Name: 腸内細菌叢-神経系軸を研究するためのGut-on-a-chipモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぼう、gut-on-a-chipモデルneuroHuMiXを用いた腸内細菌叢と腸神経系の相互作用解析手法。細菌・上皮・神経細胞の共培養により、パーキンソン病などの神経疾患における腸-脳軸のメカニズム解明に貢献します。

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著者らは、K7系統の細胞を提供してくれたJared Sterneckert博士に感謝します。また、長年の共同研究者であるアリゾナ大学のフレデリック・ゼンハウザーン博士とマシュー・W・バレット博士には、エンジニアリング面での支援にも感謝します。また、neuroHuMiXの概略表現の設計に協力してくれたValentina Galata博士にも感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」(助成金契約863664)に基づき、欧州研究会議(ERC)から資金提供を受けています。 図 1 は、部分的に Biorender.com で作成されました。

<ol><li>Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome%3A+function+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome: function matters.</a> Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).</li>
<li>Toor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+disrupts+gut+immune+homeostasis+and+promotes+gastric+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432(2019).</li>
<li>Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+%CE%B1-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).</li>
<li>Schmit, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fibre+deprivation+and+bacterial+curli+exposure+shift+gut+microbiome+and+exacerbate+Parkinson%27s+disease-like+pathologies+in+an+alpha-synuclein-overexpressing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+meta-omics+to+causality%3A+experimental+models+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research.</a> Microbiome. 1 (1), 14(2013).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+Recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects.</a> BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9(2020).</li>
<li>May, S., Evans, S., Parry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%2C+organs-on-chips+and+other+systems%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535(2016).</li>
<li>Greenhalgh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+in+vitro+and+in+silico+modeling+delineates+the+molecular+effects+of+a+synbiotic+regimen+on+colorectal-cancer-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells.</a> Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+metabolic+links+between+the+murine+microbiome+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory.</a> Microbiome. 8 (1), 53(2020).</li>
<li>Moysidou, C. M., Owens, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+modelling+the+human+microbiome-gut-brain+axis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+propagation+of+pathologic+%CE%B1-synuclein+from+the+gut+to+the+brain+models+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease.</a> Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research%3A+a+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li>
<li>Marshall, J. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+vs+man%3A+Organoid+models+of+brain+development+%26+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease.</a> Brain Research. 1724, 146427(2019).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Sedrani, C., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+hypothesis-driven%2C+personalized+microbiome+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening.</a> Cell Reports Methods. 2 (1), 100139(2022).</li>
</ol>

P.W.は、PCT/EP2013/056607、PCT/EP2016/062024、PCT/US2017/061602、PCT/EP2019/081424特許に発明者として記載されていることを宣言します。P.W.、C.S.、およびL.G.は、特許LU503075に発明者として記載されていることを宣言します。

ヒトの腸内細菌叢が宿主の健康と病気に影響を与えることが現在確立されています。特にアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経疾患において、マイクロバイオームの重要性を示唆する知識があるにもかかわらず3,13、腸内細菌叢が腸神経系、ひいては脳とどのように相互作用するかはほとんど不明のままです。
腸内細菌叢と神経系の相互作用を研究する代表的なモデルは、これまでのところ利用されていません。腸脳軸に関する研究は、伝統的にマウスモデルを用いて行われてきた13。マウスとヒトはゲノム配列の85%を共有しているが14、マウスとヒトを比較する際には考慮すべき大きな違いがある。腸に関しては、人間と比較して、マウスはもっぱら草食動物であることに注意することが重要です。その結果、彼らの消化管は、「胃内容排出」14などの長さと特徴が異なります。マウスの脳はまたマウスと人間の間の全面的な構造が異なっているという、重要な相違を示す15。重要なことに、ヒトは神経前駆細胞の細胞サイクルタイムが長い15。そのため、腸管細胞や神経細胞などヒト由来の細胞を含む代表的なモデルの開発が重要である5。これに関連して、 in vitroモデルを介して より再現性の高い研究を開発することで、動物モデルを使用する必要性が減り、再現性が向上します。
neuroHuMiXは、以前のHuMiXモデル9の高度なバージョンです。HuMiXは、上皮細胞と細菌細胞の近位および代表的な共培養を可能にするガットオンチップモデルです。細胞間コミュニケーションは、半透膜 を介した 分泌因子および代謝産物の近位共培養および拡散によって可能となる。しかし、ヒトの腸内環境を研究するための初期装置の有用性を拡大するためには、追加の細胞型の導入が必要である。そこで、iPS細胞由来のENを導入して開発されたneuroHuMiXは、細菌、腸管上皮細胞、ENの近位共培養を可能にしました。その結果得られた in vitro モデルにより、ヒトの神経系に関連するヒト腸内細菌叢に関する疑問に取り組むことができます。異なる種類の細胞、特に哺乳類細胞と細菌の共培養には、生存率の喪失、接着不良、合流点の全体的な損失など、いくつかの課題があります16。今回、この装置内で、細胞生存率を高く保ちながら、同じシステム内で3種類の異なる細胞を共培養できることを実証しました。
プロトコルの重要なステップは装置に接種する前にニューロンの細胞のconfluencyを保障することである-80%-90%の細胞のconfluencyおよび生存率。分析中の細胞増殖を評価することはできないため、細胞をモデルに導入する前に、細胞がコンフルエントで十分に増殖していることを確認することが最も重要です。これは制限要因となる可能性がありますが、デバイス内で観察される全体的な生存率とコンフルエンシーは一般的に高いです。
この装置は、チューブライン を介して 蠕動ポンプに接続されています。各セルチャンバーには、特定のチューブラインがあります。チューブは、媒体の灌流に蠕動ポンプの使用を可能にするポンプチューブと、ポンプチューブをデバイスに接続するチューブ、およびデバイスを流出/廃液ボトルに接続するチューブで構成されています。サンプリングポートは、流出媒体の接種とサンプリングを可能にするために、デバイスの前後に含まれています。各チャンバーは異なる培地に接続できるため、個々の細胞タイプに最適な培養条件を実現できます。各チャンバーは、培地供給の特定のニーズに応じて開閉できます。この装置では、神経細胞のチャンバーは実験のほとんどで閉じたままですが、細菌と上皮のチャンバーは常に開いているため、実験全体を通して新鮮な培地が得られます。媒体が途切れることなく流れるようにするには、チューブ、コネクタ、またはデバイス内に空気が残っていないことが重要です。したがって、プライミングステップで最初にデバイスを数分間動作させることが重要です。多くの場合、これで問題が解決します。そうでない場合は、流出の三方活栓を閉じることで、落下している他のラインの1つを短時間閉じることができます。これにより、媒体が気泡のあるラインにリダイレクトされ、チューブを通して気泡を外側に押し出すことで問題が解決します。
細胞培養実験では、培地は重要な要素であり、各細胞タイプにはそれぞれの培地があります。共培養セットアップでは、培地は、培地内で増殖する細胞の種類だけでなく、共培養内の他の細胞の種類にも適合している必要があります。これはデバイスの場合も同じで、細菌細胞、上皮細胞、神経細胞の3種類の細胞を内部に持つ3つの異なるコンパートメントがあるため、さらなる課題が生じます。しかし、10% FBSでRPMI 1640に5%MRSを添加して細菌培地を修飾することにより、すべての細胞タイプ、特に細菌細胞と上皮細胞をシステム内でうまく共培養できることを示しました。しかし、この装置では、異なる種類の細胞が近接して共培養されているため、互いに直接接触することはありません。これはヒトの腸内の細胞間の直接接触を完全には表しておらず、したがって制限されていますが、近位および代表的な共培養条件は、ダウンストリーム分析の強みです。可溶性因子は、異なるチャンバーと細胞タイプ間で交換されます。したがって、細胞はまだ互いに相互作用しています。さらに、細胞タイプを別々に採取して分析できるという事実により、健康なマイクロバイオームと病気のマイクロバイオームがさまざまな細胞タイプ(神経細胞を含む)に及ぼす影響を研究し、それによって細胞タイプ固有の読み出しを決定/取得することができます。もう一つの制限は、各実験の最後に装置を開いて細胞をチェックすることしかできないため、実験中に細胞の形態を追跡できないことです。
私たちの知る限り、neuroHuMiXはENを含む最初のガットオンチップモデルです。これは、腸内細菌叢と腸神経系のコミュニケーションを解明するための一歩です。これは、細菌種、上皮層、およびEN間の相互作用を調査できるモデルです。その設計により、異なる細胞タイプによって分泌される可溶性因子の交換と、それらが互いに及ぼす影響を研究することができます。今後は、iPS細胞由来のENだけでなく、iPS細胞由来の上皮細胞も装置内に搭載し、個別化モデルへの移行が重要になってきます。重要なことに、この個別化モデルは、プレバイオティクス、プロバイオティクス、およびシンバイオティクスのテストに使用でき10,11、パーソナライズされたスクリーニングと治療アプローチを開発する可能性があります17。パーソナライズされたneuroHuMiXは、最終的にヒトの腸内細菌叢の「暗黒物質」と、腸内細菌叢-神経系軸に沿った神経系との相互作用に光を当て、治療の評価と介入への道を開く可能性があります。
腸内細菌叢と神経系の軸に沿った相互作用の研究と理解を進めるためには、腸内神経系を含む腸チップを持つことができると結論付けることができます。NeuroHuMiXは、宿主細胞に対する細菌種の影響を研究することを可能にし、さらに生理学的に代表的な方法でモデルをさらに改善するための良い基盤を提供します。

ヒトの腸内細菌叢は、ヒトの健康と病気に重要な役割を果たしています。過去10年半にわたって広く研究され、健康と病気の調節におけるその潜在的な役割が現在確立されています1。マイクロバイオームの破壊は、不均衡な微生物群集(嚥下障害)を引き起こし、肥満、炎症性腸疾患、結腸直腸癌などの多くの慢性疾患、さらにはパーキンソン病などの神経変性疾患の病因に関与していると仮定されています2,3。
ヒトの腸内細菌叢は神経疾患と関連していますが、腸内細菌叢が腸内神経系とどのようにコミュニケーションを取り、影響を与えるかはまだ不明です。ヒトの腸神経系は、すぐに研究できる場所ではないため、これまで実験では動物モデルが用いられてきました4。しかし、動物モデルとヒト5の明らかな違いを考えると、ヒトの腸を模倣したin vitroモデルの開発は、当面の関心事である。このような状況の中、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の分野が急成長し、進歩することで、代表的な腸ニューロン(EN)を得ることができました6。iPS細胞由来のENは、細胞培養インサート、オルガノイド、Organs-on-a-chipなどのin vitro培養モデルにおける腸管神経系の研究を可能にします7,8。
ヒト-微生物クロストーク(HuMiX)モデルは、ヒトの腸を模倣したガット・オン・チップ・モデルである9。初期のHuMiXモデル(以下、初期装置と呼ぶ)は、上皮細胞(Caco-2)および細菌細胞10,11を収容した。しかし、腸内細菌叢と神経系のつながりを研究するために、iPS細胞由来のEN6もシステムに導入されています(図1)。神経細胞、上皮細胞、細菌細胞の近位共培養により、異なる細胞タイプを個別に分析し、ヒトの腸を模倣した環境で異なる細胞タイプ間の相互作用を研究することができます。
近年、Organs-on-a-chip(例えば、Gut-on-a-chip)モデルを用いて、より生理学的に代表的な方法で臓器を研究するモデルの開発が進んでいます。これらのモデルは、絶え間ない栄養素の供給と老廃物の除去、および酸素レベルやバリアの完全性などのリアルタイムモニタリングにより、人間の腸内環境をより代表しています8,12。これらのモデルは、特に宿主細胞に対する腸内細菌の影響の研究を可能にします。しかし、Organ-on-a-chipを使用して腸内細菌叢と神経系の相互関係を研究できるようにするには、神経細胞をそのようなシステムに統合する必要があります。そこで、HuMiXをさらに発展させ、neuroHuMiXシステム(以下、本デバイス)を確立する目的は、腸管上皮細胞や細菌と近位共培養する腸管神経細胞を含む腸管チップモデルの開発でした。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10712</td><td></td></tr><tr><td>曝気カニューレ (長さ: 1.10 直径: 30 mm)</td> <td>VWR (B.Braun)</td><td>BRAU4190050</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Merck Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム圧着</td><td>ガラス;tebau Ochs</td><td>102050</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント マイナス ビタミン A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>細菌細胞膜、細孔サイズ: 1 & マイクロ;m</td><td>VWR(Whatman)</td><td>515-2084</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2細胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC169</td><td></td></tr><tr><td>細胞カウンター&アナライザー CASY</td><td>OMNI Life Sceince</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR</td><td>Axon Mechem BV</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rat Tail</td><td>Invitrogen A1048301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-way stopcock</td><td>B.ブラウン</td><td>BRAU40951111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12、グルタミン無し</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、D-PBS</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 6 ミディアム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 ミディアム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>メスルアーロック - バーブコネクタ</td><td>Qosina</td><td>11733</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Σ Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、FBS</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト細胞膜、孔径:50 nm</td><td>シグマ アルドリッチ (GE Healthcare)</td><td>WHA111703</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX ガスケット コラーゲン</td><td>アウアー プレシジョン</td><td>216891-003</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX ガスケット サンドイッチ ボトム</td><td>アウアー プレシジョン</td><td>216891-002</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX ガスケット サンドイッチ トップ</td><td>アウアー プレシジョン</td><td>216891-001</td><td></td></tr><tr><td>iPSC</td><td>マックス プランク分子生物医学研究所</td><td>K7 ライン</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>ギブコ</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>エンゲルブレス・ホルムスワー</td>ム <td>シグマ アルドリッチ</td> ラミニン<td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer with Spin Lock to Barb</td><td>Qosina</td><td>11735</td><td></td></tr><tr><td>Marprene チューブ (0.8 mm x 1.6 mm)</td><td>Watson-Marlow</td><td>902.0008.J16</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC qualified matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mucin, from porcine stomach</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Needle (長さ: 120 mm; 直径: 0.80 mm)</td><td>B.Braun (カラーコード):緑)</td><td>466 5643</td><td></td></tr><tr><td>針(長さ:40 mm、直径:0.70 mm)</td><td>Henke Sass Wolf(カラーコード:黒)</td><td>4710007040</td><td></td></tr><tr><td>針(長さ:80 mm、直径:0.60 mm)</td><td>B.Braun(カラーコード:青)</td><td>466 5635</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-human CD49d antibody</td><td>Biolegend</td><td>304314</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Watson-Marlow</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート蓋 (HuMiX)</td><td>アリゾナ大学</td><td>HuMiX 1.0 / 2.0</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RLT バッファー (RNeasy Minikit)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>72400-021</td><td></td></tr><tr><td>SB431542、ALK inhibitor</td><td>Abcam</td><td>ab120163</td><td></td></tr><tr><td>Serum bottles</td><td>Glasger&auml;tebau Ochs</td><td>102091</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA溶液</td><td>シグマAldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>R&Dシステムズ</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内細菌叢-神経系軸を研究するためのgut-on-a-chipモデル

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

人体は、ヒト細胞で構成されているのと少なくとも同じ数の微生物細胞によってコロニーを形成しており、これらの微生物のほとんどは腸内にあります。腸内細菌叢と宿主の相互作用は広く研究されていますが、腸内細菌叢が腸内神経系とどのように相互作用するかはほとんどわかっていません。これまでのところ、腸内細菌叢と神経系の相互作用を研究するための生理学的に代表的な in vitro モデルは存在しません。 
このギャップを埋めるために、人工多能性幹細胞由来の腸管ニューロンをデバイスに導入することにより、ヒト-微生物クロストーク(HuMiX)腸オンチップモデルをさらに開発しました。その結果、モデル「neuroHuMiX」は、半透膜で分離されたマイクロ流体チャネル全体で、細菌、上皮細胞、神経細胞の共培養を可能にします。異なる細胞タイプが分離されているにもかかわらず、細胞は可溶性因子を介して互いにコミュニケーションをとることができ、同時に各セルタイプを別々に研究する機会を提供します。このセットアップにより、腸内細菌叢が腸内神経細胞にどのような影響を与えるかについての最初の洞察が可能になります。これは、ヒトの腸内細菌叢と神経系の軸を研究し、理解するための重要な第一歩です。

neuroHuMiXでは、細菌細胞、上皮細胞、神経細胞の3種類の細胞を共培養しました(図1)。すべての細胞が生存可能であることを確認するために、異なる細胞タイプに対して異なるアッセイを実施しました。例えば、細菌細胞のCFUカウント、上皮細胞の細胞数と細胞生存率アッセイを行い、神経細胞は顕微鏡分析 で 評価しました。
<img alt="腸と脳の相互作用図;生物実験分析のためのマルチチャンバー培養システム。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig01.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 1"> 図1:neuroHuMiXとその実験装置の概略図。 (A)3つのチャンバーは、2つのPCの蓋の間に挟まれて閉じたままになっています。各チャンバーは、内部で増殖した細胞のための特定の培地で満たされています。異なるチャンバーは半透膜で隔てられており、膜を通過する可溶性因子を介した細胞間コミュニケーションが可能です。(B<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="バイオプリンティングセットアップでの細胞培養と生存率の結果。CasyおよびTrypan Blueアッセイ箱ひげ図" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig06.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 6"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig06large.jpg" target="_blank"></a><img alt="棒グラフ;CFU分析;実験グループの比較;統計的有意性;微生物学的結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig07.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 7"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig07large.jpg" target="_blank"></a><img alt="顕微鏡画像、細胞培養形態、200μmスケール、生物学研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig08.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 8"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig08large.jpg" target="_blank"></a><img alt="マイクロ流体チップ、透明プラスチック、流体制御、実験室分析、研究装置に使用されます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig02.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 2"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="マイクロ流体チップのセットアップ,流体分離実験のためのスパイラルチャネル設計,実験室分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig03.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 3"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="マイクロ流体デバイスの組み立て、レイアウトと構築、スパイラルチャネルの設計、実験セットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig04.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 4"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="静脈内輸液のセットアップ図。チューブ、コネクタ、医療用輸液システム用バルブ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig05.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 5"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig05large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neuroHuMiXは、近位および代表的な共培養条件下での細菌、上皮細胞、および神経細胞の相互作用を研究するための高度なガットオンチップモデルです。このモデルにより、腸内細菌叢と神経系の間のコミュニケーションの根底にある分子メカニズムを解明することができます。

腸内細菌叢-神経系軸を研究するためのGut-on-a-chipモデル

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

このプロトコルは腸の神経系からのセルに対する細菌種の効果をはじめて調査することを割り当てるので重要である。腸内神経系は簡単にはアクセスできないため、このモデルでは腸内細菌叢が腸内神経系の細胞に及ぼす影響を研究することができます。将来的には、このモデルを使用して、パーキンソン病などにおいて、罹患した患者の腸内細菌叢が腸神経系の細胞にどのような影響を与えるかを調べることができます。将来的には、このモデルを他の臓器オンチップモデルと結びつけて、腸脳軸を代表するモデルを構築することが考えられます。プロトコルには多くのステップが含まれており、各ステップはこのモデルの実現を成功させるために重要であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を実演するのは、システム生態学研究室の博士課程に在籍するキャサリン・セドラニ氏です。まず、ネジを締めてクランプの上部と下部を固定し、蓋の角にある4本のネジを握って、コーティングして乾燥させた底部のポリカーボネート蓋を正方形のペトリ皿からクランプベースの上部に移します。滅菌ピンセットを使用して、メンブレンをポリカーボネートの蓋に上に向けて上皮チャンバーガスケットを配置します。ガスケットと蓋をネジで合わせ、コーナーの入口と出口のポートがガスケットの開口部に揃っていることを確認します。サンドイッチガスケットをコラーゲンガスケットの上に置き、上面を上にして置きます。次に、上部のポリカーボネート蓋をサンドイッチガスケットの上に置きます。クランプ蓋のバーブがメンブレンアセンブリの入口と出口の開口部に揃っていること、および下蓋のネジが上蓋の開口部に合っていることを確認します。デバイスを閉じるには、クランプ蓋をポリカーボネート製の蓋の上に置き、ラッチを閉じます。チューブラインのプライミングのために、フィルター付きの曝気ニードルを各流入ボトルと流出ボトルのセプタムに挿入します。清潔な滅菌ピンセットを使用して、120ミリメートルの針を250ミリメートルの血清ボトルに挿入し、80ミリメートルの針を15ミリメートルの血清ボトルに挿入します。.各チューブラインの端にある40mmの針を流出血清ボトルに挿入します。上皮管と神経管管の40mm針は、培地廃棄のために同じ排出ボトルに接続されています。バクテリアチューブラインは、2番目の流出ボトルに送られます。ポンプチューブラインをポンプカセットに挿入します。蠕動ポンプを設定して、流入から排出ボトルに媒体を5RPMの速度で向け、スタートボタンを押してポンプを始動します。チューブラインの三方活栓がすべて開いていることを確認します。メディアが流出ボトルに落下したら、チューブラインと接続ポイントに漏れや気泡がないことを確認してください。すべてのチューブラインが流出ボトルに落ちたら、流量を2RPMに設定して最初のデバイスを接続します。ラインを接続するには、流出側から始めて、三方活栓バルブを閉じます。短いチューブをメスのルアーコネクタから外し、チューブをバーブに押してデバイスの出口ポートに取り付けます。漏れのない安全な接続のために、チューブをコネクタの奥まで押し下げ、蓋に接触するようにします。1本の線がデバイスに完全に接続されたら、活栓を開きます。ポンプの流量を2RPMに設定し、ポンプ速度を最大2.5RPMに上げて、圧力の上昇による漏れを防ぎます。ポンプがチャンバーをプライミングできるようにします。すべてのチャンバーが細胞培養培地で満たされ、デバイス内に気泡が残らなくなったら、ポンプ速度を0.5 RPMに下げます。上皮細胞については、トリプシンEDTAを用いてCaco-2細胞をフラスコから剥離します。それらをRPMI 1640と10%FBSで再懸濁し、トリパンブルー排除アッセイを使用してノイバウアーセルカウンターでカウントします。Caco-2細胞懸濁液を300Gで3分間遠心分離し、上清を捨ててEDTA中の残りのトリップを除去します。Caco-2細胞をRPMI 1640と10%FBSで再懸濁し、35万細胞/ミリリットルの懸濁液を得ます。1.5ミリリットルのCaco-2細胞懸濁液を滅菌済み2ミリリットルシリンジに移し、シリンジに残っている気泡を取り除きます。細菌室と神経室の両方のチューブの三方活栓バルブを閉じ、それぞれのチューブが入ったカセットをローターから取り外して、チューブをポンプから外します。上皮室につながる流入チューブの活栓バルブのキャップを開き、バルブを回して、デバイスから開いたコネクタに媒体の流れをリダイレクトします。ストップバルブの開放端に媒体の滴が現れるまで、媒体を流します。上皮細胞付きのシリンジをドロップドロップ接続方式でオープンコネクタに挿入し、挿入時の気泡の発生を防ぎます。活栓のバルブを回して、流入ボトルからの媒体の流れを止め、接続されたシリンジから初期装置への流れを可能にします。上皮室をポンプから外し、シリンジをゆっくりと押して、上皮室に1.5ミリリットルの細胞懸濁液を接種します。流出活栓のバルブを閉じ、シリンジを外します。活栓の開放端をキャップで閉じ、チャンバーを少なくとも2時間閉じたままにします。その間に、神経細胞に接種します。インキュベーターからデバイスを取り外し、チューブラインを取り外した後、クランプをゆっくりと開き、蓋を取り外します。上部のポリカーボネート製の蓋は注意して取り外します。培地を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに集め、氷上に置きます。サンドイッチガスケットを静かに取り外しながら、細胞層に触れることなく上皮チャンバーから培地を回収します。サンドイッチガスケットを正方形のシャーレに入れ、チャンバーが完全に覆われるまで、滅菌した0.9%塩化ナトリウムと水溶液をバクテリアチャンバーに加えます。コラーゲンガスケットをゆっくりと取り外しながら、ニューロン室から培地を回収します。培地をマイクロ遠心チューブに移した後、チューブを氷上に置きます。コラーゲンガスケットを正方形の皿に入れ、細胞層が完全に覆われるまで、数ミリリットルのPBSをCaco-2層にそっと加えます。底のポリカーボネートの蓋を正方形のペトリ皿に置き、サンプリングプロセス中に神経細胞が乾燥しないように、神経細胞の上に約2ミリリットルのPBSを静かに加えます。培地チューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。各チューブの上清を新しいマイクロ遠心チューブに移した後、すぐにドライアイスの上に置きます。CFU カウントは、2 つの異なる初期デバイス設定について評価されました。L.reuteriは、Caco-2およびL.reuteriとヒト微生物クロストーク装置で共培養しました。どちらのセットアップでも、CFU数はHuMix接種物および採取された細胞と有意に異なっており、初期デバイス内で細菌細胞が増殖していることが示されました。デバイス内で腸ニューロンを培養すると細胞の表現型が変化するかどうかを評価するために、倒立位相差顕微鏡を使用してそれらの肉眼的形態を観察しました。コンフルエントニューロンネットワークの確立は、細胞がコーティングされたデバイスのポリカーボネート蓋によく付着していることを示しました。コンフルエントニューロンネットワークとガスケットで描かれた螺旋の間のエッジは、はっきりと明らかでした。神経上質植物科学の可能性は、代表的なモデルがないためにヒトと腸管のマイクロバイオームと腸神経系の相互作用に関して、これまで取り組むことが困難であった疑問に答えることにあります。

a-gut-on-a-chip-model-to-study-the-gut-microbiome-nervous-system-axis

Research

JoVE Journal

Biology

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腸内細菌叢-神経系軸を研究するためのGut-on-a-chipモデル

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