Name: 拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ拡大顕微鏡を用いたショウジョウバエ胚全体拡張による超解像イメージング手法。通常の共焦点顕微鏡で回折限界を超えた高解像度観察が可能となり、タンパク質の局在や細胞形態を詳細に解析できます。

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モルモット抗Par-3一次抗体を提供してくださったJennifer Zallen博士に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)のメンバーの1つである国立総合医学研究所(NIGMS)と、共焦点顕微鏡の購入に一部資金を提供してくれたアーカンソー生物科学研究所(ABI)からの寛大な資金(1R15GM143729-01および1P20GM139768-01 5743)によって支援されました。

<ol><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging.+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
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<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chang, J. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li>
<li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347(2017).</li>
<li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li>
<li>Yu, C. -C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249(2020).</li>
<li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+in+ionic+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li>
<li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Drosophila+apple+juice-agar+plates%22">Drosophila apple juice-agar plates</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).</li>
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<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: 
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<li>Paré, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+molecular%2C+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li>
<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502(2017).</li>
<li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73(2021).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
<li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+revealing%3A+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

手動デビテリン化 ほとんどの ショウジョウバエ の胚の固定のプロトコルは浸透圧の破裂によって破裂させるメタノールおよびヘプタンの乳剤の固定胚の振とう によって vitellineの膜を取除くことを含む26。メタノールベースのデビテリン化(メタノールポッピング)は多くの用途に効果的で適切ですが、手動のデビテリン化(ハンドピーリング)にはいくつかの大きな利点があります。まず、手作業で皮をむくことで、正確にステージングされた胚を選択してデビテリン化して採取することができ、実験の最後に使用可能な向きで増殖した胚を得る可能性が大幅に高まります。この濃縮は、急速な発生過程(例えば、中胚葉の陥入や収斂伸長)の特定の側面を研究する場合に重要であり、適切にステージングされた胚は、タイトなタイミングの収集期間内であっても、すべての胚の数パーセントしか占めない可能性があります。もちろん、多くの用途では、時限収集ウィンドウから胚をバルクメタノールでポップするだけで十分であり、手作業で皮をむくことは余分な労力に見合わない場合があります。第二に、特定の一次抗体および色素の結合は、サンプルのメタノールへの以前の曝露によって悪影響を受けます。このため、ハンドピーリングは、メタノールポップサンプルと比較して免疫蛍光シグナル品質を大幅に向上させることができ、ショウ ジョウバエ の発生生物学者にとって有用な一般的な手法となっています。
ショウジョウバエの胚全体拡大における高分解能共焦点顕微鏡 膨張した試料で高分解能共焦点顕微鏡を行うことは、概念的には非拡大試料で行うのと同じですが、ExMにはいくつかの技術的なハードルがあります。特に、高倍率、高NA対物レンズはカバーガラス27に非常に近いサンプル領域からのみ光を集束させることができるため、サンプルサイズが大きくなるにつれて、ランダムである胚の配向がさらに重要になります。したがって、通常、ゲルが形成されたときにカバーガラスに隣接して終わった胚の表面または表面近くの細胞に焦点を合わせることしかできません。最後に正しい向きの標本があることを確認する最善の方法は、固定胚の厳密な段階的コレクションからExMプロトコルを開始し(例:手剥離を使用)、各ウェルに多くの胚を播種することです(>10)。胚の内部の深部にある細胞を可視化するには、ライトシート顕微鏡28のような、より特殊なイメージング装置を利用する必要があるかもしれない。さらに、共焦点ピンホールをエアリーユニット1台分よりも大きいサイズに開くことで画質を向上させることができることがわかりました。もちろん、ピンホールサイズを大きくすると、最大分解能が低下しますが、実際には、ピンホールサイズをわずかに増やすだけでも信号強度を大幅に向上させることができます(データは示されていません)。今後の研究では、ExMサンプルのピンホールサイズと効果的な分解能を体系的に取り上げる必要があります。
基本的なExMのバリエーション ここで説明するプロトコルは、ExMの比較的単純な例であり、多くのアプリケーションで機能し、ほとんどの発生生物学ラボで簡単に実装できるはずです。しかし、ExM 4,5,7の基本概念には多くのバリエーションがあり、シグナル強度を高めたり、さらなる膨張度を達成したり、タンパク質だけでなく核酸分子を検出したりするために使用できます。このプロトコルでは、胚はゲル化および拡張の前に抗体とインキュベートされます。あるいは、サンプルを増殖させた後に抗体で処理することもでき6,30、これはエピトープへのアクセス性を高め、増殖ステップ中に結合した抗体の損失を減らすことでシグナル強度を高めることができる。さらに、特定の架橋剤分子を使用してRNA分子をヒドロゲルに結合させ、ハイブリダイゼーション連鎖反応方法30を使用して膨張ゲル中のRNAの検出を可能にすることができる。最後に、反復拡大顕微鏡法(iExM)31、汎ExM32、拡大露析(ExR)31のように、サンプルを複数回拡大することで、さらに高い分解能向上を達成することができます。

細胞生物学や発生生物学では、百聞は一見にしかず、タンパク質の局在パターンを正確に決定する能力は、多くの種類の実験の基本です。レーザー走査型共焦点顕微鏡は、インタクトサンプル内の蛍光標識タンパク質を3次元でイメージングするための標準ツールです。従来の共焦点顕微鏡では、発する光の波長の2分の1以下しか離れていない隣り合う蛍光シグナルを区別(分解)することができませんでした1。言い換えれば、2つの点光源を2つの異なる信号として分解するには、横方向に少なくとも200〜300nm(軸方向に500〜700nm)離れている必要があります。この技術的障壁は回折限界として知られており、回折限界を下回る空間的特徴を持つ複雑な細胞内構造(アクトミオシンの細胞骨格網やミトコンドリア網など)を研究する上での根本的なハードルとなっています。したがって、従来の共焦点顕微鏡の解像力を高めるための技術は、生物学界にとって一般的な関心事です。
回折限界を回避するために、数十ナノメートル以下の分解能を可能にするさまざまな超解像顕微鏡技術が開発され1,2,3、以前は電子顕微鏡でしかアクセスできなかった生物学的複雑さの世界が明らかになりました。これらのハードウェアベースの方法には明らかな利点がありますが、超解像顕微鏡は、特定のサンプルラベリング要件と長い取得時間を持つことが多く、柔軟性が制限されたり、一部のラボではアクセスするには高価すぎる場合があります。顕微鏡ベースの超解像法に代わるのが拡大顕微鏡法(ExM)であり、これはそれ自体が顕微鏡の一種ではなく、構成分子の相対的な空間構成を維持しながらサンプルを膨潤させる方法です4。等方的に拡大したサンプルは、従来の蛍光共焦点顕微鏡を使用して、効果的に高められた分解能で観察することができます。ExMは2015年にBoydenグループによって最初に報告され5、それ以来、基本的な手法はさまざまな実験での使用に適応されています6,7,8。ExMは、特にショウジョウバエ9,10,11、C.エレガンス12、ゼブラフィッシュ13などのホールマウント胚での使用にも適応されており、発生生物学者にとって強力なツールとなっています。
ExMは、2つの異なるハイドロゲルの化学的性質に基づいています:1)水に浸すとサイズが大幅に大きくなる膨潤性高分子電解質ハイドロゲル14、および2)ポリマー間隔が非常に小さく、等方的なサンプル膨張を可能にするポリアクリルアミドハイドロゲル15。多くのExMプロトコルが公開されていますが、一般的には、サンプルの固定、標識、活性化、ゲル化、消化、および増殖のステップを共有しています4。固定条件と蛍光標識戦略は、もちろん実験とシステムのニーズによって異なり、一部のプロトコルでは、増殖後に標識が行われます。サンプル中の標的分子は、ヒドロゲルに結合するためにプライミング(活性化)されなければならず、これは異なる化学的性質を用いて達成することができる4。ゲル化ステップでは、サンプルを将来のハイドロゲルのモノマー(アクリル酸ナトリウム、アクリルアミド、架橋剤ビスアクリルアミド)で飽和させ、過硫酸アンモニウム(APS)などの開始剤やテトラメチレンジアミン(TEMED)などの促進剤によって触媒されるフリーラジカル重合によってヒドロゲルが形成されます4。ゲル化後、試料を酵素的に消化して、膨潤に対する試料耐性を均質化し、ヒドロゲル4の等方性膨張を確保する。最後に、消化されたヒドロゲルを水中に入れると、元の線状サイズの約4倍に膨張します4。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> 図1: ショウジョウバエ 胚の増殖顕微鏡法の概要。 ExM は、完了するまでに少なくとも 4 日かかるマルチステップ プロトコルです。胚の採取、固定、およびデビテリン化は、複数のコレクションからの胚がプールされているかどうかに応じて、1日以上かかります。免疫蛍光標識には、胚を一次抗体と一晩インキュベートするかどうかに応じて、1日または2日かかります。胚の活性化、ゲル化、消化、増殖を1日で行うことができます。ゲルは増殖後すぐにマウントしてイメージングできますが、実用的な理由から、翌日からイメージングを開始することが望ましいことがよくあります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルは超解像(図1)で細胞内蛋白質のローカリゼーション パターンを視覚化するために中間段階のショウジョウバエの胚16に全台紙の早いのExMを行う方法を記述する。この方法は、メチルアクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MA-NHS)化学を使用してタンパク質分子を活性化し、ヒドロゲルに固定します17、これは、後期のショウジョウバエの胚および組織で使用するために以前に公開されたExMプロトコルの修正です11。このプロトコルでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ウェルを使用してヒドロゲルを成形し、活性化およびゲル化中の溶液交換を促進します。PDMSウェルの作成を必要としない代替方法は、カバーガラスに付着した胚を、実験室用シーリングフィルム22の断片上に座っているモノマー溶液の滴に下げることを含む。さらに、このプロトコルはimmunofluorescenceの汚損のための前提条件であるショウジョウバエの胚を囲む不浸透性のvitellineの膜を手動で取除くための方法を記述する。重要なことに、この手作業で胚を剥離する方法は、サンプルの標識の前に適切にステージングされたショウジョウバエの胚のみを選択するために使用でき、正しいステージと向きの拡張サンプルで終わる可能性が大幅に高まり、ダウンストリームのデータ収集がはるかに効率的になります。

<table><tbody><tr><td>アクリルアミド</td><td>ミリポア シグマ</td><td>1490-100ML</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>VWR</td><td>BDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP ウサギ ポリクローナル抗体</td><td>トーリー パインズ バイオラボ</td><td>TP-401</td><td></td></tr><tr><td>抗モルモット IgG ヤギ ポリクローナル抗体、アレクサ フルーア 568</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>A-11075</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG ヤギ ポリクローナル抗体、アレクサFluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>bisacrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11275</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (30% 溶液)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>conical tubes, 50 mL</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>カバーリップガラス、正方形22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップガラス、長方形40 mm x 24 mm</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>針を引っ張るためのガラス毛細血管</td>World <td>Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>ガラスマイクロインジェクション針(引き抜き済み)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>guanidineHCl</td><td>VWR</td><td>101970-606</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>VWR</td><td>EM-HX0078-1</td><td></td></tr><tr><td>ラテックス ピペット球根</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>メチルアクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル</td><td>VWR</td><td>730300-1G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージチューブ、1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェルプレート、6ウェル</td><td>Genesee</td><td>25-100</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (16%、EM グレード、メタノールフリー)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>509804487 (Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット (2 mL、ショートチップ)</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>PDMS キット (Sylgard 184 キット、ベースおよび硬化剤)</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>Genesee</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(10倍溶液)</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液(0.1%溶液)</td><td>VWR</td><td>P8920-1ooML</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E00491</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル(30 mL)</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td></td></tr>アクリル<tr><td>酸ナトリウム</td><td>VWR</td><td>101181-226</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム(粉末)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>71289</td><td>は、この濃度で1%のw / vワーキングストックを作ります;急性毒!</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、アレクサフルオア 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>TAE (50x)</td><td>VWR</td><td>97063-692</td><td></td></tr><tr><td>テープ (両面、1インチ幅)</td><td>スコッチ&nbsp; 3M</td><td>665 スコッチ両面 1インチ/1296インチ ボックス</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI17919</td><td></td></tr><tr><td>テンポ</td><td>VWR</td><td>EM8.14681.0005</td><td>触媒酸化剤</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>97063-872</td><td>純度が高い場合、水で 10% の作業ストックを作成します。</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900</td><td>Zeiss</td><td></td><td>レーザー走査型顕微鏡を AiryScan なしで使用</td></tr></tbody></table>

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

発生生物学の主力は共焦点顕微鏡であり、研究者は複雑な生体サンプル内のタグ付き分子の3次元局在を決定することができます。従来の共焦点顕微鏡では、数百ナノメートル離れた2つの隣接する蛍光点源を分離することができますが、細胞内生物学のより細かい部分を観察するには、数十ナノメートルオーダーのシグナルを分離する能力が必要です。超解像顕微鏡法は、研究者がこのような分解能の限界を回避できるように、ハードウェアベースの手法が数多く開発されていますが、これらの手法には特殊な顕微鏡が必要であり、すべての研究者が利用できるわけではありません。分解能を高める別の方法は、2015年にBoydenグループによって最初に報告された拡大顕微鏡法(ExM)と呼ばれるプロセスを通じて、サンプル自体を等方的に拡大することです。ExMは、 それ自体 が顕微鏡の一種ではなく、構成分子の相対的な空間構成を維持しながらサンプルを膨潤させる方法です。拡大したサンプルは、従来の共焦点顕微鏡を使用して効果的に高められた分解能で観察することができます。ここでは、ショウ ジョウバエ の胚全体にExMを実装するためのプロトコルについて説明し、表面上皮細胞内のPar-3、ミオシンII、およびミトコンドリアの局在を調べるために使用されます。このプロトコルにより、サンプルサイズが約4倍に増加し、従来の共焦点顕微鏡では見えなかった細胞内の詳細を検出できます。原理の証明として、抗GFP抗体を使用して隣接する細胞皮質間のミオシン-GFPの異なるプールを区別し、蛍光標識ストレプトアビジンを使用して内因性ビオチン化分子を検出して、ミトコンドリアネットワーク構造の細部を明らかにします。このプロトコルは、蛍光標識に一般的な抗体と試薬を利用しており、多くの既存の免疫蛍光プロトコルと互換性があるはずです。

ショウジョウバエの胚全体におけるExMの一般的な有効性を特徴付けるために、頭から尾までの軸に沿った胚の長さを、非増殖対照胚と増殖胚で測定しました(図3A-C)。未増殖対照胚は、イメージング前に固化封入培地を用いてマウントした以外は、増殖胚と同じ固定条件および免疫蛍光標識ステップに供した。個々の未増殖胚は、10倍の対物レンズを使用した場合、視野の約半分に及びました(図3A)。対照的に、増殖した胚は、同じ10倍の対物レンズを使用した場合、約2つの全視野に及びました(図3B)。実験内および実験間で増殖の程度がどのように変化するかを評価するために、同じExMプロトコルを3回に分けて実施し、個々の実験内で3つの異なるゲルで胚の長さを測定しました。未増殖対照胚の平均頭から尾までの長さは398.8μmであった(標準偏差[SD] = 22.93 μm;n = 74;図3C)。実験1、実験2、実験3の平均胚長は、それぞれ1,596 μm(SD = 159.9 μm;n=57)、1,868 μm(SD = 150.5 μm;n=51)、1,954 μm(SD = 120.3 μm;n=44)であり、それぞれ4.0倍、4.7倍、4.9倍の膨張率を示しました(図3C)。ゲル間の実験内変動は、実験間変動(約20%)よりもはるかに目立たなかった(図3C)。細胞および胚の形態に対するExMの影響を評価するために、接着結合成分Par-3(Bazooka)21に対する抗体を使用して頂端細胞膜を標識し、ステージ11のショウジョウバエ胚(複雑なセグメント構造を持つステージ)の発育中の口セグメントを画像化しました(図3D-F)。対照試料において、上顎セグメントの細胞の平均幅は4.76μmであった(SD = 1.053 μm、n = 25;図3D、F)。同じ40倍対物レンズとズーム倍率(1倍)を使用してイメージングされた拡大サンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は19.10 μmでした(SD = 3.966 μm、n = 18;図3E,F)は、4.0倍の拡大を表しています。したがって、以前のレポート11と一致して、ExMを使用して、サンプルの引き裂きや細胞または組織の形態の明らかな歪みなしに、ホールマウントのショウジョウバエ胚を直線寸法で約4倍に拡大することができました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> 図3:ショウ ジョウバエ 胚の4 倍拡大。 (A)非増殖および(B)拡大ショウ ジョウバエ 胚は、1倍ズームで10倍対物レンズ(0.3 NA)を使用して画像化されました。個々の視野 (FOV) は破線で示されます。胚はGFPタグ付きミオシン軽鎖を発現し、抗GFP抗体で染色した。(C)実験ごとに3つのハイドロゲルで、3つの別々のExM実験から、未増殖対照と比較した胚の長さ(頭から尾の軸に沿った)の定量化。(D、E)(D)非拡張および(E)拡大ステージ11の ショウジョウバエ 胚の上顎セグメントを、1倍ズームで40倍対物レンズ(1.3 NA)を使用して画像化しました。細胞の輪郭(接着接合部)は、抗Par-3/Bazooka抗体(白色)で検出しました。(F) (D) と (E) の同等のセル群からのセル幅 (長軸) の定量化。(C)と(F)の箱ひげ図は、25、50、75パーセンタイルの範囲を示しています。ひげは最小値と最大値を示します。「+」記号は平均を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
ExMを使用して典型的な回折限界を下回る細胞内の詳細を解析できることを実証するために、アクトミオシン細胞骨格を非拡張対照と収斂伸長(ステージ7)を受けた増殖胚でイメージングしました。原腸形成および収束伸展の組織リモデリング事象は、主にモータータンパク質ミオシンII24の局在の変化によって制御される。しかし、ショウ ジョウバエ 前期の外胚葉の密集した円柱状上皮では、レーザー走査型共焦点顕微鏡の典型的な最大解像力である158倍の倍率(2.5倍の光学ズームで63倍の対物レンズ)で画像化しても、ミオシンIIの局在パターンの多くの細部を観察することは困難です。例えば、ミオシンIIは皮質タンパク質(原形質膜の真下に位置する)であるため、細胞間接触の両側に位置するミオシンII25 のプールは、ステージ7の胚では分解できず、隣接する細胞が出会う単一の線として現れました(図4A)。対照的に、拡大したステージ7の胚では、ミオシンIIの平行線が細胞間接合部に観察され、隣接する細胞の皮質タンパク質プールを表しています(図4B)。拡大試料中の平行ミオシンII系統間の距離は892.7 nm(SD = 0.171 nm、n = 12)であった。これを4で割ると、未増殖胚の隣接細胞のミオシン株間の予測距離は~220 nmとなり、Alexa 488で検出されたシグナルの回折限界(~520 nm/2 = 260 nmのピーク発光)をわずかに下回っています。
さらに、ショウジョウバエの胚(ステージ6)の高密度細胞におけるミトコンドリアネットワーク構造の解明にExMを使用できるかどうかも検証しました。ミトコンドリアの機能はネットワーク構造と密接に関連しています(つまり、融合した細胞小器官と断片化された細胞小器官)が、ミトコンドリアネットワーク構成の詳細を従来の共焦点顕微鏡で可視化することは困難でした。ミトコンドリアはビオチン化分子を自然に豊富に含んでいるため、ミトコンドリアはショウジョウバエの初期胚において、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて標識することができる26。ストレプトアビジン-Alexa 488で標識された未増殖期の6期胚では、シグナルは細胞質点として現れ、しばしば重なり合って解決が困難でした(図4C)。対照的に、拡大した第6期の胚では、ミトコンドリアネットワークのより細かい詳細が見え、プンクタはより簡単に解決可能になりました(図4D)26,27。これらの結果は、ExMが従来ミトコンドリア解析に適していなかった細胞種のミトコンドリアネットワーク構成の研究に使用できることを示しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> 図4:拡大顕微鏡で明らかになったアクトミオシン細胞骨格とミトコンドリアの詳細。 (A,B)ステージ7の2.5倍ズームで63倍対物レンズ(1.4 NA)でイメージングした神経外胚葉(生殖細胞)細胞におけるミオシンII局在(A)非拡大胚と(B)拡張胚。ミオシンIIは、ミオシンII調節軽鎖(sqh-GFP)のトランスジェニックGFPタグ付きバージョンを発現する胚で検出され、抗GFP抗体(赤)で検出されました。隣接する細胞にある皮質ミオシンの明確なプールは、拡張された胚(白い矢印)で解決できます。(C、D)神経外胚葉細胞のミトコンドリアネットワークを、ステージ6の未拡張(C)および拡張(D)胚で2.5倍ズームで63×対物レンズ(1.4 NA)でイメージングしました。ミトコンドリアはストレプトアビジン-Alexa 488(緑色)で検出し、細胞の輪郭は抗Par-3/バズーカ抗体(マゼンタ)で検出しました。実験はレーザー走査型共焦点顕微鏡で行われました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:溶液レシピ。 このプロトコルで使用される溶液の組成を出現順に示します。特に断りのない限り、すべての株式は液体です。化学物質は、特に断りのない限り、オートクレーブ滅菌したろ過水で再懸濁または希釈しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、ショウ ジョウバエ の初期胚に拡大顕微鏡を導入し、従来のレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて超解像イメージングを実現するためのプロトコルを紹介します。

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

このプロトコルは、ほとんどの食道発生生物学研究室で実施できるため、超解像顕微鏡にアクセスできない研究者でも超解像画像を作成できます。この技術の主な利点は、研究者がサンプル自体を拡大することで、超解像顕微鏡を必要とせずに従来の共焦点顕微鏡の回折限界をバイパスできることです。このプロトコルは蛋白質のローカリゼーションが細胞形態にいかに影響するか、またはそれらの蛋白質が複雑な細胞下構造かネットワークに組織されるとき、無傷の胚の機能をいかに調査するか調査するそれらのために有利である。人々が遭遇する最も一般的な問題は、プロトコル全体で胚を失うことです。胚をしっかりと接着させるために、ポリ-L-リジンを複数回塗布することをお勧めします。胚の後、半分に3%寒天を詰めた6センチメートルのプラスチック製のペトリ皿ベースを取ります。寒天に5×3センチの長方形をカミソリの刃またはメスで切り込みを入れます。小さなラボスパチュラを使用して寒天スラブを取り除きます。次に、ペトリ皿の底をひっくり返してベンチに置き、逆さにした皿の上に寒天スラブを置きます。ペトリ皿から蓋を外し、乾いていることを確認します。手袋をして、蓋の内側に両面テープを貼ります。コーティングされた固定された胚を含むバイアルをシェーカーから取り出し、作業台に垂直に置きます。有機相と水相を分離します。適切に固定された胚は、それらのインターフェースにとどまる必要があります。PasteurピペットとP200ピペットを使用して、下部の水相を完全に除去します。ラテックスバルブを取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用して、固定された胚を複数の小さなバッチで寒天スラブに移し、ピペットの内側に付着しないようにします。胚が寒天スラブ上に配置されたら、P200ピペッターを使用して、胚の近くに残っているヘプタンを取り除きます。次に、両面テープの蓋を2センチの高さから寒天スラブに落とし、胚をテープに接着します。寒天スラブから蓋をそっと取り外し、ベンチに逆さまに置き、蓋の胚を覆うのに十分なPBS Tweenを追加します。目的の胚を採取するには、間接照明で100倍の倍率の実体解剖顕微鏡を使用します。胚の前端または後端近くの硝子膜を細いガラス針で刺して収縮させ、圧力を解放します。細かい鉗子または金属プローブを使用して、ビテリン膜を両面テープに接着したまま、胚を穴からそっと押し出します。望ましくない胚をテープに残します。定期的にガラス製のパスツールピペットを使用して、浮遊するデビテリン化胚を採取し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。50ミリリットルのコニカルチューブでPDMS溶液を調製し、2本目の50ミリリットルのコニカルチューブに適切な量の水を加えてバランスの取れたチューブを作成します。PDMS溶液を500Gで摂氏15度で3分間遠心分離します。次に、それを10センチメートルのシャーレに1ミリメートルの深さまで注ぎます。PDMS溶液を摂氏55度で一晩固化させます。PDMSスラブが固まったら、メスを使用して22 x 22ミリメートルのカバースリップよりわずかに小さい正方形の領域にスコアを付けます。各正方形の内側に、幅8ミリメートルの正方形の井戸に切り込みを入れて取り除きます。正方形のPDMSを22 x 22 mmのカバースリップによく移し、しっかりと接着します。胚をカバースリップに付着させるには、各ウェル内のカバースリップ表面を覆うのに十分な0.1%ポリ-L-リジンを塗布し、摂氏55度のインキュベーターに入れて乾燥させます。胚とPBSを簡潔にすすぎ、Tween界面活性剤を取り除きます。次に、10個以上の胚を各ポリ-L-リジンコーティングウェルに移植します。胚が井戸の底に落ち着くのを待ちます。パスツールピペットを使用して接着した胚から余分な液体を取り除き、すぐに次のステップに進みます。胚をモノマー溶液中に置いて、PDMSウェルを覆うゲル化溶液を調製します。触媒酸化剤を粉末から新たに希釈します。3、920マイクロリットルの単量体溶液を60マイクロリットルの10%TEMEDおよび20マイクロリットルの1%TEMPOと組み合わせます。ゲル化溶液を125マイクロリットルのアリコートで複数のPCRチューブに分割します。胚を破壊しないように注意しながら、真空またはピペッターを使用してPDMSウェルからモノマー溶液を除去します。ゲル化溶液が入ったPCRチューブの1つに5マイクロリットルのAPSを加えて重合を開始します。重合ゲル化溶液を3つのウェルに素早く分配します。すべてのウェルと胚が覆われるまでこれを繰り返します。サンプルを摂氏37度で1.5〜2.5時間ゲル化させます。厚いハイドロゲルは、重合が完了して固化するのに時間がかかります。ヒドロゲルを頻繁に攪拌して重合を監視します。一度固まると、ハイドロゲルは小刻みに揺れません。ゲル化後、ハイドロゲルを乱すことなく、カバースリップからPDMSウェルを剥離します。ヒドロゲルを6ウェルプレートのウェルに個別に移します。ヒドロゲルは消化中にわずかに膨張することがあります。ゲルを消化バッファーで完全に覆います。30ミリリットルの消化バッファーは、それらを6ウェルプレートで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートするのに十分です。消化後、ハイドロゲルを6センチメートルのシャーレに移し、脱イオン水で満たして膨張させます。ハイドロゲルは、この時点でカバースリップから剥離し、線寸法で4つの折り目が広がる可能性があります。パスツールピペットを使用して、ペトリ皿から余分な水分をできるだけ取り除き、取り扱い時のゲルの動きを最小限に抑えます。底面に胚がある膨張ゲルを、イメージング用の大きなカバースリップに操作します。各カバースリップをゲルで倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡の対物レンズに取り付けます。適切にステージングされ、配向された標本を見つけた後、高倍率の油浸対物レンズまたは水浸対物レンズに切り替えて、高解像度で画像化します。10倍の対物レンズの下で頭から尾の軸に沿った胚の長さを測定したところ、拡張されていない胚は視野の約半分に広がっていたのに対し、拡張された胚は約2つの完全な視野に広がっていました。未増殖の対照胚の平均頭部から尾部までの長さは398.8マイクロメートルであった。実験1、2、3では、平均胚長はそれぞれ4.0倍、4.7倍、4.9倍の膨張係数であった。対照サンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は4.76マイクロメートルでした。拡大したサンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は19.10マイクロメートルで、4.0倍の膨張を表しています。アクトミオシン細胞骨格は、収斂伸長を受けた非拡張対照と増殖胚で画像化されました。それらは、隣接する細胞が出会う単一の線として現れました。対照的に、拡大した第7期の胚では、ミオシン2の平行線が細胞細胞の接合部に観察され、隣接する細胞の皮質タンパク質プールを表しています。未増殖期の6胚では、ストレプトアビジンで標識されたミトコンドリアは、細胞内の詳細が明瞭でない不均一な細胞質ヘイズとして現れた。しかし、増殖した胚では、多数の点状点が細胞質内で解消可能であり、断片化されたミトコンドリアまたはミトコンドリアネットワークの一部を表している可能性があります。この手順を試みる際に覚えておくべき重要なことの1つは、二次抗体のインキュベーション後に胚を過度の光曝露から保護することです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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拡大顕微鏡を用いたショウジョウバエの胚全体拡大による超解像イメージング

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拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

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