Name: 微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ微小血管断片を用いた三次元血管新生熱発生脂肪組織の培養法。単一細胞源で血管形成と脂肪組織形成を実現し、肥満や代謝疾患の治療開発に応用可能な簡便なベージュ脂肪の作製法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

アコスタ博士は、国立衛生研究所の助成金CA148724およびTL1TR002647によってサポートされています。ゴンザレス・ポラス博士は、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の支援を受けており、賞番号F32-0DK122754で報告されています。この研究は、国立衛生研究所(5SC1DK122578)とテキサス大学サンアントニオ校の生物医学工学科によって部分的にサポートされました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。図は部分的に Biorender.com で作成されました。

本研究は、動物愛護法および動物愛護規則施行規則に準拠して、実験動物の飼養及び利用に関する手引きの原則に従って実施された。すべての動物の手順は、テキサス大学サンアントニオ校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
注:以下に説明する手順では、オスのルイスラットが使用されます。雌およびマウス微小血管断片(MVF)コレクションについては、わずかなプロトコル調整を行う必要があります29。ヒトMVF(h-MVF)を使用するプロトコルの場合、必要なステップは、メーカーのプロトコルに従ったh-MVFの再懸濁、増殖培地の調製(1.3)、フィブリンヒドロゲルの形成(5)、および培養(6)のみです。プロトコルの概要については、 図 1 を参照してください。
<img alt="MVF形成図;試薬調製、脂肪単離、フィブリンヒドロゲル、MVF培養プロセス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:実験の概要。 MVFを用いた熱発生脂肪組織形成のための分析前の6つの重要なステップの内訳。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1. 試薬調製
注:以下の試薬は、1匹のラットに対応し、計量してバイオフード内で製造しました。
<ol><li>ウシ血清アルブミン(BSA)をPBSで調製します。<ol><li>洗浄ステップ(1 mg/mL、0.1%)および消化(4 mg/mL、0.4%)のために希釈するPBS中の10 mg/mL(1.0%)BSAを調製します。</li>
		<li>ステップ1.1.1-1.1.5に従って、ステップ1.1.1で述べたように、異なる濃度のBSAを準備します。</li>
		<li>10 mg/mL の BSA を PBS 溶液中に (1% の BSA を PBS 溶液中で)<ol><li>500 mgのBSAと500 mLのPBSを50 mLのコニカルチューブに加え、溶液をボルテックスしてBSAを溶解します。</li>
			<li>過剰な気泡が形成された場合は、溶液を350 x g で2分間遠心分離します。フィルター 0.22μmのナイロンネットフィルターで溶液を滅菌します。</li>
		</ol></li>
		<li>1 mg/mL の BSA を PBS 溶液中で (0.1% BSA を PBS 溶液中)<ol><li>500 mL滅菌ボトルで15 mLの10 mg/mL BSAをPBS中の135 mLのPBSに加え、15 mLの10 mg/mL BSAをPBSで1:10に希釈し、ボトルを静かに振って均一な混合物を確保します。</li>
		</ol></li>
		<li>4 mg/mL の PBS 溶液中の BSA (PBS 中の 0.4% BSA)<ol><li>100 mL滅菌ボトルに35 mLの10 mg / mL BSAをPBSで10 mL + 57.5 mLのPBSを加えて、35 mLの10 mg / mL BSAをPBSで1:2.5で希釈し、ボトルを静かに振って均一な混合物を確保します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ミンチ脂肪パッドの消化のためにBSAでコラゲナーゼを準備します。<ol><li>6 mg/mL のコラゲナーゼを準備します。<ol><li>50 mLのコニカルチューブで、72 mgのコラゲナーゼを量ります(「エピ用」のラベル)。</li>
			<li>3本の50 mLコニカルチューブに、それぞれ144 mgのコラゲナーゼ(「Ing 1用」、「Ing 2用」、および「SubQ用」のラベル)を量ります。</li>
			<li>秤量したコラゲナーゼは使用時まで4°Cで保存する。 注:消化直前までBSA / PBSを追加しないでください。</li>
			<li>72 mgのコラゲナーゼを含むチューブに、PBS中の4 mg/mL BSAを12 mL加えます。</li>
			<li>144 mgのコラゲナーゼを含むチューブに、PBS中の4 mg/mL BSAを24 mL加えます。</li>
			<li>チューブを振って均一な溶液を確保し、0.22μmのナイロンネットフィルターで溶液をろ過滅菌します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>アミノカプロン酸(ACA)を添加した増殖培地を準備して、単離されたMVFをフィード/分化させます。<ol><li><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li><ol><li></li><li> </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li> </li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li></ol></li></ol><img alt="マウス脂肪組織解剖図;鼠径部、精巣上体、および後部脂肪の位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> <img alt="50 mLのコニカルチューブ内の平均サンプル濃度を計算するための式。" src="/files/ftp_upload/64650/64650eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"></li><li></li></ol><img alt="ペレット、上清の分離、およびろ過のセットアップ手順を含む遠心分離プロセス図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> <ol><li><ol><li> <img alt="比率式 \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \)、実験セットアップでの計算。" src="/files/ftp_upload/64650/64650eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li><li> <img alt="希釈計算式、方程式;5/7 = X&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/1500 μL、教育化学図" src="/files/ftp_upload/64650/64650eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"></li><li> </li><li><ol><li> <img alt="化学実験室の計算で使用される希釈式 2/7=X1/250μL を示す式。" src="/files/ftp_upload/64650/64650eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"></li><li> <img alt="希釈計算に使用される比例式、5/7=X2/250μL。教育用の公式。" src="/files/ftp_upload/64650/64650eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"></li></ol></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><img alt="フィブリンヒドロゲル形成図におけるトロンビン活性化 ピペッティングフィブリノーゲン,MVF,37°C設定" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig04large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li></li></ol><img alt="血管新生と脂肪生成のタイムライン図:GM、WAM、BAMの14日間のプロセス比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="GMおよびWAM / BAMの誘導と成熟を詳述した血管新生と脂肪生成のタイムライン図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64650/64650fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64650/64650fig06large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Cohen, P., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+and+beige+fat%3A+molecular+parts+of+a+thermogenic+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine.</a> Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+transplantation+reverses+obesity+in+Ob%2FOb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice.</a> Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).</li>
<li>Tharp, K. M., Stahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+beige+adipose+tissue+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bioengineering beige adipose tissue therapeutics.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).</li>
<li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).</li>
<li>Kim, S. H., Plutzky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+and+browning+for+the+treatment+of+obesity+and+related+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolism+Journal%22%5BJournal%5D)">Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders.</a> Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).</li>
<li>Lizcano, F., Vargas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+beige+adipocyte+and+possible+therapy+for+type+2+diabetes+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity.</a> International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).</li>
<li>Mulya, A., Kirwan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+and+beige+adipose+tissue%3A+therapy+for+obesity+and+its+comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).</li>
<li>Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tissue-engineered+adipose+constructs+for+modeling+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease.</a> BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).</li>
<li>Srivastava, S., Veech, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+and+brite%3A+The+fat+soldiers+in+the+anti-obesity+fight%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight.</a> Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).</li>
<li>Samuelson, I., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+brown+adipose+tissue+in+a+human+in+vitro+context%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Studying brown adipose tissue in a human in vitro context.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).</li>
<li>Wang, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-engineered+human+brown-like+adipocytes+prevent+diet-induced+obesity+and+ameliorate+metabolic+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice.</a> Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).</li>
<li>Kaisanlahti, A., Glumoff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Browning+of+white+fat%3A+agents+and+implications+for+beige+adipose+tissue+to+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes.</a> Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Sato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+capillary+networks+from+rat+microvascular+fragments+in+vitro%3A+the+role+of+myofibroblastic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells.</a> Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).</li>
<li>Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+fragments%3A+More+than+just+natural+vascularization+units%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microvascular fragments: More than just natural vascularization units.</a> Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).</li>
<li>Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+microvessel+fragments+established+in+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology-Animal%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).</li>
<li>Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+approach+to+engineer+vascularized+adipose+tissue+using+microvascular+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).</li>
<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+alters+properties+of+vascularized+tissue-engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).</li>
<li>Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+adipocyte+organoid+model+using+isolated+human+microvessel+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments.</a> Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).</li>
<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+vascularized+beige+adipose+tissue+from+microvascular+fragments+of+models+of+healthy+and+type+II+diabetes+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions.</a> Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).</li>
<li>Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+beige+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering human beige adipose tissue.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).</li>
<li>Herold, J., Kalucka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+adipose+tissue%3A+The+interplay+between+adipose+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).</li>
<li>McCarthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat-On-A-Chip+models+for+research+and+discovery+in+obesity+and+its+metabolic+comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).</li>
<li>Klingelhutz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+generation+of+uniform+adipose+spheroids+for+metabolism+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery.</a> Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).</li>
<li>Yang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+active+three-dimensional+brown+adipose+tissue+engineered+from+white+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).</li>
<li>Vaicik, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+engineering+of+beige+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).</li>
<li>Tharp, K. M., Stahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+beige+adipose+tissue+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bioengineering beige adipose tissue therapeutics.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).</li>
<li>Tharp, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+transplantation+of+functional+beige+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue.</a> Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li>
<li>Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+as+vascularization+units+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+Function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: Function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+three-dimensional+brown+adipogenesis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells.</a> Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).</li>
<li>Dani, V., Yao, X., Dani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fat+tissues+and+iPSC-derived+energy+expenditure+adipocytes+to+counteract+obesity-driven+metabolic+disorders%3A+Current+strategies+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Endocrine+%26+Metabolic+Disorders%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives.</a> Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+as+vascularization+units+for+dental+pulp+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration.</a> Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).</li>
<li>McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+multilineage+potential+of+cells+derived+from+isolated+microvascular+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments.</a> Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).</li>
<li>Gealekman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+differences+and+insufficient+subcutaneous+adipose+tissue+angiogenesis+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity.</a> Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).</li>
<li>Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+diabetes+delays+perfusion+and+engraftment+of+3D+constructs+by+impinging+on+angiogenesis%3B+which+can+be+rescued+by+hepatocyte+growth+factor+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).</li>
<li>Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+arterio-venous+specification+in+engineered+vascular+tissues+in+a+perivascular+cell+recruitment-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner.</a> Biomaterials. 119, 23-32 (2017).</li>
<li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+from+aged+donors+exhibit+an+impaired+vascularisation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity.</a> European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).</li>
<li>Später, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+microvascular+fragment+isolates+from+visceral+and+subcutaneous+adipose+tissue+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice.</a> Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).</li>
<li>Später, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+from+male+and+female+fat+donors+exhibit+a+comparable+vascularization+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simpler%2C+the+better%3A+tissue+vascularization+using+the+body%27s+own+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources.</a> Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).</li>
<li>Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+co-culture+conditions+for+a+human+vascularized+adipose+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model.</a> Bioengineering. 7 (3), 114(2020).</li>
<li>Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipose+tissue+identification+and+marker+specificity-Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).</li>
<li>Chiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold+architecture+and+matrix+strain+modulate+mesenchymal+cell+and+microvascular+growth+and+development+in+a+time+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).</li>
</ol>

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

ブラウン/ベージュの脂肪組織工学の分野は、ほとんど未成熟であり22,23,24,25,26,27,28であり、脂肪モデルの大部分は白色脂肪組織用に開発されています8,22,31.操作された茶色/ベージュ色の微小組織は、典型的には、天然の褐色脂肪組織の表現型特性のサブセットを得るための複数の細胞源または遺伝的変化からなる8,11,32</...

このプロトコルの目的は、単一の潜在的に自己由来の微小血管断片(MVF)から血管新生ベージュ脂肪組織を開発するためのアプローチを説明することです。茶色とベージュの脂肪組織は、代謝調節に関連する有益な特性を示すことが実証されています。ただし、成人のこれらの脂肪組織デポーの量が少ないため、特に肥満や2型糖尿病などの病状では、全身代謝への潜在的な影響が制限されます1,2,3,4,5,6,7。肥満とその併存疾患に関連する有害な代謝効果を予防するための治療標的として、茶色/ベージュ色の脂肪に大きな関心が寄せられています8,9,10,11,12。
MVFは、脂肪組織から直接単離し、培養し、長期間にわたって三次元構成で維持することができる血管構造である13、14、15。私たちのグループや他のグループからの以前の研究は、特に脂肪組織形成に関連するように、MVFの多細胞および多能性能力を利用し始めています16,17,18。この研究の積み重ねとして、私たちは最近、健康な2型糖尿病のげっ歯類モデル19およびヒト被験者(50歳以上の成人)20に由来するMVFに、熱発生またはベージュ色の脂肪組織を形成するように誘導できる細胞が含まれていることを実証しました。
本明細書は、単一ソースMVFが利用される革新的なアプローチであり、ベージュ脂肪組織だけでなく、その関連する重要な血管成分21も作成することができる。この技術の使用は、熱発生脂肪組織形成のための簡単な組織工学的アプローチを探している研究にとって非常に価値がある可能性があります。ベージュ色の脂肪組織を設計することを目指す他の方法22、23、24、25、26、27、28とは異なり、この研究に記載されているプロセスは、複数の細胞型または複雑な誘導レジメンを使用する必要はありません。血管化されたベージュおよび白色脂肪モデルは、げっ歯類およびヒト由来のMVFで作成でき、大きな翻訳の可能性を示しています。このプロトコルの最終製品は、褐色脂肪組織に匹敵する構造と代謝機能を備えた操作されたベージュの熱発生脂肪組織です。全体として、このプロトコルは、簡単にアクセスでき、おそらく自家ソースMVFが、代謝障害を研究するための価値のある治療的介入およびツールである可能性があるという考えを提示します。

<table><tbody><tr><td>アミノカプロン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A2504-100G</td><td>DMEMに1 mg/mLの濃度で添加</td></tr><tr><td>鈍い先端はさみ</td><td>フィッシャー</td>科学 <td>12-000-172</td><td>オートクレーブで滅菌</td></tr><tr><td>ボビン血清アルブミン (BSA)</td> <td>ミリポア</td><td>126575-10GM</td><td>PBSで4 mg/mLおよび1 mg/mLに希釈</td></tr> コ<tr><td>ラゲナーゼ1型</td><td>フィッシャー科学</td><td>NC9633623</td><td>BSA 4 mg/mLで6 mg/mLに希釈、ミンチ脂肪の消化</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC230302500</td><td>エタノールで2mg/mlのストック濃度で希釈</td></tr><tr><td>使い捨てアンダーパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>23-666-062</td><td>手術中の体液吸収用</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>08-951-5</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>で滅菌ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;s ミディアム (DMEM)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;S Medium/Nutrient Mixture F-12 ハム (DMEM/F12)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>フィッシャー科学</td><td>16140089</td><td>DMEMで20%v/vに添加</td></tr>。<tr><td>フィブリノーゲン&nbsp;</td><td>シグマAldrich</td><td>F8630-25G</td><td>20 mg/mLの濃度でDMEMに可溶化、血漿およびハイドロゲルフラスコの主成分に含まれるタンパク質</td></tr><tr><td>、250 mL</td><td>フィッシャー科学</td><td>FB500250</td><td>大きな表面積を使用して脂肪の消化を可能にする</td></tr><tr><td></td><td>鉗子フィッシャー科学</td><td>50-264-21</td><td>オートクレーブで滅菌、組織およびフィルターの取り扱い用</td></tr><tr><td>フォルスコリン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>F6886</td><td>エタノールで10 mMのストック濃度で希釈</td></tr><tr><td>Human MVF</td><td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>本研究では、3人の患者(52歳、54歳、56歳の女性)から単離されたヒトMVF(hMVF)を使用しました。&nbsp;</td></tr><tr><td>インドメタシン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>エタノールで 12.5 mM ストック濃度で希釈</td></tr><tr><td>ブタ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>0.01 N HCl で希釈、ストック濃度 5 mg/ml</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>フィッシャー 科学</td><td>NC9023832</td><td>DMEM で 0.2% w/v、マイコプラズマ 予防&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>フィッシャー科学</td><td>15140122</td><td>DMEMに1% v/vに添加。</td></tr><tr><td>シャーレ、ポリスチレン(100 mm x 15 mm)。</td><td>フィッシャー科学</td><td>351029</td> 3は血管<td>の除去とミンチ、8(蓋)はスクリーンのプレソーキング用、8(皿)は500または37&マイクロでろ過するときに使用します。M</td></tr>は<tr><td>ペトリ皿、ポリスチレン(35 mm x 10 mm)をスクリーニングします。</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>50-202-036</td><td>フラグメントをカウントするため</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-190-250</td><td>滅菌脱イオン水で1倍に希釈。</td></tr><tr><td>ラットクリッパー(Andwinミニアルコペットトリマー)</td><td>フィッシャー科学</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>ロシグリタゾン</td><td>フィッシャー科学</td><td>R0106200MG</td><td>DMSOで10mMのストック濃度で希釈は</td></tr><tr><td>さみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14059-11</td>初期<td>切開用1個、精巣上体切開用1個、先端クリッピング用1</td></tr>個 <tr><td>画面&nbsp; 37 & マイクロ;M&nbsp;</td><td>カロライナバイオロジカルサプライ</td><td>カンパニー652222R3</td><td>インチの丸みを帯びた正方形にカットし、エチレンオキシドで滅菌、フラグメントの閉じ込めと非常に小さなフラグメント/単一細胞と破片の除去</td></tr>スクリーン<tr><td>500&micro;M&nbsp;</td><td>カロライナ生物供給会社</td><td>652222F</td><td>は、3インチの丸みを帯びた正方形にカットし、エチレンオキシドで滅菌し、より大きな破片/破片を除去し</td></tr>ます<tr><td>鋸歯状止血</td><td>フィッシャー科学</td><td>12-000-171</td>オート<td>クレーブで滅菌し、切開前の皮膚のクランプ用</td></tr><tr><td>Steriflipフィルター0.22&mu;m&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>フィッシャー科学</td><td>6051601KU</td>脱<td>イオン水で10 U / mLに希釈され、フィブリノーゲンをフィブリン</td></tr><tr><td>甲状腺ホルモン(T3)</td>に変える凝固剤として使用されます <td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>0.02 mMストック濃度で1N NaOHで希釈</td></tr><tr><td>Zucker糖尿病性脂肪(ZDF)ラット - 肥満(FA / FA)または痩せた(FA / +)男性&nbsp;</td><td>チャールズ川</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>チャールズ川(マサチューセッツ州ウィルミントン)から取得。ラットは4週齢で取得され、安楽死(15〜19週齢)までピュリナ5008を給餌しました。グルコースレベル(外側伏在静脈からの血液)は、研究で使用されたすべてのFA / FAラットで300 mg / dLを超えていました。.すべての動物は、12時間の明暗サイクルを備えた温度制御された環境に収容され、自由に給餌されました。</td></tr></tbody></table>

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

エンジニアリング熱発生脂肪組織(例えば、ベージュまたは褐色脂肪組織)は、代謝性疾患の潜在的な治療法として、または健康診断および薬物検査のための個別化された微小組織の設計のために研究されている。現在の戦略はしばしば非常に複雑であり、熱発生脂肪組織の多細胞および機能的特性を正確に完全に描写することができません。微小血管断片は、脂肪組織から単離された細動脈、細静脈、および毛細血管からなる小さな無傷の微小血管であり、血管新生および脂肪組織形成を可能にする単一の自家細胞源として機能する。この記事では、脂肪組織および培養条件から微小血管断片を分離するためのプロトコルを含む、微小血管断片から3次元、血管化、および機能的な熱発生脂肪組織を生成できるように培養条件を最適化する方法について説明します。さらに、ベストプラクティス、および操作された組織を特徴付けるための技術が議論され、げっ歯類とヒトの両方の微小血管断片からのサンプル結果が提供されます。このアプローチは、肥満や代謝性疾患の治療法の理解と開発に活用できる可能性があります。

ベージュ/褐色脂肪組織のいくつかの重要な表現型の形態学的特徴があります:それは多房性であり、小さな脂肪滴を含み、多数のミトコンドリアを所有し(生体内でその特徴的に「茶色がかった」外観の理由)、それに応じて高い酸素消費率/ミトコンドリア生体エネルギーを有し、高度に血管新生され、脂肪分解/インスリン刺激グルコース取り込みを増加させ、そして最も悪名高い、 熱発生呼吸に関与するミトコンドリアタンパク質である脱共役タンパク質1(UCP1)を高レベルで発現する19,30。
そこで、MVFのベージュ色の脂肪組織への分化能を特徴づけるにあたり、MVFの形質転換を可視化(図7、図8)、遺伝子確認(図9、図10)、機能測定(図11)...

ここでは、機能的な血管新生ベージュ脂肪組織を設計するための簡単なアプローチとして、げっ歯類またはヒト脂肪組織から分離された微小血管断片の使用を概説する詳細なプロトコルを提示します。

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

このプロトコルは、微小血管断片(MVF)からの三次元血管化および機能性熱発生脂肪の生成について説明しています。 熱発生脂肪組織を操作するための現在の戦略は複雑であり、その多細胞および機能的特性を完全には示していません。MVFは、血管新生と脂肪組織形成を可能にする細胞の単一の供給源です。MVFは、ベージュ色の脂肪の生物学的模倣を作成するための単純な唯一のソース方法であるため、肥満や代謝性疾患の治療法の理解や開発を促進する大きな可能性を秘めています。70%エタノールで処理した適切に剃毛および安楽死させた動物を仰臥位に置き、鼠径脂肪の分離を開始します。.ハサミで陰茎の下の皮膚を持ち上げ、中央から始めて横方向に切断し、V字型を形成してから、動物の裏側にループして脂肪沈着物全体にアクセスします。切断中は、相互接続された筋膜組織を切断することにより、脂肪から皮膚を確実に分離します。筋膜が適切に切断されたら、鼠径部から背中に向かって伸びる両側の鼠径脂肪が見えるようにします。次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムの濃度のPBSに10ミリリットルのBSAを含む別々の円錐形のチューブで両側から脂肪を取り除きます。精巣上体脂肪を収穫するには、腹部の皮膚を切り取り、続いて睾丸を囲む薄い層を注意深く切ります。鉗子を使用して脂肪組織をそっと引っ張り、目に見える主要な血管の解剖を避けながら、ハサミを使用して切り取ります。次に、除去した脂肪を、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。後部皮下脂肪を分離するには、ラットを伏せて大きなハサミで背中の厚い皮膚を頭皮まで切り、皮膚の下を深く切りすぎないように注意します。皮膚を組織に接続する筋膜を切ります。肩甲骨内領域にある皮下脂肪を脊椎に近い褐色脂肪と区別してから、皮下脂肪を分離して、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。バイオフード内で作業している間、鉗子を使用して、切除した脂肪をPBSの1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの0.5ミリリットルを含む標準の100ミリリットルのペトリ皿に入れます。脂肪から目に見える血管、筋肉、または無関係な組織を取り除きます。はさみを使用して、脂肪を10分間ミンチし、さらにBSAを追加してしこりがないか確認します。必要に応じてミンチを続けてから、ミンチ脂肪懸濁液を10ミリリットルのピペットで滅菌した250ミリリットルのフラスコに移します。PBSに十分なBSAを加えて、フラスコ内の容量を最大20ミリリットルにします。次に、PBS中のBSAをコラゲナーゼに加え、溶液を穏やかに振って均質化してから、0.22ミクロンのナイロンネットフィルターで滅菌ろ過します。直ちに必要量のコラゲナーゼ溶液を細切脂肪懸濁液に加え、フラスコを摂氏37度の水浴中で円を描くように振って脂肪を消化する。消化された脂肪を、消化脂肪またはミンチ脂肪とラベル付けされた50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを400 Gで4分間遠心分離し、微小血管断片(MVF)を赤いペレットにスピンダウンします。ペレットを乱すことなく、上清を廃棄物とラベル付けされた50ミリリットルの円錐形のチューブにそっとデカントします。次に、ペレットを入れたチューブにPBS中の1ミリリットル当たり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル加え、断片を乱すことなく2回穏やかに上下にピペッティングしてペレット懸濁液を混合する。次に、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを5ミリリットル含む滅菌ペトリ皿にあらかじめ浸した500ミクロンのスクリーンを取り、新しいペトリ皿に保管されているプラスチック製のスクリーンホルダーの上に置きます。消化されたペレットチューブから同心円状にスクリーン上に10ミリリットルの懸濁液をピペットで入れる。PBSで1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの追加5ミリリットルでフィルターを洗浄し、ろ液をペトリ皿内に保持しながら廃棄します。次に、事前に浸した37ミクロンのスクリーンを新しいペトリ皿のプラスチックスクリーンホルダーの上に置きます。新しいピペットを使用して、最初のろ過から同心円でスクリーンにろ液を移します。前述のように、PBSのBSAでスクリーンを洗浄し、今度は37ミクロンのスクリーンを保持したまま濾液を廃棄します。37ミクロンのスクリーンを、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAが5ミリリットル入った新しいペトリ皿にスライドさせます。液体をこぼさずに、皿を円錐形のホルダーにそっと叩いて破片を取り除きます。PBSでさらに5ミリリットルのBSAでフィルターをすすぎます。次に、ペトリ皿から滅菌50ミリリットルの円錐管に液体を移します。37ミクロンのスクリーンをさらに数回すすぎ、収集された総量が15〜20ミリリットルになるまでコニカルチューブに洗浄を追加します。最後のすすぎの後、スクリーンを破棄します。ハサミを使用して20マイクロリットルのピペットチップの端を切ります。カットされたピペットチップを使用して20マイクロリットルの2つのアリコートを引く前に、液体を含むチューブを静かに振って、各アリコートをきれいな35ミリメートルのペトリ皿にピペットで入れます。標準的な光学顕微鏡を用いて各シャーレ中の試料中の断片の数を数え、そして原稿に記載された式を用いて、単離された微小血管断片の総数を得る。50ミリリットルのコニカルチューブ内の残りの液体を400Gで4分間回転させてMVFを収集します。回転後、円錐管から上清の大部分をデカントし、ピペットを使用して管の縁に残っている少量の液体を除去します。次に、キャストゲル用に指定されたウェルにトロンビンを追加します。200マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、それを使用してMVFをフィブリノーゲンに静かに再懸濁し、目的の最終密度を得ます。懸濁液をウェル内のトロンビン溶液にピペットで入れ、上下にピペッティングして混合物を素早くホモジナイズします。すべてのゲルをキャストしたら、ウェルプレートを摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに約15分間置き、ゲルの架橋を可能にします。脂質および分化脂肪細胞を、脂質染色剤としてBODIPYを用いたヒドロゲルの共焦点顕微鏡イメージングによって観察した。白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて非血管化脂肪組織を培養すると、痩せた齧歯類および糖尿病性のげっ歯類由来のMVFの両方から、それぞれ血管化されていない白色またはベージュの脂肪組織が形成された。同様に、白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて血管新生脂肪組織を培養すると、げっ歯類由来のMVFからそれぞれ血管化された白色脂肪組織またはベージュ脂肪組織が形成された。 ヒトMVFから得られた非血管化白色およびベージュ脂肪組織も共焦点顕微鏡によって観察された。MVFのベージュ脂肪組織への分化能は、RT-qPCRを用いて遺伝的に確認された。 直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地に曝露された除脂肪および糖尿病のげっ歯類MVFは、脂肪生成、熱発生および血管新生について評価された。予想通りの脱共役タンパク質1の発現は、ベージュ色の脂肪生成組織において有意に高かった。同様の傾向は、間接的な白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたげっ歯類MVF、および直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたヒトMVFでも観察されました。.最後に、ミトコンドリアの生体エネルギー学から、機能的には、ベージュ色の脂肪組織はすべてのケースで特徴的に高い酸素消費率(OCR)レベルを持っていることが明らかになりました。脂肪組織の酵素消化は、同様のサイズと品質のMVFを一貫して再現するように最適化する必要があります。消化後、MVFは、断片がさらに分解しないように特別な注意を払って、穏やかに取り扱う必要があります。この技術は、血管の成長と脂肪細胞の分化のバランスを促進するのに役立ち、導入された要因に依存することが証明されました。

three-dimensional-culture-vascularized-thermogenic-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、腹腔内脂肪組織での熱産生のために脂質を消費し、肥満マウスのエネルギー散逸を増加させる異化細胞のカプセル化のためのプロトコルを提示します。...

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

我々は、有望な血管新生単位を表し、脂肪組織由来の微小血管断片を単離するためのプロトコルを提示します。それらはインビトロ処理に必要とせず、従って、組織工学の異なる分野でワンステップprevascularizationために使用することができる、迅速に分離することができます。...

組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス...

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。...

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

現在の研究の焦点は、脂肪組織のアーキテクチャと細胞成分の 3 D...

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。...

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in...

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。...

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

ここでは、ヒト皮下脂肪組織(hSATMVEC)から微小血管内皮細胞を単離、培養、および表現型決定するためのプロトコールについて説明します。さらに、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについても説明します。...

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

学ぶ微小血管断片を用いた三次元血管新生熱発生脂肪組織の培養法。単一細胞源で血管形成と脂肪組織形成を実現し、肥満や代謝疾患の治療開発に応用可能な簡便なベージュ脂肪の作製法です。

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

さらに動画を探す