腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

このプロトコルは、動物モデルよりも低コストで操作可能な環境で結腸幹細胞の機能を研究する方法を提供します。オルガノイド培養により、免疫のない環境で幹細胞機能を研究することができます。これにより、クローディン-7のノックアウトなど、特定の原因の影響を特定することができます。

幹細胞の機能機構を理解することで、炎症性腸疾患や大腸がんなどの衰弱性疾患の新たな治療標的が明らかになる可能性があります。安楽死させたマウスから結腸陰窩の分離を開始するには、マウスの正中線を約2インチ切開します。次に、皮膚をピンで留めて腹部を露出させます。

結腸を分離するために、近位側からコエカムのすぐ下、遠位側から直腸の上を切断します。次に、鉗子を使用して結腸に付着した脂肪組織を取り除きます。鉗子の平らな端で単離された結腸から糞便を押し出した後、組織を縦方向に切り開きます。

鉗子による洗浄の間に組織をPBSで回転させることにより、冷たいPBSで組織を10〜15回洗浄します。次に、清潔で鋭いはさみを使用して、組織を約3〜5ミリメートルの範囲の小片に切ります。別の安楽死マウスから結腸を分離した後、冷たい上皮解離培地を含む50ミリリットルの遠沈管ですべての組織片を結合し、結腸組織片を上皮解離培地で摂氏4度で90分間インキュベートします。

インキュベーション後、組織片をチューブの底に沈めます。落ち着いたら、組織片を破壊することなく上皮解離培地を廃棄します。冷たいPBSで組織を10〜15回洗浄するときに、このプロセスを繰り返します。

最終洗浄中にできるだけ多くのPBSを廃棄してください。次に、50ミリリットルのチューブで洗浄した結腸組織片に冷陰窩解離培地を加え、手で5〜10分間振とうします。細胞培養フードの下で、組織を含む培地を70ミクロンのナイロンセルストレーナーでろ過し、新鮮な50ミリリットルの遠沈管に入れます。

ろ過後、チューブを200 Gで室温で10分間遠心分離し、ペレット化された陰窩を乱すことなく上清を廃棄します。ペレットを3〜4ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。顕微鏡スライド上に一列に10マイクロリットルの陰窩懸濁液をピペットで入れる。

顕微鏡を使用して、完全で長い陰窩の数を数えて陰窩濃度を推定し、96ウェルプレートにマイクロリットルあたり10個の陰窩をプレートするのに必要な陰窩の適切な量を計算します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで適量の単離された陰窩を200 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、ペレット化された陰窩を破壊することなく、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して上清を除去します。

次に、気泡を導入せずにペレット化された陰窩に100マイクロリットルのゲルマトリックスを追加します。ゲルマトリックスが部分的に固まるまで1〜2分待ちます。次いで、10マイクロリットルのゲルマトリックスを予め加温した96穴培養プレートの各ウェル内の陰窩と混合したプレートがドーム形状を形成した。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%下のインキュベーターに入れて、ゲルマトリックスが完全に固まるまで10〜20分待ちます。最後に、抗生物質を添加したL-WRN培地の新たに調製した作業溶液100マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素下で24時間インキュベートします。オルガノイドを回収するには、真空吸引を適用してウェルから古い培地を取り除き、オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドで室温で1時間固定します。

次に、真空吸引によってウェルから4%パラホルムアルデヒドを除去し、オルガノイドをウェルあたり100マイクロリットルの30%スクロースで摂氏4度で処理します。24時間後、各ウェルに10マイクロリットルのPBSを加える前に、真空吸引によってウェルから30%スクロースを除去します。ピペットチップを使用してウェルの底を軽く引っ掻き、ドーム含有オルガノイドを解離します。

次に、解離したオルガノイドを含むPBSをピペットでウェルから取り出し、最適な切断温度(OCT)コンパウンドを90%充填したラベル付きプラスチックモールドに移します。すべてのオルガノイドがすべてのウェルから除去されるまで、このプロセスを続けます。ドライアイスペレットを含むステンレス鋼のデュワーフラスコに2-メチルブタンを加え、ペレットを覆うのに十分です。

OCTブロックを含むオルガノイドを2-メチルブタンの上に安定して保持することにより、瞬間凍結します。最後に、オルガノイド含有OCTブロックを摂氏マイナス80度で切断する準備ができるまで保管します。代表的な画像は、クローディン-7を含む通常の陰窩からのコロノイドの成長の成功を強調しています。

クローディン7を含む陰窩は、2日目までに回転楕円体を形成し始め、5日目に発芽し始め、9日目に収穫されるまで成長と発芽を続けました。対照的に、クローディン-7を欠く陰窩は適切なコロノイドを形成することができませんでした。4-ヒドロキシタモキシフェンで2〜3日間処理した後、クローディン-7ノックアウト陰窩は細胞の円形の塊として現れた。

対照とは異なり、陰窩は健康な回転楕円体に成長しませんでした。回収したコントロールおよび条件付きノックアウトオルガノイドにおけるクローディン-7の免疫蛍光染色により、培養におけるクローディン-7のノックアウトの成功が確認されました。対照のコロノイドは、9日目にアポトーシスシグナルをほとんど示さなかった。

しかし、クローディン-7ノックアウトコロノイドは同時に高いアポトーシスを示しました。めっきする前に部分凝固を確認してください。部分凝固前のメッキは、ゲルマトリックスを拡散させ、ドームが形成されず、陰窩の生存と成長に影響を与えます。

このプロトコルは、創薬、細胞コミュニケーション、薬物代謝、生存率、増殖の研究、および患者固有の個別化治療の開発に利用することができます。オルガノイド培養の確立は、病気の研究と個別化医療に革命をもたらしました。