Name: 未分化甲状腺癌および頭頸部扁平上皮癌の患者由来異種移植片モデルの確立と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学ぶ未分化甲状腺癌および頭頸部扁平上皮癌の患者由来異種移植片モデル確立法。腫瘍異質性と分子多様性を反映し、創薬スクリーニングや個別化医療に応用可能な高成功率の実験技術です。

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この作業は、四川省科学技術支援プログラム(助成金番号2019JDRC0019および2021ZYD0097)、卓越性分野のための1.3.5プロジェクト、四川大学西中国病院(助成金番号ZYJC18026)、卓越性分野のための1.3.5プロジェクト-四川大学西中国病院臨床研究インキュベーションプロジェクト(助成金番号2020HXFH023)、中央大学の基礎研究資金(SCU2022D025)、 成都科学技術局の国際協力プロジェクト(助成金番号2022-GH02-00023-HZ)、四川大学のイノベーションスパークプロジェクト(助成金番号2019SCUH0015)、および西中国病院-電子科学技術大学の医工統合のための人材訓練基金(助成金番号HXDZ22012)。

すべての動物実験は、四川大学西中国病院の施設動物管理および使用委員会によって承認された実験動物管理の評価および認定協会のガイドラインおよびプロトコルに従って実施されました。4〜6週齢(男女ともに)のNOD-SCID免疫不全マウスおよび4〜6週齢の雌Balb / cヌードマウスを本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。西中国病院の倫理委員会は、ヒトを被験者とした研究を承認しました(プロトコル番号2020353)。各患者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
1.実験の準備
<ol><li>使い捨ての刃物や滅菌したハサミやピンセットなど、腫瘍移植に必要な器具を用意し、超清浄な作業台に置き、事前に紫外線を照射してください。</li>
	<li>試験中に使用するための滅菌生理食塩水とペトリ皿を準備します。</li>
</ol>2.新鮮な腫瘍組織の取得と輸送
<ol><li>手術室から新鮮な腫瘍サンプル(通常はサイズが5 mm x 5 mmを超える)を入手し、滅菌HTK溶液( 材料の表を参照)または生理食塩水を含む15 mLまたは50 mLの遠沈管に入れます。遠沈管にラベルを付けます。 注:新鮮な腫瘍サンプルは、ATCまたはHNSCCの患者からの外科的除去または穿刺によって取得されました。</li>
	<li>遠沈管をあらかじめ用意したアイスボックスに入れます。 注:この間、移植オペレーターは移植に必要なアイテムを準備する必要があります( 材料表を参照)。</li>
	<li>サンプルの収集からPDX構築のためのラボへの輸送までの時間が2時間を超えないようにしてください。輸送中は、組織の活動を維持するために、組織を含むチューブを氷水混合物またはアイスパックで囲みます。</li>
</ol>3.腫瘍移植
<ol><li>腫瘍組織が検査室に到着したら、それらを記録して番号を付け直します。 注:本研究では、患者情報は厳重に機密に保たれました。手順の残りのステップは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボで実行されました。研究室に入るときは、作業服や防護服の上にスモック、帽子、マスクを着用することをお勧めします。腫瘍組織の治療はバイオセーフティキャビネットで行われます。</li>
	<li>腫瘍組織を含む遠沈管を75%アルコールで消毒し、手術台に置きます。滅菌した眼科用鉗子を使用して生理食塩水で満たされた6cmのペトリ皿に腫瘍組織を移します。次に、刃を使って約2 mm x 2 mmと3 mm x 3 mmの小片に切ります。</li>
	<li>腫瘍組織片を適量の生理食塩水を含む6cmのペトリ皿に移し、皿をシーリングフィルムで包み、アイスボックスに入れ、必要な器具(はさみ、鉗子、接種針)とともに特定の病原体のない(SPF)動物室に運びます。</li>
	<li>以下の手順に従って動物を準備します。<ol><li>4〜6週齢の雌または雄のNOD-SCID免疫不全マウスの右側胸部の毛を取り除き、75%アルコールで皮膚を消毒します。80 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンの腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ( 材料の表を参照)、乾燥を防ぐために獣医軟膏で目を塗ります。ペダル反射の喪失による麻酔の深さを確認します。</li>
		<li>マウスの右外側胸郭の中央にある皮膚を通してハサミで2mmの切開を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>ペトリ皿から腫瘍片を取り出し、鉗子で2.4 mm x 2.0 mmのトロカール針( 材料表を参照)に入れます。</li>
	<li>マウスを持ち、穿刺部位の皮膚を締め、腫瘍片を含むトロカールを使用して、最初の2 mmの皮膚切開から腫瘍を挿入し、肩の後ろに移動し、トロカールコアを押します。</li>
	<li>腫瘍片が押し出され、トロカール穿刺によって形成された移行洞に残っていることを確認してから、トロカールを引き抜きます。</li>
	<li>腫瘍を抜いたときに腫瘍が針と一緒に動く場合は、トロカールを使用して腫瘍をリセットし、切開部を縫合します。 注:この研究では、各マウスを背側前肢と後肢に接種しました。腫瘍サイズに基づいて各患者からの腫瘍サンプルあたり1〜3匹のマウスを接種した。</li>
</ol>4.腫瘍組織の保存、固定、およびタンパク質凍結
注:残りの腫瘍組織は、それぞれ種子の保存、固定、およびDNA/RNA/タンパク質の凍結に使用されました。
<ol><li>腫瘍表面が過度に濡れていないことを確認するために、凍結保存チューブに入れる前に滅菌ガーゼで腫瘍表面から生理食塩水を取り除きます。</li>
	<li>2 mm×2 mmの腫瘍組織を4〜6個入れ、90%ウシ胎児血清(FBS)と10%ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる凍結保存液1 mLをチューブに加え、チューブをグラジエント冷却ボックスに入れ、-80°Cで一晩凍結し、最後に 液体窒素に移します。</li>
	<li>病理学的検査のための組織固定のために、3 mm x 3 mmの腫瘍組織ブロックを10%緩衝ホルマリンに入れます。</li>
	<li>3 mm x 3 mmの組織ブロックを2 mLの細胞凍結保存チューブに入れ、液体窒素ですばやく凍結した後、DNA/RNAおよびタンパク質抽出のために-80°C冷蔵庫に移します。</li>
	<li>喫煙歴、腫瘍の大きさ、分化、病理学的サブタイプ、がんの悪性度、がんの病期、遠隔転移、起源、病歴、免疫組織化学、HNSCC患者のヒトパピローマウイルス(HPV)感染、治療薬などの患者の臨床情報を収集します。</li>
</ol>5. PDXモデル腫瘍の継代・凍結保存・蘇生
<ol><li>マウスの皮下腫瘍の長さと幅を週1回ノギスで測定し、腫瘍体積=長さ×幅2×腫瘍体積=0.5の式に従って腫瘍体積を算出する。腫瘍成長曲線を描きます。</li>
	<li>PDX腫瘍が2,000mm3に達したら、次世代のマウスに継代し、腫瘍再移植を行う。手順4に従って機器の準備を実行します。</li>
	<li>80 mg / kgのケタミンで麻酔した後、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>75%アルコールで皮膚を消毒します。次に、ハサミで腫瘍周囲の皮膚を切り取り、鉗子で腫瘍を取り除き、シャーレに入れます。</li>
	<li>ステップ3に続いて腫瘍移植手順を実行します。</li>
	<li>ステップ4に続いてPDXモデル腫瘍の保存と凍結保存を行う。</li>
	<li>腫瘍組織の蘇生のために、ゆっくり凍結と速い溶解の原則に従ってください。液体窒素からクライオバイアルを取り出した後、37°Cの水浴にすばやく入れて迅速に溶解させます。</li>
	<li>水浴中でクライオバイアルを静かに振って、解凍プロセスを加速します。</li>
	<li>解凍し、腫瘍片を洗浄のために準備された通常の生理食塩水に移し、次に次世代のマウスに接種する。具体的な手術については、ステップ3の組織移植手順をご覧ください。</li>
</ol>6. ATC PDXモデルにおけるレンバチニブとシスプラチンの治療効果の決定
注:ATC PDXモデルを使用して、チロシンキナーゼ阻害剤レンバチニブと化学療法薬シスプラチン25、26、27の治療効果をテストしました。
<ol><li>ATC PDXモデル(THY-017)のP5世代腫瘍組織を選択し、2〜4 mm 3組織片に切断し、4〜6週間の雌Balb/cヌードマウス10匹の右背面に皮下接種(ステップ3 )します。</li>
	<li>腫瘍体積が50〜150 mm 3のマウスを15匹選択し、それらを3つのグループに分けます。</li>
	<li>レンバチニブ(10 mg / kg)を1群に1日1回15日間胃内投与し、シスプラチン(3 mg / kg)を3日ごとに1群に腹腔内投与し、合計6回投与し、対照群には同量の生理食塩水を投与します。.</li>
	<li>マウスの体重と腫瘍体積を週に2回測定します。</li>
	<li>試験の最後に、マウスを安楽死させ(ステップ5.3)、腫瘍の重量を量る。</li>
</ol>

潜在的な利益相反は開示されていません。

本研究により、ATCとHNSCCの皮下PDXモデルの確立に成功しました。PDXモデル構築の過程で注意すべき点はたくさんあります。腫瘍組織が患者から分離されたら、それをアイスボックスに入れ、できるだけ早く接種のために検査室に送るべきです。腫瘍が検査室に到着した後、オペレーターは無菌フィールドの維持に注意を払い、無菌手順を実践する必要があります。針生検サンプルの場合、腫瘍組織が特に小さいため、サンプルをマトリックスゲルと混合した後の接種は、モデルの確立により役立ちます。原発腫瘍組織も、将来の研究のために可能な限り保存、固定、および凍結する必要があります。接種中は、使用前に腫瘍片をトロカールに入れた後、トロカール内の空気をできるだけ排出する必要があります。腫瘍接種後、腫瘍の成長はマウスで1〜4か月間観察されるべきであり、6か月以上腫瘍の成長がないマウスは安楽死させることができます29。
免疫不全マウスは、一般に、PDXモデル構築のための宿主として選択される29、<sup ...

PDXモデルは、ヒト腫瘍組織を免疫不全マウスに移植し、マウス1が提供する環境下で増殖させる動物モデルである。従来の腫瘍細胞株モデルには、不均一性の欠如、腫瘍微小環境を保持できないこと、in vitro継代の繰り返し中の遺伝的変異に対する脆弱性、臨床応用の不備など、いくつかの欠点があります2,3。遺伝子改変動物モデルの主な欠点は、ヒト腫瘍のゲノム特性の潜在的な喪失、新しい未知の突然変異の導入、およびマウス腫瘍とヒト腫瘍の間の相同性の程度を特定することの難しさです4。さらに、遺伝子改変動物モデルの作製は、費用と時間がかかり、比較的非効率的です4。
PDXモデルには、腫瘍の不均一性を反映するという点で、他の腫瘍モデルに比べて多くの利点があります。組織病理学の観点からは、マウスの対応物は時間の経過とともにヒト間質に置き換わるが、PDXモデルは原発腫瘍の形態学的構造をよく保存する。さらに、PDXモデルは、原発腫瘍のメタボローム同一性を少なくとも4世代にわたって保存し、腫瘍細胞とその微小環境との間の複雑な相互関係をよりよく反映しているため、ヒト腫瘍組織の成長、転移、血管新生、および免疫抑制のシミュレーションにおいてユニークです5,6,7.細胞レベルおよび分子レベルでは、PDXモデルは、ヒト腫瘍の腫瘍間および腫瘍内の不均一性、ならびに遺伝子発現パターン、突然変異状態、コピー数、DNAメチル化およびプロテオミクスなどの元の癌の表現型および分子特性を正確に反映しています8,9。継代の異なるPDXモデルは薬物療法に対して同じ感受性を有し、PDXモデルの遺伝子発現が非常に安定していることを示している10,11。研究によると、薬物に対するPDXモデルの反応とその薬物に対する患者の臨床反応との間には優れた相関関係があります12,13。したがって、PDXモデルは、特に薬物スクリーニングと臨床予後予測のための強力な前臨床およびトランスレーショナル研究モデルとして浮上しています。
甲状腺がんは内分泌系の一般的な悪性腫瘍であり、近年発生率が急速に増加しているヒトの悪性腫瘍です14。未分化甲状腺癌(ATC)は最も悪性の甲状腺癌であり、患者の生存期間の中央値はわずか4.8か月です15。中国では毎年甲状腺がん患者の少数派のみがATCと診断されていますが、死亡率は100%に近い16,17,18です。ATCは通常急速に成長し、頸部の隣接組織や頸部リンパ節に浸潤し、患者の約半数が遠隔転移を起こしています19,20。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、世界で6番目に多い癌であり、癌による死亡の主要な原因の1つであり、毎年推定60万人がHNSCCに罹患しています21,22,23。HNSCCには、鼻、副鼻腔、口、扁桃腺、咽頭、喉頭24の腫瘍を含む多数の腫瘍が含まれます。ATCとHNSCCは、主要な頭頸部悪性腫瘍の2つです。新規治療薬や個別化治療の開発を促進するためには、ATCやHNSCCのPDXモデルなど、堅牢で高度な前臨床動物モデルの開発が必要です。
本稿では,ATCとHNSCCの皮下PDXモデル確立の詳細な方法を紹介し,モデル構築における腫瘍採取率に影響を与える主要因子の解析を行い,PDXモデルと原発巣の病理組織学的特徴を比較した.一方、本研究では、臨床的関連性を検証するために、正常に構築されたPDXモデルを使用して in vivo 薬力学的試験を実施しました。

<table><tbody><tr><td>2.4 mm x 2.0 mm trocar</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-9065</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c ヌードマウス</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>401</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>蘇州安泰</td><td>BSC-1300IIA2</td><td></td></tr><tr><td>ブレード深</td><td>セン華陽バイオテクノロジー株式会社</td><td>18-0823</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>430791/430829</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存チューブ</td><td>成都天瑞実験器具有限公司</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK-Solution</td><td>Custodiol</td><td>2103417</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>D5879-500mL</td><td></td></tr><tr><td>電子天びん</td><td>ME104</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子デジタルノギス</td><td>Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd</td><td>0-220</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 26</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd.&nbsp;</td><td></td><td></td>100761663</tr><tr><td>レンバチニブ</td><td>ApexBio</td><td>A2174</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID 免疫不全マウス</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>406</td><td></td></tr><tr><td>ペン連鎖球菌</td>溶液 <td>生物産業</td><td>03-03101BCS</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>WHB</td><td>WHB-60/WHB-100</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水&nbsp;</td><td>四川ケルン</td><td>W220051705</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td>深<td>セン華陽バイオテクノロジー株式会社</td><td>18-0110</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セット</td><td>深セン華陽バイオテクノロジー株式会社</td><td>18-1241</td><td></td></tr><tr><td>獣医軟膏</td><td>ファイザー株式会社。</td><td></td><td></td>P10015353</tr><tr><td>Xylazine</td><td>Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd</td><td>070031777</td><td></td></tr></tbody></table>

未分化甲状腺癌および頭頸部扁平上皮癌の患者由来異種移植片モデルの確立と特性評価

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

患者由来異種移植片(PDX)モデルは、原発腫瘍の組織学的および遺伝的特徴を忠実に保存し、その不均一性を維持します。PDXモデルに基づく薬力学的結果は、臨床診療と高い相関があります。未分化甲状腺癌(ATC)は、甲状腺癌の最も悪性の亜型であり、浸潤性が強く、予後が悪く、治療が限られています。ATCの発生率は甲状腺癌のわずか2%〜5%を占めていますが、その死亡率は15%〜50%と高くなっています。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、最も一般的な頭頸部悪性腫瘍の1つであり、世界中で毎年60万人以上の新規症例があります。ここでは、ATCおよびHNSCCのPDXモデルを確立するための詳細なプロトコルが提示される。本研究では、モデル構築の成功率に影響を与える主要な要因を分析し、PDXモデルと原発腫瘍の病理組織学的特徴を比較しました。さらに、モデルの臨床的関連性は、首尾よく構築されたPDXモデルにおける代表的な臨床的に使用された薬物の in vivo 治療効果を評価することによって検証された。

甲状腺癌標本18例を移植し,未分化甲状腺癌4例,未分化甲状腺癌1例を含む5つのPDXモデルの構築に成功した(腫瘍採取率27.8%)。モデル構築の成功率と年齢,性別,腫瘍径,腫瘍悪性度,分化との相関を分析した。グレード4の腫瘍サンプルのモデル成功率は低グレードのサンプルよりも高く、未分化腫瘍サンプルの成功率も高分化サンプルよりも高かったが、相関分析の結果、これらの要因はPDXモデルの成功率と関連していないことが示された(表1).17個のHNSCCサンプルを接種し、HNSCCCの4つのPDXモデルを構築することに成功した。モデル構築における腫瘍採取率と腫瘍サンプルの臨床パラメータとの相関分析により、分化の程度はモデルの成功率と関連しているが、年齢、性別、喫煙歴、腫瘍直径、がん悪性度、転移、およびHPV感染は腫瘍採取率に影響しないことが示された(表2)。
各PDXモデルの腫瘍増殖曲線をプロットして、異なる患者からのPDXモデルの増殖速度をよりよく理解した(図1、...

本プロトコルは、PDXモデルがトランスレーショナルオンコロジーの分野で急速に標準になりつつあるため、未分化甲状腺癌(ATC)および頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の患者由来異種移植片(PDX)モデルを確立し、特徴付けます。

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

このプロトコルは、腫瘍の不均一性、分子の多様性をよりよく反映し、臨床転帰を予測するATCおよびHNSCC PDXモデルを確立するのに役立ちます。この手法は操作が簡単で、成功率が高く、他のPDXモデルにも適しています。この技術は、抗がん剤感受性スクリーニングに拡張して、がん患者の個別化治療を導くことができます。この手法を実行したことがない人は、いくつかの困難に遭遇する可能性があり、スキームの細部に注意を払うことをお勧めします。滅菌HTK溶液を含む50ミリメートル遠沈管でATCおよびHNSCC腫瘍サンプルを取得した後、75%アルコールで消毒します。滅菌した眼科用鉗子を使用して、腫瘍組織を生理食塩水で満たされた6センチメートルのペトリ皿に移し、ブレードを使用してそれらを小片に切断します。次に、生理食塩水を入れた新しい6センチのペトリ皿に移し、シーリングフィルムで包みます。包んだ皿をアイスボックスに置き、はさみ、鉗子、接種針で病原体のない動物の部屋に運びます。マウスに麻酔をかけた後、右側胸部の毛を取り除き、75%アルコールでその領域を消毒します。ハサミを使用して、右外側胸郭の中央に2ミリメートルの切開を行います。鉗子で、ペトリ皿から組織を取り出し、トロカール針に入れます。マウスを持ち、穿刺部位の皮膚を引き締めます。腫瘍片付きのトロカールを皮下腔の切開部に挿入し、肩の後ろに移動してトロカールコアを押します。滅菌ガーゼを使用して残りの組織を予約するには、腫瘍表面から生理食塩水を取り除き、過度に濡れていないことを確認します。4〜6個の組織片を2ミリリットルの細胞凍結保存チューブに入れ、1ミリリットルの凍結保存溶液をチューブに追加します。次に、チューブを勾配冷却ボックスに入れ、摂氏マイナス80度で一晩凍結します。最後に、液体窒素に移します。PDXモデル腫瘍の蘇生には、ノギスを用いて週に一度、皮下腫瘍の長さと幅を測定します。腫瘍体積を計算し、腫瘍成長曲線を描きます。次に、ハサミを用いて、腫瘍を囲む安楽死させたマウス皮膚を切断する。鉗子で腫瘍を取り除き、ペトリ皿に入れます。以前に実証したように、第5世代のマウスまで腫瘍移植を行う。P5世代ATC PDXモデルマウスの腫瘍組織を選択する。それを2〜4立方ミリメートルの小片に切ります。前に示したように、これらの断片を、ヌードの4〜6週間の雌のBALB / cマウスの右背中に皮下接種します。腫瘍が50〜150立方ミリメートルに成長したら、マウスを3つのグループに分けます。レンバチニブ、シスプラチン、コントロールを週2回投与した後、マウスの体重を測定します。また、腫瘍体積を測定します。相関分析の結果、ATC PDXモデル構築の成功率は、年齢、性別、腫瘍径、腫瘍悪性度、分化に依存しなかったことが示された。HNSCC PDXモデル構築における腫瘍採取率は、分化の程度がモデルの成功率と関連していることを示しましたが、他のパラメータは腫瘍採取率に影響を与えませんでした。各PDXモデルの腫瘍増殖曲線は、ATCサンプルがP3世代に安定して受け継がれたのに対し、HNSCCサンプルの2例はP1世代に移行した後に腫瘍を形成できなかったことを示しています。ほとんどのPDXモデルのP0世代の腫瘍増殖速度は、おそらくマウス微小環境の適応のために、後の継代よりも比較的遅かった。病理組織学的検査の結果,PDX腫瘍は原発巣の形態学的特徴を保持していることが示された。レンバチニブによる治療は、腫瘍増殖を有意に抑制し、対照群と比較してATC PDXモデルにおいてより低い腫瘍重量を示した。さらに、レンバチニブで治療されたマウスは、全体の体重に識別可能な変化を示さなかった。過剰なシスプラチン投与量は、体重減少および死によってさえ証明されるように、重大な毒性をもたらした。新鮮な腫瘍は、細かく切る前に通常の生理食塩水で数回洗浄する必要があります。生検された腫瘍サンプルと混合して接種すると、腫瘍が形成される可能性があります。このモデルは、腫瘍生物学研究、薬物スクリーニング、個別化治療に使用できます。

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Research

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