パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)
April 7th, 2023
多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。
マルチプレックスバーコード画像分析から得られる大量の生物学的情報により、科学者は腫瘍の微小環境と腫瘍細胞内の特別な分布をよりよく理解することができます。この方法の主な利点は、同じ組織サンプルからはるかに詳細な情報を提供し、個々の細胞のより深い表現型を行うことができることです。この方法により、カスタマイズ可能なパネルが腫瘍微小環境を研究し、新しい標的治療として使用する可能性のある癌組織の予測バイオマーカーを発見することができました。
オリゴヌクレオチド結合抗体染色を開始するには、カバースリップを0.1%Poly-L-リジン溶液に室温で24時間浸し、組織の配置と接着の準備をします。ポリ-L-リジン溶液を排出した後、カバースリップを超純水で30秒間洗浄します。洗浄後、超純水からカバースリップを取り出し、糸くずの出ないタオルの上に置いて一晩乾燥させます。
目的の組織の厚さ5ミクロンの切片をポリ-L-リジンを帯電させたカバースリップの中央に置き、一晩乾燥させます。カバースリップホルダーを摂氏60度のオーブンで一晩予熱します。組織切片を含むカバースリップを予熱したホルダーに入れます。
摂氏60度で30分間焼いた後、パラフィンが組織から溶けたことを確認します。サンプルが入っているカバースリップホルダーを一連の溶液に順番にすばやく配置します。最後に、カバースリップホルダーをDEPC処理された超純水に5分間ずつ2回入れます。
空のピペットチップボックスの底に水に浸したペーパータオルを置いて、湿度チャンバーを準備します。圧力鍋に、50ミリリットルのビーカーの半分の高さを覆うのに十分な水を入れます。サンプルあたり5ミリリットルのメタノールを摂氏4度のビーカーに入れます。
必要量のAR9バッファーをピロ炭酸ジエチルまたはDEPC処理超純水で1倍に希釈します。次に、50ミリリットルのガラスビーカーに約40ミリリットルの希釈AR9バッファーを充填します。ビーカーのカバースリップホルダーにサンプルを沈め、ビーカーをアルミホイルで完全に覆います。
アルミホイルで覆われたビーカーを水で満たされた圧力鍋に入れ、約15PSIで20分間調理します。次に、ビーカーを取り外し、アルミホイルを慎重に開梱します。ビーカーを室温で約10分間冷却します。
カバースリップホルダーを1X AR9バッファから取り外します。DEPC処理した超純水中で2回2分間インキュベートします。一方、水和バッファー、抗体希釈液、およびブロッキング溶液N、G、J、Sをマルチプレックスイメージング染色キットから取り出します。
カバースリップサンプルを5ミリリットルの水和バッファーに2回、それぞれ2分間入れます。次に、カバースリップサンプルを5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックに入れ、室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、抗体カクテルを調製します。
インキュベーション後、カバースリップを前もって準備した湿度チャンバーに入れます。190マイクロリットルの抗体カクテルをカバースリップサンプル上にピペットで入れ、室温で3時間インキュベートした。次に、サンプルを2回洗浄し、それぞれ5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックで2分間洗浄します。
結合した抗体を組織に固定するには、保存液で1.6%に希釈した16%ホルムアルデヒド中でカバースリップを10分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。カバースリップをメタノール中で5分間インキュベートした後、摂氏4度に予冷する。洗浄後、PBSで希釈した5ミリリットルの固定試薬中でカバースリップを再び20分間インキュベートし、保存する前にPBSで3回洗浄します。
本文に記載されている構成に従って、レポーターマスターミックスを準備します。96ウェルプレートのウェルに、レポーターマスターミックスとその実験サイクル用のバーコード化された蛍光色素を含む245マイクロリットルの溶液を入れます。図は、ここで癌腫パネルに用いたレポータープレート構成を示す。
バーコード化された蛍光色素を保護するには、96ウェルレポータープレートの上にホイルプレートカバーを接着し、プレートをマルチプレックスイメージング装置内に置きます。顕微鏡ステージにサンプルカバースリップを置き、700マイクロリットルの1:1500滴定液の核染色液を組織に手動でピペッティングすることにより、DAPIチャンネルを使用してイメージングの焦点を校正します。マルチプレックスイメージング装置を調製するには、DEPC処理した超純水を使用して10倍のマルチプレックスイメージングバッファーを1倍に希釈し、試薬ボトルに適切な溶液または溶媒を満たします。
すべての顕微鏡パラメータを設定し、画像化するサンプルカバースリップ上の関心領域を選択します。実験計画を機器マネージャソフトウェアに入力します。制御ソフトウェアの[実験]ボタンをクリックし、[実験のセットアップと管理]ウィンドウで[新しいテンプレート]ボタンをクリックします。
[プロジェクト]ボタンの横にあるスペースにプロジェクト名を入力し、サイクルの合計数を入力します。チャンネル割り当てボタンをクリックし、正しいサイクル、井戸番号、Zスタックの場所、マーカー名、クラス、各サイクルの露光時間など、各サイクルの情報を列に入力します。次に、[実験の開始] をクリックして実験を開始し、実験を保存します。
コンピューターのQuPathアイコンをクリックし、ソフトウェアを開きます。qptiff ファイルをビューアウィンドウにドラッグします。明るさとコントラストボタンをクリックして、[明るさのコントラスト]ウィンドウを開きます。
選択した列のマーカーをオンまたはオフにして、マーカー信号を表示または非表示にします。[ズームして合わせる] ボタンをクリックして、対象領域を拡大または縮小します。画像解析ソフトウェアを使用して見ると、合成画像は、すべてのマーカーまたは選択されたマーカーを必要に応じて示しました。
すべてのマーカーの信号強度、ダイナミックレンジ、および空間分布が明らかになりました。この技術により、単一の組織切片で細胞内レベルで26のマーカーすべてを分析することができました。多重画像解析プロセスに続いて、情報的アプローチにより、高次元の単一細胞データを処理および分析して、生物学的および臨床的洞察を推測することができる。
多重化バーコード画像分析は、科学者が腫瘍組織のプロファイリングを行い、パネル内のマーカーに従って研究の質問に答えることを可能にする強力な方法論です。
概要
この記事では、多重バーコーディング画像解析を利用した染色とイメージングプロトコルを紹介し、腫瘍微小環境の特徴付けを強化します。この方法により、腫瘍内の細胞組成、機能状態、相互作用の詳細な研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 腫瘍学
背景
- 多重バーコーディング画像解析により生物学的情報の抽出が向上します。
- 個々の細胞のより深い表現型解析が可能になります。
- この方法により、がん組織内の予測バイオマーカーを特定できます。
- カスタマイズ可能なパネルにより腫瘍微小環境の研究が強化されます。
研究の目的
- オリゴヌクレオチド結合抗体染色プロトコルの開発。
- 腫瘍サンプルの高次元画像解析の促進。
- 腫瘍微小環境における細胞相互作用の理解の向上。
使用された方法
- 組織接着のためのPoly-L-Lysineを用いたカバースリップの準備。
- 様々な溶液を用いた組織サンプルの連続処理。
- 抗体カクテルによるインキュベーションと結合抗体の固定。
- 高次元解析のための多重イメージング機器の使用。
主な結果
- 腫瘍微小環境の成功的な染色とイメージング。
- 細胞組成と相互作に関する詳細な情報の取得。
- 複数のマーカーを同時に分析する能力の向上。
- がん治療の新しい標的の可能性の発見。
結論
- このプロトコルにより腫瘍サンプルの包括的な解析が可能になります。
- 多重バーコーディングによりデータの豊富さが大幅に向上します。
- この方法はがん研究と治療の進歩につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed barcoding image analysis enables high-dimensional immunoprofiling and spatial mapping at single-cell resolution in paraffin tissue samples, directly addressing the challenge of tumor microenvironment characterization. This technology supports deeper phenotyping and spatial context, enhancing predictive confidence for biomarker discovery and target validation in oncology portfolios. Its compatibility with diverse sample types and preservation of tissue integrity position it as a reusable, enterprise-scale capability for translational research and discovery-stage decision making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of tumor microenvironmental pathways and cell phenotypes.
- Supports functional target validation by mapping protein expression at single-cell resolution.
- Facilitates predictive biomarker identification for oncology target triage.
- Reduces mechanistic ambiguity by integrating spatial and phenotypic data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible marker expression data across customizable antibody panels.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
- Supports reliable compound evaluation by preserving sample integrity for additional analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker mapping with disease-relevant tissue architecture.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting downstream histological analysis.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-content, spatially resolved data.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker strategies in oncology.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of tumor microenvironment and cell-cell interactions.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative multiplexed outputs for downstream workflows.
- Analytics: Delivers high-dimensional, spatially resolved measurements for robust condition comparison and clustering.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models via preserved tissue and spatial biomarker mapping.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, customizable platform for repeated use across diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by integrating spatial and phenotypic data.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows and enables reproducibility at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunostaining and high-content image analysis.
- Needs access to automated staining fluidics instruments and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of antibody panels and imaging protocols.
- Adaptable to various tissue types, including FFPE, fresh frozen, and cultured cells.
- Sample preservation enables additional downstream analyses, but throughput may be limited by imaging cycle duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:01
Oligonucleotide‐Conjugated Antibody Staining
4:39
Multiplexed Imaging Reporter Plate
5:16
Operating the Multiplexed Imaging Machine
6:31
Multiplex Image Collection and Analysis
7:01
Results: Visualization of the Acquired Multiplexed Images
7:28
Conclusion
