フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価
2022年11月18日
本研究では、フルオレセインイソチオシアネート標識(FITC)デキストラン を経口強制 投与してマウスに投与し、 in vivo および血漿および糞便サンプルの両方で腸透過性を評価します。腸のバリア機能は多くの疾患プロセスで影響を受けるため、この直接的かつ定量的なアッセイは、さまざまな研究分野で使用できます。
この方法は、状態が腸バリアの完全性を変更するかどうか、または潜在的な治療法が腸バリアの完全性を維持できるかどうかについての質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vivoでの腸透過性を評価および定量するための非侵襲的で低負担の技術を提供することです。まず、マウスを4時間絶食させ、次に38ミリメートル22ゲージの滅菌湾曲経管栄養針を使用して、200マイクロリットルのFITCデキストラン懸濁液を経口経管栄養で各マウスに投与します。
最初の経管投与後にタイマーを開始し、各経管栄養の間に5〜10分待って、経管投与後1時間を維持しながらin vivo測定を可能にします。残りのFITCデキストラン懸濁液を標準曲線に保ちます。スタートボタンを押したままにしてマシンとソフトウェアを起動し、システムをウォームアップさせます。
[デバイスの状態]をクリックし、続行する前に、構成されているすべてのデバイスが[OK]と表示されていることを確認してください。次に、新しいスタディをクリックし、目的の名前でファイルを保存します。次に、学習オプションをクリックします。
試料IDを入力し、正しいレーザーを選択して実験します。次に、電気シェーバーを使用して腹部から毛皮を取り除き、乾燥を防ぐために獣医用軟膏を目にたっぷりと塗ります。イメージングチャンバーを開き、動物をスキャンプレートの上に背側に置きます。
次に、手足と尾をテープで固定します。次に、描画ツールを使用してスキャンする領域を選択します。肝臓のすぐ上から直腸までの腹部の全幅を含めるようにしてください。
次に、[変更]ツールをクリックして、描画した領域を調整します。スキャン解像度を2.0ミリメートルに設定し、[開始]をクリックしてスキャンを開始します。次に、選択したファイル名で画像ファイルを見つけて開き、同期された設定ですべてのファイルを同時に開きます。
画像設定ツールバーを使用して、[画像の同期] ボタンと [スケールの同期] ボタンを使用して画像設定を同期し、正確な比較を行います。次に、調整されたスケールで画像を保存します。画像化システムに関連するソフトウェアを使用して、均一にスケーリングされた画像上の各動物および対照マウスの腹部蛍光を比較する。
経管投与の4時間後に滅菌チューブに各マウスから糞便ペレットを採取する。次に、チューブを氷の上に置き、暗所に置きます。次に、血液サンプルを9, 390 x gで室温で10分間遠心分離します。
次に、血漿を新しい滅菌チューブに移し、暗闇の中で氷の上に置いておきます。50ミリグラムの糞便サンプルを200マイクロリットルのPBSで希釈し、血漿をPBSで1対2の比率で希釈します。100マイクロリットルのサンプルと標準物質を不透明な黒色の96ウェルプレートにプレートします。
蛍光プレートリーダーで、485ナノメートルで励起し、530ナノメートルで吸収する蛍光を読み取ります。最後に、蛍光を標準曲線の既知の濃度と比較することにより、サンプルあたりのFITCデキストランの濃度を決定します。in vivo蛍光の分析は、対照食のみを投与されたマウスは、イヌリン補充食を摂取したマウスと比較して、FITCデキストランの肝摂取量が多く、腹腔内の残留蛍光レベルが高いことを示しました。
イヌリン補充食を投与されたマウスは、対照食のみを投与されたマウスと比較して、血漿中のFITCデキストランのレベルが有意に低かった。一致して、イヌリン食を摂取したマウスは、対照食のみを摂取したマウスよりも糞便中のFITCデキストランのレベルが有意に高かった。対照マウスの糞便中のFITC−デキストランのレベルが低いことは、適切に排泄されるのではなく、腸の障壁を通って循環に浸透したことを示している。
血漿中の高レベルのFITCデキストランは、この発見を補強しました。この手順を実行するときは、タイミングが不可欠です。蛍光の読み取りとサンプルの収集は、個々のマウスの経管投与後1時間および4時間にできるだけ近づけて行う必要があります。
概要
本研究では、経口投与したフルオレセインイソチオシアネート標識（FITC）デキストランを用いて、マウスの腸管透過性を評価します。この手法により、さまざまな疾患プロセスの理解に不可欠な、生体内（in vivo）での腸管バリア機能の評価が可能となります。
研究の主要構成要素
研究領域
- 腸管バリア機能の完全性
- 動物モデル研究
- 非侵襲的評価手法
背景
- 疾患状態において、腸管透過性はしばしば変化します。
- 腸管バリアの完全性を維持することは、健康にとって極めて重要です。
- 動物実験では、非侵襲的な手法が好まれます。
使用した手法
- 経口投与によるFITC-デキストランの投与
- 実験生物システムとしてのマウス
- 定量のための蛍光プレートリーダー
主な結果
- 対照食を投与したマウスは、イヌリン補充食を投与したマウスと比較して、肝臓の蛍光レベルが高かった。
- イヌリン食を投与したマウスでは、血漿中のFITC-dextranレベルの低下が観察された。
- イヌリンを補充したマウスでは、糞便中のFITC-dextranレベルが高く、腸管バリアが効果的に維持されていることが示された。
結論
- 本研究では、腸管バリア機能を評価するための信頼性の高い手法を実証しています。
- これらの知見は、腸管の完全性を維持する上での食事介入の重要性を強調するものです。
よくある質問
産業界における重要性
腸管バリア機能の完全性を定量的に評価することは、腸管の健康や全身性炎症を標的とする初期段階のプログラムにおけるリスク低減に不可欠です。FITC-dextranアッセイは、腸管透過性を直接的かつリアルタイムに読み取ることができ、前臨床モデルにおける治療的介入や食事改変の確実な評価を可能にします。この機能は、探索生物学とトランスレーショナルリサーチの接点における予測的な意思決定を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- メカニズム上のエンドポイントとして、腸管バリア機能を直接的に評価することが可能になります。
- 粘膜の完全性を調節するターゲットに対する生物学的なリスク低減をサポートします。
- 腸管に関連する適応症の候補化合物選定において、予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 生体内（in vivo）における腸管透過性を測定するための、検証済み定量システムの提供。
- 化合物および食事介入スクリーニングにおける再現性を確保するための、アッセイ出力の標準化。
- 動物モデルにおける腸管バリア調節因子の、スケーラブルで非侵襲的な評価を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 前臨床のリードアウトを、腸の健康状態に関する疾患関連バイオマーカーと整合させます。
- 創薬からバリア標的療法の前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 機能的な腸管バリアの結果に基づき、リスク調整後の進展決定に情報をなします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このFITC-dextranアッセイは、発見から前臨床への継続的なプロセスに組み込まれ、腸管バリア機能に関するメカニズム研究とトランスレーショナルなバイオマーカー検証を橋渡しします。
- 探索生物学： 遺伝的、食事的、または薬理学的介入が粘膜透過性に及ぼす影響を定量化します。
- スクリーニング： 候補となる介入策の相互比較のために、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析： 蛍光ベースの測定により、群間での腸管バリア機能の完全性の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 候補物質を推進させる際、腸管透過性の臨床バイオマーカー戦略と整合させます。
- 企業内での再利用： 複数のプログラムにわたって腸管バリア評価を行うための、標準化され再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 腸管バリア調節およびターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 前臨床ワークフローにおけるアッセイの標準化、再現性、およびスループットを向上させる。
- 戦略的価値： バリア機能の整合性に関する直接的な機能的リードアウトを提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 腸管の健康または全身性炎症を標的とするアセットの、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 動物の取り扱い、経口投与、および蛍光イメージングの専門知識が必要です。
- 生体内イメージングシステムおよび蛍光プレートリーダーへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、サンプリングのタイミングとサンプル処理についてチーム間での標準化が求められます。
- マウスにおけるさまざまな食事、遺伝的、または薬理学的介入モデルに適応可能です。
- 正確な透過性評価には、サンプル収集のタイミングが極めて重要です。
