Name: 2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスモデルにおける生体内イメージング法。頭蓋窓インプラントとEGFP発現ニューロンの時系列モニタリングにより、機械的ストレスに対する神経応答を可視化し、TBI後の急性期・慢性期の神経機能変化を評価する。

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AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFPウイルスを寄贈してくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のMiguel Sena-Esteves博士と、マウスの頭蓋骨のスケッチを描いてくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のDebra Cameron博士に感謝します。また、Bosco、Schafer、Henningerの各研究室の現在および過去のメンバーの提案とサポートにも感謝します。この研究は、国防総省(W81XWH202071/PRARP)からDAB、DS、およびNHに資金提供されました。

<ol><li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research%3A+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences%2C+Engineering%2C+and+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li>
<li>National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Traumatic+Brain+Injury%3A+A+Roadmap+for+Accelerating+Progress%22">Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress</a>. , The National Academies Press. (2022).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).</li>
<li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins%3A+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li>
<li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646(2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060(2021).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li>
<li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li>
<li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li>
<li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).</li>
<li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II%3A+Morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Through-Intact-Skull+%28TIS%29+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLight%22%5BJournal%5D)">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li>
<li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).</li>
<li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601(2020).</li>
<li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain%3B+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Los+Angeles+Neurological+Society%22%5BJournal%5D)">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li>
<li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contrecoup-coup+phenomenon%3A+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

本研究では、AAV注射、TBI投与、頭蓋窓留置ヘッドポストを組み合わせて、マウスの脳皮質(IV層およびV層)内のEGFP標識ニューロンの縦断的画像解析を行い、皮質ニューロンに対するTBIの影響を観察しました。この研究は、ここで選択された海馬の上のTBI部位が、頭蓋窓の移植に比較的平らで広い表面を提供することを指摘しています。逆に、頭蓋骨はこの部位の前方が比較的狭いため、ヘッドポストが頭蓋骨の表面に効果的に接触することを保証することは困難です。この研究ではTDP-43 Q331K/Q331K マウスモデルのみを使用しましたが、ALSおよびFTD19に焦点を当てた研究所の研究を考慮すると、このプロトコルは他のほとんどのマウス株に適用できるはずです。ここに記載されるようなニューロンの標識に加えて、様々な戦略を用いて、生体内イメージングのために他の細胞型を標識することができる。1つのアプローチは、遺伝子改変マウスにおいてCre-Lox組換え系を用いて、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質を細胞特異的に発現させることである21。別の...

外傷性脳損傷(TBI)は、スポーツ傷害、車両衝突、軍事戦闘に起因する可能性があり、世界的な健康上の懸念事項です。TBIは、生理学的、認知的、行動的障害、および生涯にわたる障害または死亡率につながる可能性があります1,2。TBIの重症度は、軽度、中等度、重度に分類でき、大多数は軽度のTBI(75%-90%)です3。TBI、特にTBIの反復発生は、神経変性を促進し、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、慢性外傷性脳症(CTE)などのいくつかの神経変性疾患の危険因子として機能する可能性があることがますます認識されています4,5,6.しかし、TBI誘発性神経変性の根底にある分子メカニズムは依然として不明であり、したがって活発な研究分野を表しています。ニューロンがTBIに応答し、TBIから回復する方法についての洞察を得るために、TBI後のマウスにおける縦断的生体内イメージングによって、特にニューロン内で目的の蛍光タグ付きタンパク質をモニタリングする方法を本明細書に記載する。
この目的のために、この研究は、以前に報告されたものと同様の閉鎖頭蓋骨TBIの投与のための外科的処置を組み合わせる方法を示しています7,8、 Goldeyらによって記述されたように、下流の生体内イメージングのための頭蓋窓の移植のための外科的処置と一緒に9。特に、最初に頭蓋窓を移植し、その後、TBIを誘発する体重減少の影響が窓を損傷し、マウスに取り返しのつかない害を及ぼす可能性があるため、同じ領域にTBIを実行することは現実的ではありません。したがって、このプロトコルは、TBIを投与してから、すべて同じ手術セッション内で、衝撃部位に直接頭蓋窓を埋め込むように設計されました。TBIと頭蓋窓移植の両方を1回の手術セッションで組み合わせることの利点は、マウスが手術を受ける回数が減ることです。さらに、後の手術セッションで窓を埋め込むのとは対照的に、TBIに対する即時反応(つまり、時間のタイムスケールで)を監視できます(つまり、TBI後数日の時間スケールで開始される初期イメージング)。また、頭蓋窓と生体内イメージングプラットフォームは、固定組織の免疫染色などの従来の方法によるニューロンタンパク質のモニタリングよりも優れています。例えば、同じマウスを複数の時点で研究できるため、個別の時点に必要なマウスのコホートとは対照的に、生体内イメージングに必要なマウスの数が少なくて済みます。さらに、同じニューロンを経時的に監視できるため、同じ細胞内の特定の生物学的または病理学的イベントを追跡できます。
概念実証として、シナプシンプロモーター下での増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)のニューロン特異的発現がここで実証されています10。このアプローチは、1)オリゴデンドロサイトのミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモーターやアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターなど、他の細胞タイプ特異的なプロモーターを利用することで異なる脳細胞タイプに拡張できます11、2)それらの遺伝子をEGFP遺伝子と融合させることによる目的の異なる標的タンパク質、および3)異なる蛍光色素に融合した複数のタンパク質を共発現します。ここでは、EGFPは、頭蓋内注射によるアデノ随伴ウイルス(AAV)送達を介してパッケージ化され、発現されます。閉じた頭蓋骨TBIは、ウェイトドロップデバイスを使用して投与され、その後、頭蓋窓が埋め込まれます。ニューロンEGFPの可視化は、2光子顕微鏡を使用してin vivoでEGFP蛍光を検出するために頭蓋窓を介して達成されます。2光子レーザーでは、最小限の光損傷で皮質組織の奥深くまで浸透することができ、個々のマウス内の同じ皮質領域を数日から最大数ヶ月にわたって縦断的に繰り返しイメージングすることができます12,13,14,15。要するに、TBI手術と生体内イメージングを組み合わせるこのアプローチは、TBI誘発性疾患の病理に寄与する分子イベントの理解を深めることを目的としています16,17。

<table><tbody><tr><td>調節可能な精密アプリケーター ブラシ</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD インスリン シリンジ</td><td>BD</td><td>NDC/HRI#08290-3284-38</td><td>5/16" x 31G</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>7.5% ポビドン ヨウ素を含む</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>PAR Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>セファゾリン</td><td>HIKMA Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>セラミックミキシングディッシュ</td><td>パーケル</td><td>SKU:S387</td><td>歯科用セメント製剤用</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケー</td><td>ターZORO</td><td>キャットログ#:G9531702</td><td></td></tr><tr><td>触媒</td><td>パーケル</td><td>S371</td><td>フルネーム:「C」ユニバーサルTBB触媒</td></tr><tr><td>歯科用セメント粉末</td><td>パーケル</td><td>S396</td>放射線<td>不透過性L-パウダーC&B メタボンド</td></tr><tr><td>デンタル ドリル</td><td>フォアダム</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>デンタル ドリル コントローラー</td><td>フォアダム</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>フェニックス</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>EF4 超硬ビット</td><td>マイクロコピー</td><td>ロット# C150113</td><td>ヘッド Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td></tr><tr><td>エトナル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>04355223EA</td><td>75%</td></tr><tr><td>FG1/4超硬ビット</td><td>マイクロコピー</td><td>Lot# C150413</td><td>ヘッド径/Lgth/mm 0.5/0.4</td></tr><tr><td>FG4 超硬ビット</td> マイクロ<td>コピー</td><td>Lot# C150309</td><td>ヘッド径/Lgth/mm 1.4/1.1</td></tr><tr><td>ヘッドポスト</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>加熱装置</td><td>CWE</td><td>TC-1000 マウス</td><td>には定位固定装置が装備されており、手術中に使用できます</td></tr><tr><td>ヒーティングブランケット</td><td>CVS薬局</td><td>E12107</td><td>余分な暖房装置および外科の後で使用されて下さい</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランの誘導の部屋</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>短い</td></tr><tr><td>イソフルランの揮発機械</td><td>のための誘導の部屋 Vetequip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランの揮発機械ホール</td><td>ダーVetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>ライカ手術用顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>10450243</td><td></td></tr><tr><td>潤滑剤 眼科用軟膏</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>マーカーペン</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションポンプとそのコントローラー</td><td>World Precision Instruments</td><td>micro4 and UMP3</td><td></td></tr><tr><td>マイクロリットルシリンジ</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>80014</td><td>1701 RN, 10 &mu;注射器のためのLゲージおよび針のための32ゲージ、2のin、ポイント様式3</td></tr>つの<tr><td>蚊の鉗子</td><td>CAROLINA</td><td>項目#:625314</td><td>ステンレス鋼、曲がった、</td></tr><tr><td>5のDepilatory代理店</td><td>McKesson Corporation</td><td>のN/A</td><td>のNairの毛のアロエ及びラノリン脱毛ローション</td></tr><tr><td>顕微鏡 1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>頭蓋窓の準備用ニコン顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡 2</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td><td>2 光子顕微鏡</td></tr><tr><td>多光子レーザー</td><td>コヒーレント</td><td>カメレオン ウルトラ II、モデル: MRU X1、VERDI 18W</td><td>レーザー 2 光子顕微鏡用</td></tr><tr><td>非吸収性外科用縫合</td>糸 <td>ハーバード 装置</td><td>カタログ# 59-6860</td><td>6-0、丸針付き</td></tr><tr><td>ノーランド光学接着剤 81</td><td>ノーランド製品</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>引っ掛かりなしニードルホルダー</td><td>カロライナ</td><td>アイテム #: 567912</td><td></td></tr><tr><td>クイックベース液体</td><td>パーケル</td><td>S398</td> <td>"B" クイックベース C&B メタボンド</td></tr><tr><td>レギュラーハサミ 1</td>台 <td>ユーロスタット</td><td>ユーロスタット es5-300</td><td></td></tr><tr><td>レギュラーハサミ 2</td>台 <td>ワールド精密計器</td><td>No.501759-G</td><td></td></tr><tr><td>丸型カバーガラス 1</td>台 <td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>CS-5R Cat# 64-0700</td><td>直径5mm用</td></tr><tr><td>丸型カバーガラス 2</td>台 <td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>CS-3R Cat# 64-0720</td><td>直径3mm用</td></tr><tr><td>ラバーリング</td><td>Orings-Online</td><td>アイテム # OO-014-70-50</td><td>O-リング</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>バイオワールド</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>春のはさみ 1</td><td>世界の精密機器</td><td>No. 91500-09</td><td>先端 まっすぐ</td></tr><tr><td>春のはさみ 2</td><td>世界の精密機器</td><td>No. 91501-09</td><td>先端湾曲</td></tr><tr><td>脳定位固定装置プラットフォーム</td><td>KOPF</td><td>モデル 900LS</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>ヘンケル</td><td>アイテム#:1647358</td><td></td></tr><tr><td>外科用キャリパー</td><td>ワールド精密機器</td><td>No.501200</td><td></td></tr>外科<tr><td>用鉗子1</td>電子<td>顕微鏡科学</td><td>Catlog#0508-5/45-PO</td><td>スタイル5/45、湾曲</td></tr><tr><td>外科用鉗子2</td><td>電子顕微鏡科学catlog</td><td>#0103-5-PO</td><td>スタイル5、ストレート</td></tr><tr><td>外科用鉗子3</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>catlog#72912</td><td></td></tr>外科<tr><td>用鉗子4</td>電子<td>顕微鏡科学Catlog</td><td>#0508-5 / 45-PO</td><td>スタイル5/45、湾曲</td></tr>外科<tr><td>用ガーゼ</td><td>ZORO</td><td>猫ログ#:G0593801</td><td></td></tr><tr><td>外科用ランプ</td><td>ライ</td><td>カライカKL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>UVボックス</td><td>分光リンカーXL-1000</td><td></td><td>は、UVクロスリン</td></tr><tr><td>カーVaporguard</td><td>Vetequip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond ティッシュ接着剤</td><td>3M アニマルケア</td><td>部品番号:014006</td><td></td></tr></tbody></table>

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

このプロトコルの目的は外因性の刺激への露出に縦断的に動物の頭脳の特定のセル・タイプ内の興味の蛋白質の表現そしてローカリゼーションを、視覚化する方法を示すことである。ここでは、閉鎖頭蓋骨外傷性脳損傷(TBI)の投与と、その後の縦断的生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植がマウスに示されています。マウスに、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)をニューロン特異的プロモーター下で頭蓋内注射します。2〜4週間後、マウスはAAV注射位置の上でウェイトドロップデバイスを使用して反復TBIを受けます。同じ手術セッション内で、マウスに金属製のヘッドポストを埋め込み、次にTBIの衝撃部位の上にガラスの頭蓋窓を埋め込みます。EGFPの発現と細胞局在は、数か月にわたって外傷にさらされた同じ脳領域で2光子顕微鏡を使用して調べられます。

このプロトコルの概念実証として、AAV-Syn1-EGFPを発現するウイルス粒子を、生後3ヶ月の雄TDP-43 Q331K/Q331Kマウス(C57BL/6Jバックグラウンド)19の大脳皮質に注入しました。なお、野生型C57BL/6J動物も用いることができるが、本研究室は神経変性疾患の研究に力を入れているため、TDP-43 Q331K/Q331Kマウスを用いた。AAV注射の4週間後にTBI手術が行われました。同じ手術環境内で、ヘッドポストと頭蓋窓が埋め込まれました。TBI手術後0日目、1週間後、4カ月後に2光子顕微鏡を用いてマウスを連続的に画像化しました(図1)。一般に、注射手術は~30分かかり、TBI手術はマウス1匹あたり~1時間かかりました。TBI手術中、マウスは一般的に、最初の衝撃と比較して、その後の衝撃後に仰臥位から腹臥位に直るのに長い時間を必要としました。たとえば、マウスは、最初の衝撃の後、その位置を右にするのに 2 分かかりましたが、10回目の衝撃の後、...

この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

私たちのプロトコルは、生きたマウスの機械的ストレスに対するニューロンの応答を視覚化する方法を提供し、外傷性脳損傷が脳にどのように影響するかの直接的な証拠を提供することができます。この技術は、外傷性脳損傷後の急性期と慢性期の両方について、同じ動物の同じ脳位置にある標的タンパク質をモニターすることができます。目的の遺伝子とウイルスプロモーターを適宜変更して、脳内の特定の細胞タイプの他のタンパク質を研究することができます。まず、麻酔をかけたマウスの目に眼科用軟膏を塗ります。通常のハサミでトリミングして、頭のてっぺんから髪の毛を取り除きます。長さ12〜15ミリメートルの正中線切開を確立した後、湾曲した先端のスプリングハサミを使用して頭蓋骨の左右の半球の皮膚を切除します。頭蓋骨が露出したら、滅菌綿の先端アプリケーターでそっとこすり、滅菌生理食塩水で洗い流して骨膜を取り除きます。頭蓋骨領域が乾燥したら、ブレグマの後方2.5ミリメートル、矢状縫合糸から右側の2ミリメートルの座標に外傷性脳損傷(TBI)の衝撃部位をマークします。マウスを脳定位固定装置フレームからすばやく取り外し、TBIデバイスの下のバッファークッションに頭を置きます。インパクターの先端をマークされた衝撃部位に合わせます。繋がれたナイロン製の紐をマウスの頭から15センチ上に引っ張って金属柱を持ち上げてから放し、TBI部位の頭蓋骨の上部に接触しているトランスデューサーロッドに重りが自由に落ちるようにします。麻酔をかけたマウスの頭を、手術用顕微鏡下に保管されている脳定位固定装置フレームに置きます。FG4カーバイドビットを使用して頭蓋骨の表面をゆっくりとゆっくりとローター速度でドリルで穴を開け、残りの骨膜を取り除き、歯科用セメントが頭蓋骨としっかりと結合するように粗い頭蓋骨表面を作成します。生理食塩水を使用して、頭蓋骨の表面から骨のほこりを洗い流して取り除きます。頭頂骨と側頭蓋骨をつなぐ縫合糸がある眼の後約5ミリメートルで、外側の筋肉を頭蓋骨から分離するには、細かい閉じた先端をそっと挿入し、閉じた先端をラムドイド縫合糸まで後方向に静かに動かします。頭蓋窓の移植が行われる側の外側の筋肉を分離します。生理食塩水を使用して手術部位の破片を洗い流し、ガーゼでその部分を乾かします。ヘッドポストを埋め込むには、マーカーペンと外科用ノギスを使用して、ブレグマの後方2.5ミリメートル、右半球の矢状縫合糸から1.5ミリメートル離れた中心点に印を付けます。次に、清潔で乾燥した頭蓋骨の開頭術の周囲をトレースします。イヤーバーを緩め、頭を回転させて、開頭面が完全に水平になるようにしてから、イヤーバーを再度締めます。先端が綿のアプリケーターの木製スティックを使用して、ヘッドポストの前端と後端に瞬間接着剤を2滴加えます。チタン製のヘッドポストを開頭術の中心に配置し、頭蓋窓が埋め込まれるのと同じ平面内に収まるようにすばやく調整します。瞬間接着剤が乾くまで軽く圧力をかけますが、通常は約30秒かかります。300ミリグラムのセメント粉末、6滴のQuickBase液体、および1滴の触媒を完全に混合することにより、予冷したセラミック皿で歯科用セメントを調製します。トレースされた円周の外周にたっぷりの量の歯科用セメント混合物をすばやく塗布し、露出した骨表面を覆います。ただし、開頭部位は覆わないでください。イヤーバーを外し、ヘッドポストを金属フレームに固定して、頭が安定し、マークされた開頭術の円周に沿って正確に穴を開けることができるようにします。開頭手術を行うには、外科用ノギスを使用して、前に示したようにマークされた円の直径を確認し、必要に応じて調整して、頭蓋窓が開頭術の内側にぴったりと収まるようにします。電動歯科用ドリルを使用して、最初にFG4カーバイドビットを使用して、マークされた円の外側に沿って頭蓋骨をエッチングして薄くし、頭蓋骨を薄くするためのトラックを作成します。その部分を生理食塩水で灌漑して、骨の粉を洗い流します。頭蓋骨が紙のように薄く透明になるまで、FG 1/4カーバイドビットを使用して頭蓋骨を薄くし続けます。定期的に掘削を中止し、ドリルからの加熱を減らし、骨粉を洗い流すために、滅菌生理食塩水で領域全体を再度灌漑します。EF4カーバイドビットを使用して頭蓋骨の薄化を完了し、トラックに沿って頭蓋骨の残りの部分の薄肉化と穴あけを続けます。ひびの入った場所に0.5ミリの細い先端の鉗子を挿入し、下にある脳をへこませることなく、骨皮弁をゆっくりと上に持ち上げます。骨皮弁を除去した後、開頭部位を生理食塩水で洗浄します。湾曲した先端の外科用鉗子を使用して、目に見えるくも膜をそっと取り除きます。先端がまっすぐな手術用鉗子を使用して、3ミリメートルのガラスカバースリップを下に向けて滅菌ガラス窓を持ち上げます。開頭部位の上にガラス窓を配置して調整し、窓が開頭部の端にぴったりと収まるようにします。5ミリガラスのカバースリップが上部にあります。前に示したように歯科用セメントを準備し、セメントがペースト状で厚くなるまで約6分間待ちます。セメントがペースト状で厚くなるのを待っている間に、脳定位固定装置マニピュレーターを介して窓に十分な量の圧力をかけ、頭蓋骨がガラス窓にしっかりとしっかりと接触することを確認します。調整可能な精密アプリケーターブラシを使用して、窓の端に沿って少量のセメントを追加し、ガラス窓を頭蓋骨で密閉します。約10分待ってセメントを完全に乾かしてから、静かに解放し、窓の上のマニピュレーターを取り外します。余分なセメントが窓を覆っている場合は、FG4カーバイドビット付きの歯科用ドリルを使用して歯科用セメントをトリミングして完了します。術後約4時間で2光子イメージングを行い、表在性では血管系が黒く見え、約400マイクロメートルの深部ではEGFPタンパク質の発現が細胞体全体にびまん性に分布していました。TBIの1週間後と4か月後に、0日目の時点で観察された血管系パターンを基準として使用して、同じ画像領域を特定しました。血管系パターンは0日目のパターンと似ています。同様に、EGFP発現は細胞体全体で検出されました。0日目と4か月の蛍光強度は、表層レベルと深部レベルの両方で類似していました。しかし、1週間後の蛍光強度は、0日目および4か月の蛍光強度よりも低く、おそらく他のTBIモデルで報告された翻訳抑制が原因でした。開頭手術を行う際には、脳組織を傷つけないように細心の注意を払うことが重要です。ドリルの先端を脳に挿入しないでください。この技術を用いることで、研究者は、TBI後の異なる段階において、同じ細胞内の異なるタンパク質を縦断的に可視化し、外傷後の哺乳類脳におけるそのタンパク質の局在、発現、溶解性に関する情報を提供することができます。

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このビデオは、マウスでの外傷性脳損傷(TBI)の送達を示しています。頭蓋骨を露出させた後、TBIサイトがマークされます。次に、マウスをTBIデバイスの下に配置します。衝撃は、金属棒を持ち上げ、頭蓋骨と接触しているインパクターに自由に落下させることによってもたらされます。...

マウス脳への外傷性脳損傷の送達

出典:Bisht, K., et al.マウスの神経免疫ダイナミクスの反復in vivoイメージングを実行するための正確な脳マッピング。J. Vis. Exp.

頭蓋骨インプラントを用いた神経免疫動態の蛍光イメージング

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

マウス脳微小血管系のIn vivoイメージングのための2光子顕微鏡

ニューロンにおける経験依存的分子変化は行動の課題に応じて適応する脳の能力のために不可欠である。アン...

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

生きている動物のTime-lapse imaging...

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。...

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

経頭蓋光学イメージングは、無傷の頭蓋骨を介して生きているマウスの皮質における脳脊髄液輸送の広視野イメージングを可能にする。...

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。...

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

学ぶ2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスモデルにおける生体内イメージング法。頭蓋窓インプラントとEGFP発現ニューロンの時系列モニタリングにより、機械的ストレスに対する神経応答を可視化し、TBI後の急性期・慢性期の神経機能変化を評価する。

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

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