マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化
December 16th, 2022
神経科学で十分に研究されていない組織である脈絡叢(CP)は、中枢神経系の健康と病気に重要な役割を果たしています。このプロトコルは、CPを単離するためのマイクロダイセクション技術と、その細胞構造の全体像を得るための走査型電子顕微鏡の使用について説明しています。
脈絡叢の構成と構造についてより良い洞察を得るために、脈絡叢を脳室から分離する効率的な方法は、最初の非常に貴重なステップです。このマイクロダイセクション技術により、脈絡叢を周囲の組織で汚染することなく、その機能、生存率、および構造を含みながら、脈絡叢を脳室から解剖することが可能です。脈絡叢の分離における重要なハードルは、脳室に浮かんでいる構造を特定することです。
脈絡叢をブロモフェノールブルーで染色すると、単離が容易になります。手順を実演するのは、ラボマネージャーのエリエン・ヴァン・ウォンターゲムです。終末麻酔薬、経心灌流液、走査型電子顕微鏡(SEM)に必要な溶液、および本文に記載されているその他の溶液を準備することから始めます。
マウスの脳を隔離するために、終末麻酔された動物を背側褥瘡位置に置き、四肢をプレートに固定してマウスを固定する。70%エタノールをスプレーして胸部を消毒し、炭素鋼製の手術刃を使用して横隔膜のすぐ下を約4センチメートル切開します。皮膚を開き、外科用ハサミを使用して胸部を露出させます。
横隔膜を完全に開き、胸部を分離して肺と鼓動する心臓を露出させます。灌流ポンプを使用して、毎分4.5ミリリットルの速度で10ミリリットルの灌流溶液をマウスに経心灌流する。左心室に26ゲージの針を挿入して、溶液を全身回路に送り込みます。
外科用ハサミを使用して、血液が循環しないように右心房を切ります。マウスの断頭後、耳の間から目の上に切開を行うことによって頭皮を切り開いた。皮膚を横方向に引っ張って頭蓋骨を露出させます。
次に、鼻の部分に向かって扁平上皮縫合糸をたどって頭蓋骨を切り開きます。完了したら、脳を氷のように冷たいペトリ皿に入れ、1ミリリットルの氷冷PBSを脳組織に加えます。第四脳室に浮遊する脈絡叢を分離するために、メスを使用して小脳を大脳から静かに切断します。
小脳から残りの脳幹組織部分を取り除きます。切断線が上を向くように脳を回転させ、脈絡叢が背側にあるセクションの中央に第4脳室腔が見えるようにします。必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引っ張って心室を開きます。
小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。脈絡叢を側脳室から分離するために、小さな鋭い鉗子を使用して脳を2つの半球に矢状に切断します。切断線が上になるように1つの脳半球を回転させます。
側脳室を明らかにするために、視床から皮質をそっと引き離します。海馬を矢状中央切断線まで引っ込めます。側脳室が見えるようになり、脈絡叢が心室の下部にあります。
必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引き開いて心室を少し開きます。小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。SEM用のサンプル調製を行うには、新たに単離した脈絡叢を新たに作られた固定溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。
完了したら、3〜5ミリリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウムバッファーを使用してサンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。サンプルを0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファー中の3〜5ミリリットルの四酸化2%オスミウムに30分間ポストフィックスします。次に、3〜5ミリリットルの超純水を使用して、サンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。
次に、エチルアルコール溶液あたり15分間、氷冷エチルアルコール濃度の増加シリーズでサンプルを脱水します。臨界点乾燥機を使用して、サンプルを適切に乾燥させます。カーボンステッカーで標本台紙にサンプルを注意深く配置し、SEMを使用して脈絡叢サンプルを視覚化します。
本プロトコルは、マウス脳外側および第4脳室からの脈絡叢の効率的な単離を容易にした。ブロモフェノールブルーとの灌流は脈絡叢の可視化をもたらした。ブロモフェノールブルーがさらなる処理工程で許可されなかった場合には、PBS−ヘパリンによる灌流または灌流なしが処理のために行われた。
脈絡叢上皮(CPE)細胞の表面のSEM形態学的分析は、第4脳室の2つの腕構造と、側脳室から分離された側脈絡叢の典型的なC字型形態を明確に示しています。SEM倍率を上げると、CPE細胞と微絨毛の頂端側に小胞様構造が認められ、SEMを用いてCPE細胞の病態変化を調査できることが示唆された。サンプルを周囲の組織と汚染しないように、脈絡叢組織に触れて取り出すだけです。
脈絡叢の構造を維持するために必要な注意を払ってください。単離された脈絡叢には、顕微鏡分析からトランスクリプトーム解析、フローサイトメトリーまで、さまざまな下流技術を適用してその構造と機能を調査できます。脈絡叢を脳からマイクロディスケーンすることで、この小さな脳組織の構造と機能についてより良い洞察を得ることができます。
この知識は、神経疾患におけるその役割をよりよく理解するために不可欠です。
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概要
この記事では、マウス脳の脳室から脈絡叢（CP）を分離するマイクロ解剖技術と、その細胞構造を観察するために走査型電子顕微鏡（SEM）を使用する技術について詳述しています。CPの構造と機能を理解することは、特に中枢神経系の健康と疾患への関与に関して、神経科学において不可欠です。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経解剖学
- 細胞生物学
背景
- 脈絡叢は重要なが研究が不十分な組織です。
- 中枢神経系の健康と病理において重要な役割を果たします。
- CPの効率的な分離と特性評価は、神経学的疾患の理解に影響を与えます。
研究の目的
- マウス脳の脳室から脈絡叢を分離する信頼性の高い方法を開発すること。
- 走査型電子顕微鏡を通じて脈絡叢の細胞構造を観察すること。
- 分離中に脈絡叢の生存能力と完全性を保持すること。
使用した方法
- 研究では、マイクロ解剖技術を使用して脈絡叢を分離します。
- 分離プロセス中はマウスモデルを使用し、特に第四脳室と側脳室に焦点を当てています。
- 方法論には、SEM分析のための終末麻酔、外科的手順、および固定が含まれます。
- 重要なステップには、視覚化を強化するためのブロモフェノールブルー染色の使用と、汚染を避けるための慎重な取り扱いが含まれます。
主な結果
- このプロトコルは、SEMを通じて形態学的分析を可能にする脈絡叢の効果的な分離を達成しました。
- 観察により、脈絡叢上皮細胞の明確な構造的特徴、微絨毛や小胞様構造が明らかになりました。
- これらの発見により、細胞レベルでの疾患関連の変化に関するさらなる調査が可能になりました。
結論
- この研究は、詳細な構造分析のために脈絡叢を分離する効率的なアプローチを示しています。
- 得られた洞察は、神経学的健康と疾患におけるCPの役割の理解を深めることができます。
- 全体として、この方法は、この重要でありながらしばしば見過ごされる脳の構成要素の研究において重要な進歩を可能にします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
