滅菌生理食塩水で洗い流した後、5-0の外科用ナイロン糸で縫合し、続いてヨウ素綿棒で縫合した切開部を消毒します。手術後2週間で角関節の腫れが引いたら、マウス回転疲労マシンでマウスを毎日1時間運動させます。

平均台のテストでは、一方の端を15度傾斜させた円形の木製梁を写真用三脚クリップで固定し、もう一方の端を閉じたカセットに接続された作業台に置きます。手術の1週間前に平均台のトレーニングを行い、マウスがビームの端から端までスムーズに動くようにします。マウスが 60 秒間に 2 回、一時停止せずにビームを通過した場合、テストに合格したとします。

各試行の後、平均台に75%のアルコールをスプレーして、前のマウスの残留臭いが次のマウスに影響を与えないようにします。平均台のテストを実行し、各マウスが平均台を2回連続で通過した平均時間を記録します。そして、右後ろ足がビームから滑り落ちる回数を従属変数として。

フットプリント解析では、実験台にU字型のプラスチックチャンネルを置き、プラスチックチャンネルの一端を閉じたカセットに接続します。普通の顔料紙をチャネルに平らに置きます。次に、マウスを両手で持ち、前足と後足に無毒の赤と緑の顔料を均等に塗ります。

次に、ペイントされたマウスをチャネルの一方の端に置き、カセットのもう一方の端に移動させます。足跡のついた顔料紙を取り、印をつけ、風通しの良い日陰のある場所で乾かします。前のマウスの残留臭いが次のマウスに影響を与えるのを防ぐために、各マウスが通過した後、U字型のプラスチックチャネルに75%のアルコールをスプレーします。

各用紙に連続して 3 つの連続したクリア マウス フットプリントを選択します。定規を使用して、マウスの右足の足跡のステップ長を、左右の足跡の間のステップ幅で測定します。顕微鏡のピンセットとハサミを使用して、足首標本の周りの余分な軟部組織を取り除きます。

次に、10%EDTA脱灰溶液を含む遠心分離管に検体を入れ、さまざまなグループに印を付けます。次に、遠心チューブを振とう台に置き、脱灰します。1日1回脱灰液を交換し、検体の脱灰を測定します。

1ヶ月の脱灰後、グラジエントアルコールで検体を脱水し、清澄化のためにN-ブタノールを8時間使用します。最後に、透明化した標本を冠状の位置にあるパラフィンに浸して包埋します。切片化する前に、試験片を摂氏4度の冷蔵庫から摂氏マイナス20度の冷凍庫に約10分間移し、完全な平面切断を容易にします。

標本をミクロトームに固定し、6マイクロメートルの厚さに切断します。同時に、顕微鏡を使用して、サンプルがシリンジ針を骨組織に簡単に挿入できるように予想されるレベルで切断されているかどうかを観察します。2つまたは3つの完全なパラフィンセクションを連続して切断した後、摂氏40度に設定した錠剤機に移して完全に膨張させます。

次に、スライドガラスでパラフィン切片を取り除きます。最後に、スライドにグループと番号をマークします。無傷のASCJ関節構造を顕微鏡で観察する。

切片を摂氏60度に設定されたインキュベーターに40〜50分間置きます。次に、原稿に記載されているように、キシレンで切片を3回脱ワックスします。脱ワックスした切片を100%エタノールに2回3分間入れ、続いて90%エタノールと80%エタノールをそれぞれ5分間入れます。

次に、切片を二重蒸留水で5分間洗浄します。ヘマトキシリンに1分間浸した後、切片を二重蒸留水で無色になるまで洗浄します。切片を1%酸性エタノール分化溶液に30秒間浸し、二重蒸留水で洗浄します。

切片を1%アンモニア溶液で染色し、二重蒸留水で洗浄したら、サンプルをエオシン染色液で1分間染色します。次に、それらを95%と100%のエタノールにそれぞれ1分間連続して入れます。最後に、切片をキシレンフォーで1分間処理します。

切片を風乾させ、スライド上の試料に中性樹脂を一滴垂らした後、カバースリップで覆います。次に、直立蛍光顕微鏡で5倍と20倍の明視野で画像を撮影します。ヘマトキシリンとアンモニアで染色した切片を0.05%fastグリーンに2分間浸します。

続いて、切片を1%酢酸溶液に30秒間、0.1%サフラニンに5分間浸漬します。次に、前述のようにスライドをエタノールとキシレンで処理します。正立蛍光顕微鏡で5倍と20倍の明視野で画像を撮影します。

手術から3日後、8週間後、12週間後、切断された靭帯群は偽群よりも平均台を通過するのに有意に時間がかかった。手術前、右後足の歩幅は3匹のマウス群で同等であった。しかし、術後12週間の段階では、靭帯切断群の方が偽群よりもステップ長が短かった。

手術前、活動中のマウスの足の熱侵害受容反応時間は、マウスの3つのグループ間で類似しています。手術後、靭帯切断群のマウスは、偽群と比較してより長い応答時間を示しました。切断された靭帯群の右後足のASCJは、表面の粗さ、骨棘の蓄積、変性変化を示しました。

そして、偽群よりも有意に高い骨体積分率。靭帯切断群のASCJの軟骨層は不連続性を示し、軟骨細胞数が減少した。また、靭帯切断マウスのMalkin and Osteoarthritis Research Society Internationalスコアは、偽グループよりも有意に高かった。

偽群の右後足のASCJ関節軟骨層の2型コラーゲンは、靭帯を切断した2群のマウスよりも均一で高かった。この研究は、足首の不安定性の診断と治療に使用でき、この病気の臨床治療の実験的参照を提供します。