Name: フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぼう、フローサイトメトリー法による日本脳炎ワクチン接種小児の多機能性T細胞解析手法。末梢血単核球を用いた免疫応答評価の標準的なプロトコルを確立し、ワクチン開発研究に貢献します。

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R.W.は、中国国家自然科学基金会(82002130)、中国北京自然科学基金会(7222059)の支援を受けました。ZD.X.は、CAMSイノベーション・ファンド・フォー・メディカルサイエンス(2019-I2M-5-026)の支援を受けました。

本研究の倫理的承認は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって取得されました(承認番号:2020-k-85)。ボランティアは首都医科大学北京小児病院から募集されました。末梢静脈血サンプルは、以前に半年未満の弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を受けたことがある明らかに健康な子供(2歳)から取得されました(JEワクチン接種の子供、n = 5)およびワクチン未接種の子供(生後6か月、n = 5)。ヒト被験者のインフォームドコンセントは、臨床的にテストされた後の残留サンプルのみがこの研究で使用されたため、放棄されました。ボランティアのプライバシーを保護するために、すべてのデータは完全に匿名化され、匿名化されました。
1.末梢静脈血からのPBMCの分離
<ol><li>標準的な静脈穿刺技術18によって、EDTA-K 2抗凝固チューブ(材料の表を参照)でJEワクチン接種および未接種の子供から末梢静脈血サンプル(2 mL)を収集します。</li>
	<li>2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を加えて末梢血を希釈します。. 注:このプロセスは、最大の存続可能性を維持するためにできるだけ早く処理されます。</li>
	<li>4 mLの密度勾配培地( 材料の表を参照)を15 mLの遠沈管に加え、希釈した血液を分離媒体の上層にゆっくりと移します。 注意: 血液を分離媒体と混合したり、2つの液体によって形成された接触面を破壊したりしないでください。そうしないと、分離効果が得られません。</li>
	<li>室温で800 × g で20分間遠心分離します。遠心分離後の重要な層を観察します。</li>
	<li>PBMC(中間層)を別の15 mL遠心チューブに移し、10%ウシ胎児血清を含む10 mLのRPMI-1640培地でPBMCを洗浄します(FBS、 材料の表を参照)。</li>
	<li>室温で800 × g で10分間遠心分離し、上清をピペットで慎重に廃棄します。</li>
	<li>10%FBSを含む1 mLのRPMI-1640培地でPBMCを再懸濁し、トリパンブルーベースの自動カウンターで細胞をカウントします(材料の表を参照)。</li>
</ol>2. 不活化JEV粒子によるPBMCのサイトカイン発現誘導
<ol><li>JEV刺激群と対照群の2つのサブグループを、JEワクチン接種サンプルと非ワクチン接種サンプルにそれぞれ設定します。</li>
	<li>10% FBSを含むRPMI-1640培地でPBMCの数を2×10 6細胞/mLに調整し、PBMCを24ウェルプレート(ウェルあたり2×106細胞/ 1 mL培地)に播種します。各グループに3つのウェルを接種します。</li>
	<li>モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL, 1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮不活化JEV粒子5(2 ×10 5 PFU)でJEV刺激群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。表面染色には、BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)を使用してください(材料表を参照)。 注:JEVは、前述のようにUV照射によって不活性化されました19。</li>
	<li>モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL、1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL、1:1,000)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮ウイルス粒子なしで対照群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)で表面を染色します。</li>
</ol>3. 生体外 細胞内染色
<ol><li>各群の細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに集め、室温で5分間500 × g で遠心分離し、ピペットで上清を除去します。</li>
	<li>細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁し、固定可能な生存率色素(1 μL/mL、1:1,000、 材料の表を参照)を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。500 × g (室温)で5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。500 × g (室温)で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。</li>
	<li>細胞表面マーカー染色を行います。<ol><li>細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各表面マーカー抗体(BV650-抗CD3、BUV395-抗CD4、BV421-抗CD8、BUV737-抗CD27、およびBV480-抗CD45RO、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。 注:カラー蛍光抗体染色プロトコルを 表1に示します。</li>
		<li>チューブを室温で30分間インキュベートし(ステップ3.4.1)、光から保護します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。 注:BUV737-抗CD27およびBV480-抗CD45ROの抗体は、メモリーT細胞のアノテーションとしてBUV737-抗CCR7およびBV480-抗CD45RAに置き換えることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500 × g で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。</li>
	<li>固定と膜破壊を行います。<ol><li>細胞を500 μLの膜破壊固定液( 材料の表を参照)で再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。</li>
	<li>細胞内サイトカイン染色を行う。<ol><li>細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各サイトカイン抗体(FITC-抗IFN-γ、PE-抗TNF-α、BV785-抗IL-2、およびAPC-抗MIP-1α、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。 注:蛍光色素標識抗体の量と情報を 表1に示します。</li>
		<li>チューブを暗所で室温で30分間インキュベートします(ステップ3.8.1)。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。500 μLの1x PBSを加えて、細胞を再懸濁します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーのセットアップ
<ol><li>ステップ1で説明されている手順に従って、PBMCサンプルのみをコントロールサンプルとして分離します。下記のように、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブ(100 μL /チューブ)で12等分します。<ol><li>非染色、APC-Cy7-生/死固定染色、BV650-抗CD3単一染色、BUV395-抗CD4単一染色、BV421-抗CD8単一染色、BUV737-抗CD27単一染色、BV480-抗CD45RO染色、BV605-抗CD107a、FITC抗IFN-γ染色、PE-抗TNF-α単一染色、BV785-抗IL-2単一染色、およびAPC-抗MIP-1α単一染色サンプルを設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ3に記載されているように細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン染色を追加します。単一染色サンプルごとに、染色ステップの蛍光色素を1つだけ追加します。500 μLの1x PBSを添加して、細胞とボルテックスを低速で再懸濁します。</li>
	<li>染色されていないサンプルを使用して、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、および異なる蛍光色素電圧を調整します。 注:本研究では、以下の電圧を設定しました。FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, and BV785: 725 V.</li>
	<li>単一染色サンプルを使用して、フローサイトメトリー補正を調整し、異なる蛍光色素間のコンタミネーションシグナルを排除します。 メモ: 補正パラメータを 表 2 に示します。</li>
</ol>5. ゲーティング戦略とデータ分析
注:本研究では、この解析のために、CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-としてCD8+またはCD4+ T細胞のセントラルメモリーT細胞(TCM)をCD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA-としてCD8+またはCD4+ T細胞のエフェクターメモリーT細胞(TM)をそれぞれ定義した16。
<ol><li>FSCエリア(FSC-A)/SSCエリア(SSC-A)ドットプロットを通るポリゴンゲートを描画し、破片を除外しながら無傷のリンパ球集団を選択します(図1A)。</li>
	<li>FSC-A/FSC-幅(FSC-W)ドットプロットを通して長方形のゲートを描画し、単一セルを選択します(図1B)。</li>
	<li>生/死/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、生細胞を選択します(図1C)。</li>
	<li>CD3/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、CD3+ T細胞を特定します(図1D)。</li>
	<li>CD4/CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画し、CD4+ またはCD8+ T細胞を特定します(図1E)。</li>
	<li>CD45RO/CD27ドットプロットを通してクワッドゲートを描き、CD4+またはCD8+ T細胞をTCM(CD27+ CD45RO+)とTEM(CD27- CD45RO+)に細分化します(図1F-I)。</li>
	<li>CD8+またはCD4+ T細胞のTCMまたはTEMからCD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2、およびMIP-1αのゲートを描画して、それぞれ異なる応答パターンの頻度を決定します。</li>
	<li>サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。停止ゲート20 を使用して、1×106 リンパ球を獲得する。 注:個々のユーザーは、10個の6セル ×1個以上を収集できます。この数値は、意味のある結果を提供するのに十分なセルの収集にかかる時間との間の妥協点でした。</li>
</ol>

<ol><li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes%3A+A+review+of+vector+competence%2C+vector+capacity+and+mosquito+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317(2022).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China%3A+A+national+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562(2022).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476(2020).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li>
<li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response%2C+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression%2C+and+a+decreased+frequency+of+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+double-positive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888(2022).</li>
<li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329(2017).</li>
<li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72(2021).</li>
<li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+IFNgamma%28-%29IL-2%28%2B%29+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275(2013).</li>
<li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma%2BIL-2%2B+and+CD28%2BIL-2%2B+CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li>
<li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2%2C+IL-4%2C+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1%2F2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li>
<li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-induced+CD107a%2B+CD4%2B+T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li>
<li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36(2021).</li>
<li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li>
<li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4%2B+T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8%28%2B%29+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212(2022).</li>
<li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li>
<li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li>
<li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li>
<li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+%28cTfh%29+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM%2FE+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443(2020).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126(2020).</li>
<li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+CD4%2B+and+CD8%2B+polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416(2018).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4%28%2B%29+T+cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li>
<li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-specific+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、JEVワクチンSA14-14-2を接種した小児のPBMCにおけるTFP プロファイルの実行可能なフローサイトメトリーベースの検出方法を表しています。この研究では、ワクチン接種を受けた子供と予防接種を受けていない子供の両方の静脈血PBMCを研究資料として使用しました。JEV抗原によるPBMCの刺激により、増幅された抗原特異的TFPsは、多色フローサイトメトリー抗体染色によって特徴付けることができる。フローサイトメトリーは、従来の酵素結合イムノスポットアッセイ法と比較して、PBMCの機能的特徴を単一細胞レベルで可能な限り多様に提示し、検出に必要なPBMCの数を減らすことができ、特に子供に適しています。
明確なワクチン接種歴、維持された細胞生存率、刺激装置のT細胞免疫原性、および互換性のあるカラーマッチング戦略は、このプロトコルの重要なステップです。中国は、2008年以来、JEV SA14-14-2のワクチン接種を国家拡大予防接種プログラムに組み込み、ワクチン接種履歴を統合管理に含めており、ワクチン履歴へのアクセスが可能になり...

日本脳炎ウイルス(JEV)は、フラビウイルス科1に属するフラビウイルス属に属する重要な蚊媒介性ウイルスです。多くのアジア太平洋諸国は、日本脳炎(JE)によって引き起こされる莫大な病気の負担のために長い間大きな公衆衛生上の課題に直面してきましたが、これはさまざまな種類の予防接種の利用可能性の増加とともに劇的に改善されました2。自然感染またはワクチン接種によって引き起こされる適応防御免疫応答は、予防および抗ウイルス調節に寄与する。体液性免疫と細胞性免疫は獲得免疫に分類され、前者の誘導は、過去3では比較的限られた理解しかありませんでしたが、ワクチン設計における重要な戦略として常に見なされてきました。しかし、フラビウイルスの蔓延とウイルスクリアランスを制限する上でのT細胞媒介免疫の役割はますます注目され、広く研究されています4。さらに、T細胞免疫は、JEV特異的抗ウイルス反応に不可欠であるだけでなく、以前の研究で実証されている異種フラビウイルスによる二次感染からの交差防御においても重要な役割を果たしています5。この効果は、感染症における潜在的な抗体媒介増強効果を回避する可能性があると推測されています5。注目すべきことに、このような交差反応性T細胞免疫は、特にフラビウイルスに対するワクチンおよび抗ウイルス薬が存在しない場合に重要である。CD4+およびCD8+ T細胞に関してJEV感染におけるT細胞の寄与を決定するために多くの研究が行われてきたが6,7、サイトカインを分泌するそれぞれの系統とその機能多様化は未定のままであり、これはヘルパーおよびキラーT細胞の正確な機能の解明が妨げられていることを意味する。
それらの抗ウイルス防御の規模は、T細胞応答の質を決定する。サイトカイン分泌および脱顆粒を含む2つ以上の機能を相溶的に付与することができるCD4+またはCD8+ T細胞は、単一細胞レベルでの特異的刺激に対して多機能性T細胞(TFs)として特徴付けられる8。単一または複数のサイトカインを産生するCD4+ T細胞は、さまざまな効果と免疫記憶を持っている可能性があります。例えば、IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞は、IL-2+ CD4+ T細胞よりも長期的に有効な防御応答を形成する可能性が高く、ワクチン接種効果を評価する際の重要なパラメータとして使用できます。IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞の頻度は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の長期非進行の患者で増加しますが、エイズ進行患者のCD4+ T細胞は、T細胞増殖に対するIL-2の促進効果により、IFN-γ単独で産生する傾向があります10。さらに、IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+のサブセットは、in vivoで長期間生存し、殺傷機能を相乗的に促進することが示されました11。CD8+ T細胞は細胞傷害活性を示す可能性が高いが、一部のCD4+ T細胞は、表面CD107a分子の発現を間接的に検出する12として細胞傷害活性も備えている。さらに、特定のT細胞サブセットはケモカインMIP-1αを発現し、これはT細胞媒介好中球動員に関与するために単球によって分泌されることが多い13。同様に、CD8+ TPFsは、上記のマーカーの汎用性を特徴付けるためにも使用できます。研究によると、プライムブースト戦略は、ワクチン接種によって誘発される保護を強化することができるTf保護効果13の長期間を効果的に誘発することができます。免疫系を調べる際の中心的な特徴は、記憶T細胞がナイーブT細胞よりも二次的なウイルスの課題に対してより強く、より速く、より効果的な応答を促進する能力です。エフェクターメモリーT細胞(TEM)および中枢メモリーT細胞(TCM)は、CD27/CD45ROまたはCCR7/CD45RAの複合発現によってしばしば分化される重要なT細胞サブセットである14。TCM(CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-)は二次リンパ組織に局在する傾向があり、TEM(CD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA-)はリンパ系および末梢組織に局在する15,16。TEMは即時の、しかし持続的ではない防御を提供するのに対し、TCMは、二次リンパ器官で増殖し、新しいエフェクターを生成することによって応答を維持する17。したがって、メモリセルがウイルスに対する特異的で効率的な想起応答を媒介できることを考えると、この多関数のサブセットの寄与について疑問が生じます。
フローサイトメトリー技術の発展に伴い、10を超えるクラスター、表現型、分化抗原のマーカーを同時に検出することが一般的になり、個々のT細胞の機能的免疫学的特徴をより豊富にアノテーションして、T細胞の表現型の誤解や理解の難しさを減らすのに役立ちます。この研究では、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを使用して、JEVワクチン接種を受けた子供の末梢血単核細胞(PBMC)のTFP プロファイルを分析しました。このアプローチを適用することで、ワクチン接種によって誘導される短期および長期のJEV特異的、さらには交差反応性T細胞免疫の理解が拡大されます。

<table><tbody><tr><td>抗ヒトCD28</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>302934</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗ヒトCD49d</td><td>バイオレジェンド</td><td>304339</td><td>抗体</td></tr><tr><td>APC抗ヒトMIP-1&α;</td><td>BD</td><td>551533</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>BIO RAD</td><td>TC20</td><td>細胞数</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5</td><td>BD</td><td>A5</td><td>flow Cytometry</td></tr><tr><td>BUV395 anti-human CD4</td><td>BD</td><td>563550</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 抗ヒトCCR7</td><td>BD</td><td>741786</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 抗ヒト CD27</td><td>BD</td><td>612829</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV421 抗ヒトCD8</td><td>Biolegend</td><td>344748</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 抗ヒト CD45RA</td><td>BD</td><td>566114</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 抗ヒト CD45RO</td><td>BD</td><td>566143</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV605 抗ヒトCD107a</td><td>Biolegend</td><td>328634</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV650 抗ヒト CD3</td><td>BD</td><td>563999</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>BV785 抗ヒトIL-2</td><td>Biolegend</td><td>500348</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>BD Falcon</td><td>BD-35209715</td><td>15 mL 遠心分離管</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 固定/透過化 溶液キット</td><td>BD</td><td>554714</td><td>細胞固定および透過化</td></tr><tr><td>密度勾配培地</td><td>Dakewe</td><td>DKW-KLSH-0100</td><td>Ficoll-Paque、ヒトリンパ球分離培地</td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト IFN-&γ;</td><td>Biolegend</td><td>502506</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000-044</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>ギブコ RPMI-1640 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22400089</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>高速&nbsp;遠心分離機</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;</td><td>15 mL遠心分離管用</td>3K15細胞遠心分離</tr>高速<tr><td>&nbsp;遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>1.5 mL Eppendorf (EP) tube用細胞遠心分離</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>PE 抗ヒト TNF-&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>502909</td><td>蛍光抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>BI</td><td>02-024-1ACS</td><td>PBS</td></tr><tr><td>タンパク質輸送阻害剤(ブレフェルジンA、GolgiPlugを含む)</td><td>BD</td><td>555029</td>細胞<td>内タンパク質輸送プロセスをブロック</td></tr>します<tr><td>タンパク質輸送阻害剤(モネンシンを含む)</td><td>554724</td> <td>BD</td>は<td>細胞内タンパク質輸送プロセスをブロック</td></tr>します <tr><td>丸底試験管</td><td>BDファルコン</td><td>352235</td><td>5 mL試験管</td></tr><tr><td>トリパンブルー染色細胞生存率アッセイキット</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td>トリ<td>パンブルー染色</td></tr><tr><td>ゾンビNIR固定生存率染料</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>423106</td><td>死細胞染色</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性t細胞の検出

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T細胞媒介免疫は、ワクチン接種後または自然感染後のフラビウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。T細胞の「品質」は機能によって評価する必要があり、より高い機能はより強力な免疫防御と関連しています。単一細胞レベルで2つ以上のサイトカインまたはケモカインを同時に産生できるT細胞は、多機能性T細胞(TFPs)と呼ばれ、さまざまな分子メカニズムを介して免疫応答を仲介し、脱顆粒マーカー(CD107a)を発現し、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-2、またはマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌します。TFPは長期的な免疫記憶と保護の維持に密接に関連しており、その割合の増加は防御免疫の重要なマーカーであり、ウイルス感染と再活性化の効果的な制御に重要であるという証拠が増えています。この評価は、特異的免疫応答だけでなく、交差反応性免疫応答の評価にも適用されます。ここでは、日本脳炎ウイルス(JEV)を例にとり、日本脳炎の予防接種を受けた小児の末梢血単核球によって産生されるJEV特異的TFPsの検出方法およびフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考とした。

図1は、CD8+またはCD4+ T細胞のTCMまたはTMをJEワクチン接種小児の代表的なJEV刺激群から分割するために用いられるゲーティング戦略を示す。 FSC-A/SSC-Aドットプロットはリンパ球の同定に使用され、FSC-A/FSC-Wドットプロットは単一細胞の同定に使用されます。生細胞は、生/死/SSC-Aドットプロットで選択されます。CD3/SSC-Aドットプロットは、CD3+ T細胞を識別するために使用されます。CD4/CD8ドットプロットは、それぞれCD3+ CD4+およびCD3+ CD8+ T細胞を識別するために使用されます。CD8+またはCD4+ T細胞のTCM(CD27+ CD45RO+)およびTEM(CD27- CD45RO...

本プロトコルは、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを組み合わせて、日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチン接種小児内の末梢血単核球(PBMC)の多機能T細胞(TFP)プロファイルを分析します。JEV特異的TPFの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考資料を提供しました。

フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

日本脳炎ウイルス特異的TPFSの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考にした。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の2人の学生であるLinlin ZhangとMeng Zhangによって行われます。まず、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD107a、ゴルジプラグ、およびモネンシンの存在下で、濃縮不活化JEV粒子を摂氏37度で16時間刺激します。次に、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD 107a、GolgiPlugおよびモネンシンの存在下で、濃縮ウイルス粒子を含まない対照群のPBMCを摂氏37度で16時間刺激する。各グループから細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。室温で500gで5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去する。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。固定可能な生存率色素を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、再び、室温で500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を廃棄する。細胞表面マーカー染色を行うには、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各表面マーカー抗体を追加します。チューブを光から保護しながら、室温で30分間インキュベートします。500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去します。再度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。固定および膜破壊を行うには、500マイクロリットルの膜破壊固定液で細胞を再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。その後、500gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、室温で500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を注意深く除去します。次に、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、細胞内サイトカイン染色のために各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各サイトカイン抗体を追加します。暗所で室温で30分間チューブをインキュベートします。再度、500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去する。もう一度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、前述のように上清を注意深く除去します。次に、500マイクロリットルのPBSを加えて細胞を再懸濁します。PBMCサンプルのみを単離した後、前に示したように、原稿に記載されている1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで細胞懸濁液を12等分します。同様に、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン抗体を添加した後、前に実証したように、500マイクロリットルのPBSを添加して、細胞およびボルテックスを低速で再懸濁する。染色されていないサンプルを使用して、前方散乱、側方散乱、および異なる蛍光色素電圧を調整し、フローサイトメトリー補正を調整して、単一の染色サンプルを使用して異なる蛍光色素間の汚染シグナルを排除します。前方散乱領域を通る多角形ゲートを描き、無傷のリンパ球集団を選択する側方散乱領域ドットプロット、破片を除外しながら、前方散乱領域を通る矩形ゲートと、前方散乱幅ドットプロットとを描き、単一細胞を選択する。次に、生細胞を選択するために生細胞を通る死側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3つの陽性T細胞を同定した。次に、CD4、CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画してCD4陽性またはCD8陽性T細胞を特定し、CD45RO、CD27ドットプロットを通してCD4陽性またはCD8陽性T細胞をTCMとTEMに細分化します。CD107aのゲートを引いた後、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマイクロファージ炎症性タンパク質1αをCD8陽性またはCD4陽性のT細胞のTCMまたはTEMからそれぞれ異なる応答パターンの頻度を決定した。サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。ゲーティング戦略を採用して、前方散乱領域幅、次に側方散乱領域ドットプロットを使用して、CD8陽性またはCD4陽性T細胞とそのサブセットのTCMまたはTEMを識別しました。JEVに対するCD4陽性およびCD8陽性T細胞応答の多官能的特徴は、JEV刺激後のCD8陽性TCM細胞において、ワクチン未接種の小児と比較して、CD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン2のレベルの増加が検出されたことを示した。しかし、マクロファージ炎症性タンパク質1アルファのレベルは、両群間で異ならなかった。より高いレベルのCD107aおよびインターフェロンガンマは、未ワクチン接種群と比較して、JEV刺激下でワクチン接種群のCD8陽性TEM細胞で検出された。一方腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマクロファージ炎症性タンパク質1αは、それらの陽性細胞において有意に上昇しなかった。JEV抗原は、ワクチン未接種群と比較して、ワクチン接種群のCD4陽性TCM細胞において、より高いレベルのCD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、およびマクロファージ炎症性タンパク質1αを誘導することに成功した。しかし、インターロイキン2陽性細胞の割合は、JEV刺激下で2つの群間で異ならなかった。CD107a陽性、インターフェロンガンマ陽性および腫瘍壊死因子α陽性サブセットの割合は、ワクチン接種群におけるサブCD4陽性TEM細胞は、未ワクチン接種群よりもJEVの存在下で高かった。刺激のT細胞免疫原性と互換性のあるカラーマッチング戦略は、このプロトコルの重要なステップです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。...

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

私たちは、ワクチン接種のマウスモデルにおいて、ナノ粒子による免疫に対する抗原特異的CD8+...

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。...

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単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

ここでは、元のプロトコルを提案生体内抗原特異的 CD8 の定性的検出+ T 細胞。分析は、単一細胞懸濁液の臓器や血液量が少ないからで可能です。広範な研究には、細胞傷害性 T 細胞の反応 (予防接種・癌免疫療法研究)...

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8+...

感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離

このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。...

インビトロ ナノエマルジョンワクチンアジュバントオフィオポゴニンDの細胞活性評価

本研究では、脳炎ワクチン接種児のリンパ球検出のために、2つの実験室の2つのフローサイトメーター間で実験設定と分析テンプレートの転送を容易にする方法を開発しました。フローサイトメーター実験の標準化手法により、複数のセンターで効果的に研究プロジェクトを実施できるようになります。...

日本脳炎ワクチン接種小児におけるリンパ球検出のためのフローサイトメーター間ラボ間移入の標準化

学ぼう、フローサイトメトリー法による日本脳炎ワクチン接種小児の多機能性T細胞解析手法。末梢血単核球を用いた免疫応答評価の標準的なプロトコルを確立し、ワクチン開発研究に貢献します。

フローサイトメトリー法による日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

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