パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

マルチプレックスバーコード画像分析から得られる大量の生物学的情報により、科学者は腫瘍の微小環境と腫瘍細胞内の特別な分布をよりよく理解することができます。この方法の主な利点は、同じ組織サンプルからはるかに詳細な情報を提供し、個々の細胞のより深い表現型を行うことができることです。この方法により、カスタマイズ可能なパネルが腫瘍微小環境を研究し、新しい標的治療として使用する可能性のある癌組織の予測バイオマーカーを発見することができました。

オリゴヌクレオチド結合抗体染色を開始するには、カバースリップを0.1%Poly-L-リジン溶液に室温で24時間浸し、組織の配置と接着の準備をします。ポリ-L-リジン溶液を排出した後、カバースリップを超純水で30秒間洗浄します。洗浄後、超純水からカバースリップを取り出し、糸くずの出ないタオルの上に置いて一晩乾燥させます。

目的の組織の厚さ5ミクロンの切片をポリ-L-リジンを帯電させたカバースリップの中央に置き、一晩乾燥させます。カバースリップホルダーを摂氏60度のオーブンで一晩予熱します。組織切片を含むカバースリップを予熱したホルダーに入れます。

摂氏60度で30分間焼いた後、パラフィンが組織から溶けたことを確認します。サンプルが入っているカバースリップホルダーを一連の溶液に順番にすばやく配置します。最後に、カバースリップホルダーをDEPC処理された超純水に5分間ずつ2回入れます。

空のピペットチップボックスの底に水に浸したペーパータオルを置いて、湿度チャンバーを準備します。圧力鍋に、50ミリリットルのビーカーの半分の高さを覆うのに十分な水を入れます。サンプルあたり5ミリリットルのメタノールを摂氏4度のビーカーに入れます。

必要量のAR9バッファーをピロ炭酸ジエチルまたはDEPC処理超純水で1倍に希釈します。次に、50ミリリットルのガラスビーカーに約40ミリリットルの希釈AR9バッファーを充填します。ビーカーのカバースリップホルダーにサンプルを沈め、ビーカーをアルミホイルで完全に覆います。

アルミホイルで覆われたビーカーを水で満たされた圧力鍋に入れ、約15PSIで20分間調理します。次に、ビーカーを取り外し、アルミホイルを慎重に開梱します。ビーカーを室温で約10分間冷却します。

カバースリップホルダーを1X AR9バッファから取り外します。DEPC処理した超純水中で2回2分間インキュベートします。一方、水和バッファー、抗体希釈液、およびブロッキング溶液N、G、J、Sをマルチプレックスイメージング染色キットから取り出します。

カバースリップサンプルを5ミリリットルの水和バッファーに2回、それぞれ2分間入れます。次に、カバースリップサンプルを5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックに入れ、室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、抗体カクテルを調製します。

インキュベーション後、カバースリップを前もって準備した湿度チャンバーに入れます。190マイクロリットルの抗体カクテルをカバースリップサンプル上にピペットで入れ、室温で3時間インキュベートした。次に、サンプルを2回洗浄し、それぞれ5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックで2分間洗浄します。

結合した抗体を組織に固定するには、保存液で1.6%に希釈した16%ホルムアルデヒド中でカバースリップを10分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。カバースリップをメタノール中で5分間インキュベートした後、摂氏4度に予冷する。洗浄後、PBSで希釈した5ミリリットルの固定試薬中でカバースリップを再び20分間インキュベートし、保存する前にPBSで3回洗浄します。

本文に記載されている構成に従って、レポーターマスターミックスを準備します。96ウェルプレートのウェルに、レポーターマスターミックスとその実験サイクル用のバーコード化された蛍光色素を含む245マイクロリットルの溶液を入れます。図は、ここで癌腫パネルに用いたレポータープレート構成を示す。

バーコード化された蛍光色素を保護するには、96ウェルレポータープレートの上にホイルプレートカバーを接着し、プレートをマルチプレックスイメージング装置内に置きます。顕微鏡ステージにサンプルカバースリップを置き、700マイクロリットルの1:1500滴定液の核染色液を組織に手動でピペッティングすることにより、DAPIチャンネルを使用してイメージングの焦点を校正します。マルチプレックスイメージング装置を調製するには、DEPC処理した超純水を使用して10倍のマルチプレックスイメージングバッファーを1倍に希釈し、試薬ボトルに適切な溶液または溶媒を満たします。

すべての顕微鏡パラメータを設定し、画像化するサンプルカバースリップ上の関心領域を選択します。実験計画を機器マネージャソフトウェアに入力します。制御ソフトウェアの[実験]ボタンをクリックし、[実験のセットアップと管理]ウィンドウで[新しいテンプレート]ボタンをクリックします。

[プロジェクト]ボタンの横にあるスペースにプロジェクト名を入力し、サイクルの合計数を入力します。チャンネル割り当てボタンをクリックし、正しいサイクル、井戸番号、Zスタックの場所、マーカー名、クラス、各サイクルの露光時間など、各サイクルの情報を列に入力します。次に、[実験の開始] をクリックして実験を開始し、実験を保存します。

コンピューターのQuPathアイコンをクリックし、ソフトウェアを開きます。qptiff ファイルをビューアウィンドウにドラッグします。明るさとコントラストボタンをクリックして、[明るさのコントラスト]ウィンドウを開きます。

選択した列のマーカーをオンまたはオフにして、マーカー信号を表示または非表示にします。[ズームして合わせる] ボタンをクリックして、対象領域を拡大または縮小します。画像解析ソフトウェアを使用して見ると、合成画像は、すべてのマーカーまたは選択されたマーカーを必要に応じて示しました。

すべてのマーカーの信号強度、ダイナミックレンジ、および空間分布が明らかになりました。この技術により、単一の組織切片で細胞内レベルで26のマーカーすべてを分析することができました。多重画像解析プロセスに続いて、情報的アプローチにより、高次元の単一細胞データを処理および分析して、生物学的および臨床的洞察を推測することができる。

多重化バーコード画像分析は、科学者が腫瘍組織のプロファイリングを行い、パネル内のマーカーに従って研究の質問に答えることを可能にする強力な方法論です。