Name: インビボ 乳腺内注射によるマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 学ぶマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入法。乳頭経由のウイルスベクター注入により、定量的に制御可能な遺伝物質の送達を実現し、自然な腫瘍発生を模倣する乳腺モデルを構築する手法です。

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この原稿に対する有益なコメントをくださったゲイリー・チャムネス博士に感謝します。この研究は、国防総省(DOD)のCDMRP BC191649(YL)およびBC191646(YL)、ならびに国立衛生研究所(NIH)CA271498(YL)の支援を受けました。著者らは、SPORE P50CA186784がサポートするブレストセンター病理学コア施設、およびジョエルM.セダーストロムの支援を受けてCPRIT-RP180672、NIH CA125123、およびRR024574によってサポートされているサイトメトリーおよびセルソーティングコアに感謝したいと思います。

マウスを用いた全ての手順は、施設動物管理使用委員会が承認した動物プロトコルに準拠して実施した。本研究では、9〜12週齢のFVB / NまたはMMTV-tva 雌マウスを使用しました。マウスは、商業的または自作的に入手した( 材料表参照)。Lenti-EGFP (FUCGW)およびRCAS-Erbb2(Neu) ウイルスを使用した。ウイルス調製および力価決定は、以前に公表された報告10、12に従って行った。
1.シリンジの準備
<ol><li>33Gの金属製ハブニードル( 材料の表を参照)を長さ約1cmにカットします。オートクレーブ処理後、針と50 μLシリンジを70%アルコールで保管します。</li>
	<li>アルコールから注射器と針を取り出します。残りのアルコールを注射器と針から押し出します。オートクレーブ滅菌された吸収性ベンチパッド上で空気乾燥するためにシリンジを分解します。</li>
	<li>乾燥後にシリンジを組み立てます。</li>
</ol>2.ウイルスの準備
<ol><li>必要に応じて1つまたは複数のウイルスストックチューブを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上でウイルスを解凍します。 注:感染する細胞の数によっては、この時点で1x PBSを使用してウイルスを目的の力価に希釈する必要がある場合があります。</li>
	<li>ピペットチップをブロモフェノールブルー粉末に1cmの深さまで浸して、ブロモフェノールブルーを追加します( 材料の表を参照)。次に、付着した微量のブロモフェノールブルーをウイルス懸濁液に入れます。 注:本研究では、ウイルスストックは通常チューブあたり200 μLであるため、最終的な色素濃度は約0.2%(0.2 μg / 100 μL)です。ブロモフェノールブルーは、1250 Wの高出力で45秒間マイクロ波放射で滅菌する必要があります(材料の表を参照)。手順全体を無菌環境で運ぶようにしてください。</li>
	<li>ブロモフェノールブルーを10回上下にピペッティングしてウイルス溶液と混合します。</li>
	<li>ウイルスを氷の上に置き、氷のバケツをビバリウムに持って行きます。</li>
</ol>3.動物の準備
<ol><li>2 μL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン、 材料の表を参照)の腹腔内注射により、雌マウスを麻酔します。.つま先のつまみで麻酔の深さを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。 注意: マウスは、十分な麻酔下でつま先のつまみに反応しない必要があります。イソフルランはまた、マウスを麻酔するために使用され得る。</li>
	<li>マウスを暖かいパッドの上に仰臥位にし、粘着テープを使用して四肢すべてをベンチに取り付けます。</li>
	<li>注射する乳首を1つ(または複数)特定します(本研究では4番が好ましい)。ハサミを使って周囲の髪をトリミングして露出させます。</li>
	<li>70%アルコールとヨードフォア綿棒を乳首領域に3ラウンドで塗布し、乳首をきれいにして露出させます。</li>
</ol>4.ウイルスの管内注射
注意: 拡大lamp 乳首の開口部を視覚化するために使用できます。
<ol><li>拡大鏡ランプの下に小さな中央管開口部が見えるまで、滅菌マイクロダイセクションスプリングはさみを使用して乳首の遠位先端を横断します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>10 μLのウイルス/ブロモフェノールブルー混合物をシリンジに入れます。 注:このデモンストレーションでは、Lenti-EGFP (FUCGW)とRCAS-Erbb2(Neu) を使用しています。</li>
	<li>拡大鏡ランプを使用して、針を乳首の開口部に慎重に挿入します。針の向きは、主管に合わせて内側から外側にわずかに調整されます。</li>
	<li>10 μLのウイルス全体をダクトツリーに注入します。 注:注射が成功すると、皮膚の下のダクトが青くなるはずです。局所的な色の変化の抵抗または外観は、注射の失敗を示します。</li>
	<li>マウスが完全にウェイクアップするまで(~30-60分)、45°Cに設定されたスライドウォーマーにマウスを置きます。</li>
</ol>5. 蛍光実体顕微鏡による感染細胞の検出
<ol><li>GFPまたは他の蛍光遺伝子を搭載したウイルスを注射してから3〜5日後、4 uL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン)を過剰投与してマウスを安楽死させます。</li>
	<li>胸腔を開きます。はさみを使用して、腹側の中央線に沿って、および上肢と下肢に沿って皮膚を切ります。皮膚を持ち上げて乳腺を露出させます。</li>
	<li>鉗子とはさみを使用して、注射した乳腺を皮膚から取り除きます。また、コントロールとして注射されていない腺を取り除きます。</li>
	<li>乳腺をスライドガラスの上に置き、腺を元の形に広げます。</li>
	<li>蛍光実体顕微鏡で腺を観察し、画像化します。</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+rabbit+beta-globin+gene+into+the+mouse+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line.</a> Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).</li>
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<li>Du, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-TVA+in+the+mammary+gland%3A+an+in+vivo+oncogene+screen+and+a+high+fidelity+model+for+breast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation.</a> Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
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<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
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<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
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<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

両方の著者は利益相反を宣言しません。

本稿では、マウス乳腺上皮細胞に遺伝子を導入するためのウイルス管内注射技術を示し、散発性乳癌をモデル化する。通常、少なくとも5週以上のマウスは、乳腺が発達した後に発癌過程が始まるように注射される。その上、5週齢未満のマウスの乳頭開口部は、注射するには小さすぎることがよくあります。一方、非常に古いマウスの乳首は時々退化しており、切断では管開口部が明らかにならないことがあります。また、一部のトランスジェニックまたはノックアウト腫瘍モデルの乳首は、生殖細胞系列の遺伝子変異によって引き起こされる異常な乳腺の発達のために注射が困難な場合があることに注意することも重要です。
ウイルスの取り扱いに標準的な個人用保護具(PPE)の使用を練習することに加えて、実験者の手に偶発的な針刺しがつかないように注意する必要があります。鳥白血病ウイルスがヒトに感染するという証拠はありませんが、げっ歯類の癌モデリングに使用されるレンチウイルスはヒトにも感染する可能性があります。偶発的な感染からのこの保護は、ウイルスが強力な癌遺伝子25を持っている場合に特に重要です。<...

乳腺の上皮細胞は、これらの腺の機能に大きな役割を果たしており、乳がんの起源の主要な細胞です。乳腺生物学および腫瘍形成の研究は、しばしばこれらの細胞への目的の遺伝子の送達を必要とする。各マウス乳腺は、乳頭の先端に単一の開口部を有する上皮細胞によって裏打ちされた管樹を含む。この構造により、乳腺上皮細胞はウイルスベクターに容易にアクセスでき、乳管内注射 を介して 乳管樹の内腔に送達することができます1。
乳管内注射の技術は、もともとヤギ、ウサギ、ラットなどのはるかに大きな動物に使用されていました1。マウスのようなはるかに小さな動物の場合、管内注射には多くの繊細なツールとオペレーターのより多くの練習が必要です。マウスの乳管内注射には2つのアプローチがあります。1つは乳首注射1です。もう1つは、外科的曝露後の#3または#4乳腺の一次管の直接注射です1。最初の手法は非侵襲的で、オペレーターが十分に訓練されると高速であるため、この手法がより一般的に使用され、この記事で詳しく説明します。
目的の遺伝子がマイクロインジェクション2,3,4によって受精卵の段階で導入される広く使用されている従来のトランスジェニックマウスモデルと比較して、管内ウイルス注入法による遺伝子送達には、以下を含む多くの利点があります。(2)目的の遺伝子によって課せられる乳腺の正常な発達に対する潜在的な障害を回避します。(3)出生後任意の時期に目的の遺伝子を導入する;(4)目的の遺伝子を2つ以上容易に同時導入できる;(5)感染した癌遺伝子を運ぶ細胞は正常細胞に囲まれているため、自然の腫瘍形成プロセスをよりよく模倣します。(6)TVA(腫瘍ウイルスA、鳥類細胞表面タンパク質およびレトロウイルスRCASベクターの受容体)技術5と組み合わせて、目的の遺伝子を特定の細胞集団に導入して、腫瘍形成の細胞起源を研究し、乳腺における細胞系譜追跡アッセイを実施することができる6、7、8、9.
レトロウイルス10、レンチウイルス11、12、アデノウイルス13、およびアデノウイルス関連ウイルス(AAV)14に由来する任意のベクターを、遺伝物質の管内送達に使用できます。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムに永久に組み込まれます。これにより、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に安定して導入します。レンチウイルスは遭遇する任意の細胞のゲノムに組み込むことができるが15、レトロウイルスの効率的なゲノム統合には標的細胞の増殖が必要である16。アデノウイルスおよびAAVベクターは感染細胞のゲノムに組み込まれないため、目的の遺伝子を一時的に発現するだけです17,18。この特徴は、フロックス腫瘍抑制遺伝子を欠失させるために、Creなどの目的の遺伝子を短時間だけ発現させる必要がある場合に有利となり得る。
レンチウイルス、アデノウイルス、およびAAVは、遭遇するマウス細胞に感染します。しかし、管腔上皮は基底膜によって間質からさらに分離されている下にある基底層から大部分が絶縁されているため、管内注射は感染を主に乳がんの起源の初代細胞である管腔上皮細胞に限定します。この管腔上皮層内には、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞のいくつかのグループを含む、異なる細胞サブタイプもあります。管腔細胞集団内の特定の細胞サブセットに感染するために、TVA技術が使用され得、これを用いて、トリ白血病ウイルス由来RCASベクター5、10または偽型レンチウイルスベクター11が、幹細胞6または特定の前駆細胞6においてのみ活性であるプロモーターなどの細胞型特異的プロモーターの制御下でTVA導入遺伝子を有するマウスにおいてTVAを発現する細胞に選択的に感染する、7または肺胞細胞8またはWnt経路活性細胞9。
このプロトコルは、ウイルスベクターの管内注射を通じて乳腺上皮細胞に目的の遺伝子を導入する技術を提示します。次に、導入された遺伝子の発現および結果として生じる過形成病変および腫瘍の検出が実証される。

<table><tbody><tr><td>アンチHA抗体</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-101P</td><td>希釈率: 1 : 1000</td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td>B5525</td><td>マイクロ波放射 45 秒間 1250W 電子レンジ</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>蛍光体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW レンチ</td>ウイルス <td>自作</td><td>N/A</td><td>参照 #12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン針</td><td>ハミルトン</td><td>91033</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>201000</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>LED 拡大鏡</td><td>インターテック</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖スプリングシザー</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>自作</td><td></td><td>参照 # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td> <td>自作</td><td>N/A</td><td>参照 # 10</td></tr><tr><td>げっ歯類 コンボ麻酔薬 III</td><td>獣</td><td>医薬局 獣医処方</td><td>37.6 mg/mL ケタミン、1.92 mg/mL キシラジン、0.38 mg/mL アセプロマジン</td></tr></tbody></table>

インビボ 乳腺内注射によるマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

マウス乳腺は、上皮細胞が並ぶ管樹で構成され、各乳首の先端に1つの開口部があります。上皮細胞は乳腺機能に大きな役割を果たしており、ほとんどの乳腺腫瘍の起源です。目的の遺伝子をマウス乳腺上皮細胞に導入することは、上皮細胞における遺伝子機能を評価し、マウス乳腺腫瘍モデルを作成する上で重要なステップです。この目標は、目的の遺伝子を運ぶウイルスベクターをマウス乳管樹に管内注射することによって達成できます。注入されたウイルスはその後乳腺上皮細胞に感染し、目的の遺伝子を持ち込みます。ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルス(AAV)であり得る。この研究は、ウイルスベクターのマウス乳管内注射を通じて、目的の遺伝子が乳腺上皮細胞にどのように送達されるかを示しています。 GFP を保有するレンチウイルスは送達された遺伝子の安定した発現を示すために使用され、 Erbb2 (HER2 / Neu)を運ぶレトロウイルスは癌遺伝子誘発性の非定型過形成病変および乳腺腫瘍を示すために使用されます。

代表的なデータは、管内注射の成功、ウイルス感染の成功、および乳腺腫瘍形成に対する送達された遺伝子の影響を示すためにここに提示されています。注入されるウイルスの量は、各実験の目的に合わせて調整する必要があります。乳管樹がどれほど広範囲に感染するかを説明するには、GFPなどの画像化可能な遺伝子を運ぶ大量のウイルスを使用する必要があります。一方、自然な自発的な腫瘍形成を模倣するには、癌遺伝子を保有する少量のウイルスを使用して、少数の細胞のみが感染し、前癌病変、最終的には浸潤癌に進化するようにする必要がありますそうでなければ完全に正常な乳腺の分野で。
膵管内注射の成功は、乳腺を露出させ、青い管の木を観察することですぐに確認できます(図1)。Lenti-EGFP(FUCGW)ウイルス(~106 IU)12を注射してから2〜5日後に、乳腺上皮細胞感染をホールマウント調製物とそれに続く蛍光実体顕微鏡下で観察することによって評価することができます(<s...

本プロトコルは、乳頭 を介した ウイルスベクターの乳管内注射を記載し、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に送達する。

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

この方法は、遺伝物質を特別で一時的かつ定量的に制御可能な方法で乳腺上皮細胞に送達する。乳腺上皮細胞への遺伝物質の送達は特別で一時的かつ定量的に制御されているため、この方法によって生成された乳腺モデルは、自然な腫瘍発生をよりよく模倣します。33ゲージの金属製ハブ針を約1センチの長さに切断し、アルコールに保管することからシリンジの準備を開始します。アルコールから注射器と針を取り外し、残りのアルコールを注射器と針から押し出します。次に、空気乾燥のためにシリンジを分解します。乾燥後、シリンジを組み立てます。マイナス80°Cの冷凍庫からウイルスストックチューブを取り出し、氷上で解凍します。ブロモフェノールブルーを加えるには、ピペットチップをブロモフェノールブルー粉末に1センチメートルの深さまで浸します。次に、付着した微量のブロモフェノールブルーをウイルス懸濁液に入れます。ウイルスを氷の上に置く前に、10回上下にピペッティングしてブロモフェノールブルーをウイルス溶液と混合します。麻酔をかけた雌マウスのつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。動物が麻酔下にある間、乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。マウスを暖かいパッドの上に仰臥位にし、粘着テープを使用して四肢すべてをベンチに取り付けます。注入する乳首を特定し、ハサミを使用して周囲の髪を整えて露出させます。70%アルコールとイオタ4本の綿棒を交互に3回に分けて乳首部分に塗り、乳首をきれいにして露出させます。拡大鏡ランプの下に小さな中央管開口部が見えるまで、滅菌されたマイクロ解剖スプリングハサミを使用して乳首の遠位先端を横断します。次に、10マイクロリットルのウイルスブロモフェノールブルー混合物をシリンジに入れ、拡大鏡ランプを使用して針を乳首の開口部に慎重に挿入します。10マイクロリットルのウイルス全体をダクトツリーに注入し、マウスが完全に目覚めるまで摂氏45度に設定されたスライドウォーマーにマウスを置きます。ウイルス注射の3〜5日後に胸腔を開きます。ハサミを使用して腹側の中央線と上肢と下肢に沿って皮膚を切ります。皮膚を持ち上げて乳腺を露出させます。注射した乳腺を皮膚から取り除き、注射していない腺をコントロールとして鉗子とハサミで取り除きます。完了したら、乳腺をスライドガラスの上に置き、腺を元の形状に広げてから、蛍光実体顕微鏡で観察およびイメージングします。乳管内注射の成功は、乳腺を露出させ、青い管の木を観察することによって確認されました。lenti-EGFPFUCGWウイルス注射の2〜5日後、乳腺上皮細胞感染を蛍光実体顕微鏡下でマウント全体標品を観察することによって評価した。ウイルスによって産生される蛍光タンパク質または細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のために、非感染腺および感染腺を採取し、単一の細胞懸濁液に処理

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がん研究

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学ぶマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入法。乳頭経由のウイルスベクター注入により、定量的に制御可能な遺伝物質の送達を実現し、自然な腫瘍発生を模倣する乳腺モデルを構築する手法です。

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