Name: パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ多重バーコード画像解析による腫瘍微小環境の免疫プロファイリングと空間マッピング。オリゴヌクレオチド結合抗体染色と高次元画像解析で細胞構成と相互作用を詳細に解析し、がん治療の新たな標的発見に貢献します。

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著者らは、この記事を編集してくれたMDアンダーソンの研究医学図書館の編集サービスのドナルドR.ノーウッドと、MDアンダーソンのトランスレーショナル分子病理学部門のマルチプレックスIFおよび画像分析研究所に感謝します。このプロジェクトの一部は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター、トランスレーショナル分子病理学科のトランスレーショナル分子病理学-免疫プロファイリング研究所(TMP-IL)ムーンショットプラットフォーム、およびNCI協力協定U24CA224285(MDアンダーソンがんセンターCIMACへ)によってサポートされました。

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著者は開示すべき矛盾はありません。

TMEは、がんの発生、進行、および治療反応に不可欠な役割を果たします。さらに、TMEにおける特定の腫瘍浸潤リンパ球サブセットの密度は、特定の種類の癌の予後バイオマーカーとして役立つ可能性があります。驚くべきことに、TMEの細胞組成に加えて、腫瘍の空間的特徴は、腫瘍の生物学を理解し、潜在的な予後バイオマーカーを特定するためのアウトラインを提供することができます12,17。
多くの免疫細胞集団が前がんまたは抗がん反応に関与しているため、これらの細胞と、それらの相互およびがん細胞との空間的関係をよりよく理解することは、新しい免疫療法戦略の特定に役立ちます。以前の研究では、腫瘍内および腫瘍周囲領域の組織構造と腫瘍細胞の浸潤性辺縁に基づいて、TME細胞の位置と空間分布を層別化しています18,19。過去15年間、技術の進歩により、空間分散に基づく個々の細胞の表現型解析は、TMEを研究し、腫瘍免疫療法の潜在的なバイオマーカーを分類するための新しい影響力のあるツールになりました。多重IF組織化学は、複数の生物学的マーカー20を同時に推定することができる。
オリゴヌクレオチド結合抗体戦略と同様に、TMEの研究には、色原体、蛍光、DNAバーコード、および金属同位体標識抗体検出システムの4種類のタンパク質ベースのマルチプレックスプラットフォームが使用されます。費用対効果の高い発色IHCプラットフォームは、従来の明視野顕微鏡を使用して、スライド全体の視覚化と病理学的評価を可能にします。マルチプレックスIFおよびIHCでは、蛍光色素と結合させた抗体が使用されます。マルチプレックスIF/IHCプラットフォームは、高い特異性で抗体を検出し、細胞内レベルでも標的抗体を定量することができます6,21。さらに、発色体と蛍光色素の性質上、1枚の抗体パネルを使用することで、1枚のスライドで最大10個のバイオマーカーの発現を捉えることができます。金属同位体ベースのプラットフォーム上では、金属タグ付き抗体を使用して、単一細胞および空間分解能で多重化イメージングを実行し、個々の組織切片22に対して高感度を実行する。理論的には、これらの金属結合抗体アプローチにより、単一の組織切片で100を超えるバイオマーカーを同時に検出できます。同位体標識技術の課題の1つは、100%の純度の濃縮が23に達するのを妨げる同重体干渉です。さらに、マーカーの数が増えると干渉が増加します。DNA結合抗体検出プラットフォームは、固有のDNAバーコードで標識された抗体を認識します。これらのプラットフォームでは、40を超えるバイオマーカーを高い特異性で同時に捕捉できます6。
マルチプレックスイメージングは、DNA結合抗体を1つの組織スライドにワンステップで適用するための市販のDNAバーコード標識抗体検出プラットフォームです(図8)。組織調製段階では、メーカーから入手した金コーティングされたスライドを使用する必要があるマルチプレックスイオンビームイメージングプラットフォームとは異なり、マルチプレックスイメージングプラットフォームでは、通常のカバーガラスまたは0.1%ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドのみを使用して、組織が接着し、染色およびイメージングプロセス中に組織を無傷に保つのに役立ちます。染色されていないスライドを長期間保存すると抗原性が低下するため、切片作成後4週間以内にカバーガラスに組織切片を使用することをお勧めします。染色されたカバーガラスサンプルは、染色シグナルを失うことなく、4°Cの保存バッファーで最大2週間維持できます。カバーガラスサンプルの保管に特別な装置は必要ありません。マルチプレックスイメージングシステムは、カバーガラスの代わりに通常のスライドを使用するようにアップグレードされ、より大きな組織の染色と簡単な取り扱いが可能になりました。抗体結合に還元溶液を使用する場合(ステップ3.2.3)、抗体の損傷を防ぐために、反応を30分以内に制限する必要があります。手順 5.6.6 のブロッキングバッファは新しく準備する必要があり、ブロッキングバッファは再利用しないでください。
色原体、蛍光、および金属同位体標識マルチプレックス抗体検出プラットフォームと比較して、マルチプレックスイメージング技術には特定の利点があります。例えば、マルチプレックスイメージング用に60を超える設計済み抗体パネルが市販されており、抗体結合および検証の時間とコストを節約するのに役立ち、事前に設計された抗体パネルの数は増加しています。これらの抗体には、がんマーカーの汎サイトケラチン、黒色腫マーカーSOX10、血管マーカーCD31、間質マーカーSMA、および多数の免疫細胞マーカーが含まれ、検証済みで実験の準備ができています。事前に設計されていない抗体の場合、マルチプレックスイメージングで使用するために設計された市販のコンジュゲーションキットは簡単でユーザーフレンドリーです。顧客結合抗体は、4°Cで保存した場合、1年間有効です。 さらに、画像をキャプチャするために機械のウォームアップは必要ありません。このマルチプレックスイメージング技術では、画像取得における反復洗浄、ハイブリダイゼーション、およびストリッピングステップが、マーカー強度の低下または組織形態の劣化をもたらすことはめったにありません5、24、25。さらに、合成画像は、シンプルな3色蛍光顕微鏡でQPTIFF形式でキャプチャされ、サードパーティのデジタル分析ソフトウェアを使用してアップロードおよび分析できます。染色マーカーは単一細胞の解像度で視覚化でき、細胞の表現型はマーカーの共局在によって特徴付けることができます(図6および図7)。多重化された画像を包括的に解析することで、組織コンパートメント、単一細胞マーカーの定量化、最近傍および近接データをさらに明らかにします(図8)。
多重画像解析における課題は、細胞型の同定です。通常、より多くの単一オブジェクト分類器が画像に適用されると、より一般的でない表現型に注釈が付けられます。したがって、同じ分類器で共発現していない既知のマーカーを使用し、表現型関連の分類器のみを単一細胞のアノテーションに適用することが推奨されます。細胞タイプのアノテーションのばらつきは、細胞の空間分布や細胞近傍解析の違いなど、実質的に異なる空間結果をもたらします26,27。
マルチプレックス画像解析は、FFPE組織、新鮮な凍結組織、アーカイブされたスライド全体、組織マイクロアレイなど、多くのサンプルタイプの染色とイメージングに成功することが証明されています。乳房、脳、肺、脾臓、腎臓、リンパ節、および皮膚組織切片の多重化された画像は、深い単一細胞空間表現型データ5、16、25、28を用いて取得することができる。
将来的には、マルチプレックスイメージング用に事前に設計された抗体が増えることが期待されています。さらに、多重化された画像解析のための特定のソフトウェアの開発が大いに必要とされています。現在、Hi-Plex画像解析用の市販のオープンソースソフトウェアプログラムは数多く存在しますが29、科学者はこれらの分析の標準ワークフローを作成する際に依然として支援を必要としています30,31。このプロトコルを使用してキャプチャされた合成画像はサードパーティのソフトウェアと互換性がありますが、これによりユーザーに余分なコストがかかる可能性があります。マルチプレックスイメージング技術の別の欠点は、反復洗浄、ハイブリダイゼーション、および抗体の大きなパネルによるストリッピング後の核タンパク質検出におけるシグナルの減少です。幸いなことに、レポータープレートを設計する際の早いサイクルでバーコード化された蛍光色素を取得することで、これを最小限に抑えることができます。最近、このプラットフォームは、新しい高速スキャンシステムでアップグレードされ、合成画像32を取得する時間を劇的に短縮した。さらに、チラミド結合バーコードを用いた新しい戦略が、オリゴヌクレオチド結合抗体のバーコードベースのイメージングを強化することが報告されています。この技術は、バーコード結合抗体では入手が困難な染色シグナルを増幅することを目的としています33。

腫瘍微小環境(TME)は極めて不均一であり、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、免疫細胞、細胞外マトリックスの非細胞成分、および腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞によって産生および放出される多数の豊富な分子で構成されています1,2。証拠の蓄積は、TMEが腫瘍の分化、成長、浸潤、転移、および治療への反応を再プログラミングする上で極めて重要な役割を果たすことを示しています3。
TMEの異なる細胞タイプがシグナル伝達ネットワークを介してどのように相互作用し、互いに通信するかを理解することは、がん診断の改善、免疫療法の最適化、および新しい治療法の開発に不可欠です4。免疫組織化学(IHC)や免疫蛍光(IF)などの従来の組織顕微鏡技術は、腫瘍サンプル中の細胞の種類、存在量、およびコミュニケーションを研究するために何十年も使用されてきました。残念なことに、これらの技術は通常、組織切片における1つまたは2つのタンパク質マーカーのみを評価することができ、これらの細胞間の複雑な空間的および構造的関係を明らかにすることはできない5、8、7。
過去20年間で、いくつかの多重化イメージング技術が確立されてきました8。これらの技術は、TME内の免疫細胞の組成、機能、および位置のビューを大幅に改善し、単一細胞レベルで複雑なTMEを識別し、空間的にプロファイリングする能力の急速な進歩につながります9,10。TMEにおけるさまざまな腫瘍細胞と免疫細胞の空間的および構造的関係は、現在、これらの多重イメージング技術を使用した生物学的および臨床的研究の最前線にあります11,12。
最近開発されたオリゴヌクレオチド結合抗体バーコーディングを用いたマルチプレックスイメージング技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプル中のオリゴヌクレオチド結合抗体の検出に基づく影響力のある単一細胞生物学的研究プラットフォームです13,14。現在、この多重化された画像化技術は、単一の組織切片15における100を超えるマーカーの同時画像化を可能にし、これにより、その場で区別可能な細胞型の数が増加している。これにより、従来のイムノフェノタイピングアプローチでは不可能なレベルの腫瘍および免疫細胞の空間分析が可能になります16。
ここでは、精製された抗体をオリゴヌクレオチドに結合させ、マルチプレックスイメージングプラットフォームとFFPE組織を用いたマルチサイクルイメージング手順を使用してこの結合を検証するための最適化されたプロトコルについて説明します。さらに、この技術で使用される基本的な画像処理とデータ解析の手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>10x AR9 バッファー</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900250ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer</td><td>Akoya Biosciences</td><td>7000001</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1X 抗体希釈液/ブロック</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>ARD1001EA</td><td></td></tr><tr><td>抗体標識キット</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>7000009</td><td>フィルターブロッキング液、抗体還元液1、抗体還元液2、標識液、精製液、抗体保存液</td></tr><tr><td>アッセイ試薬</td><td>アコヤバイオサイエンス7000002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>アバンター/VWR</td><td>BDH1115-4LP</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G Blocker V2</td><td>Akoya Biosciences</td><td>240199</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-329-50</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Integral 10&nbsp;</td><td>ミリポア&nbsp;</td><td></td><td></td>ZRXQ010WW</tr><tr><td>ニクノン蛍光顕微鏡</td><td>キーエンス社</td>製 <td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>核染色</td>剤 <td>アコヤバイオサイエンス社製</td><td></td> 7000003 <td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>PhenoCycler バーコード/レポーターコンビネーション</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>5450004 (BX025/RX025)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5450003 (BX022/RX022)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5450023 (BX002/RX002)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp;5250002 (BX020/RX020)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>2520003 (BX023/RX023)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250005 (BX029/RX029)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250007 (BX035/RX035)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5250012 (BX052/RX052)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550012 (BX030/RX030)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550015 (BX042/RX042)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5550014 (BX036/RX036)</td><td></td></tr><tr><td>QuPath</td><td>オープンソース</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>染色キット</td><td>(アコヤバイオサイエンス</td><td>7000008</td><td>水和バッファー、Nブロッカー、Jブロッカー、Sブロッカー、固定試薬、保存バッファーが含まれています</td></tr></tbody></table>

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

同一組織切片内の複数のエピトープを順次検出するオリゴヌクレオチドを用いた抗体バーコーディングを用いたマルチプレックスイメージング技術は、腫瘍微小環境の理解を向上させる腫瘍評価に有効な方法論です。ホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるタンパク質発現の可視化は、特定の蛍光色素を相補的なオリゴヌクレオチド を介して 抗体結合バーコードにアニーリングし、サンプルイメージングを行うことで実現されます。実際、この方法では、1回の組織染色反応で40を超える抗体のカスタマイズ可能なパネルを使用できます。この方法は、新鮮な凍結組織、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織、培養細胞、および末梢血単核細胞と互換性があるため、研究者はこの技術を使用して、さまざまなサンプルタイプを単一細胞の解像度で表示できます。この方法は、手動の染色および固定プロトコルから始まり、すべての抗体バーコードは抗体カクテルを使用して適用されます。染色流路計測器は完全に自動化されており、標準的な蛍光顕微鏡を使用してすべてのバイオマーカーがイメージングされるまで、スペクトル的に異なる蛍光色素の標識、イメージング、除去の反復サイクルを実行します。次に、画像を収集し、すべてのイメージングサイクルにわたってコンパイルして、すべてのマーカーの単一セル解像度を実現します。シングルステップ染色と穏やかな蛍光色素除去により、高度にマルチプレックス化されたバイオマーカー分析が可能になるだけでなく、必要に応じて追加の下流分析(ヘマトキシリンやエオジン染色など)のためにサンプルを保存することもできます。さらに、画像解析ソフトウェアは、画像処理(ドリフト補正、バックグラウンド減算、細胞セグメンテーション、クラスタリング)を可能にし、空間ネットワークマップを生成するための画像と細胞表現型の視覚化と分析を可能にします。要約すると、この技術は、コンピューター化されたマイクロ流体システムと蛍光顕微鏡を使用して、組織結合したオリゴヌクレオチド結合抗体に相補的な蛍光標識DNAプローブを反復的にハイブリダイズ、画像化、およびストリップします。

FFPE扁桃腺サンプルを用いて26マーカー免疫腫瘍学パネルを開発し、バーコード画像解析システムを用いてFFPE組織の免疫状態を図示した。全体として、19の抗体が現在、私たちの研究室の他のマルチプレックスイメージング研究で使用されています。すべてのマーカーは、発色性IHCを有するFFPE組織を用いて試験されている。全ての抗体を固有のDNAオリゴヌクレオチドに結合させた。このバーコード画像解析技術にウェブベースの機器マネージャ(図4)を使用してカバーガラスを設定する場合、最初と最後のサイクルは常に「空白」(図2および図4)であり、抗体からの特定のシグナルから差し引かれるバックグラウンド蛍光シグナルを提供することに注意してください。QPTIFF形式の画像を蛍光顕微鏡で収集した後、特許取得済みの自動画像解析ソフトウェアまたはオープンソースソフトウェアプログラムを使用して視覚化できます。コンポジット画像では、すべてのマーカーまたは選択したマーカーを表示して、信号を見やすくすることができます(図5)。さらに、各抗体は、核、細胞質、または膜状の局在について視覚的に評価することができる。免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞を簡単に識別できます。その後、画像解析により、すべてのマーカーの信号強度、ダイナミックレンジ、および空間分布に関する情報を提供できます(図6)。この技術により、26のマーカーすべてを細胞内レベルで1つの組織切片で分析することができました(図7)。マーカーの共局在を分析することで、細胞の表現型を特定し、空間的な細胞の位置を特定し、細胞間の距離を計算し、細胞の分布を見つけることができました。この技術の重要な影響は、組織の微小環境の免疫状態に焦点を当てた堅牢な26マーカーパネルの提示です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig01.jpg"> 図1:Bis-Trisタンパク質ゲルを用いたカスタムコンジュゲート抗体バリデーションの画像。 ゲルのレーン1はタンパク質標準を示す。レーン2およびレーン4は、バーコード結合抗体(矢印)を示す。レーン3およびレーン5は、非結合抗体由来の重鎖バンドおよび軽鎖バンドを示す(矢印)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig02.jpg"> 図2:2つのカバーガラスサンプルの染色プレート構成マップ。略語:HB =水和緩衝液;B =抗体希釈剤/ブロック;PSFS = 染色後の固定液;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;MeOH =メタノール;S =ストレージソリューション。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig03.jpg"> 図3:レポータープレートの構成。 各結合抗体には、特定のレポーターと相補的なバーコードがあります。レポータープレートをセットアップするには、すべての標識抗体とそれに対応するレポーターをリストする必要があります。次に、各抗体にサイクル番号を割り当てます。2つのブランクサイクル(C1とC18)の性能は、3つの蛍光チャネルにおける自家蛍光のレベルを評価し、画像取得制御ソフトウェアを使用してイメージング後のバックグラウンド減算に使用されます。この段階でソフトウェアウィザードが機器をチェックして、すべての設定が正しいことを確認します(図4)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig04.jpg"> 図4:実験セットアップ用の制御ソフトウェアを使用した画像取得。 (A)制御ソフトウェアの左下隅にある[実験]タブを選択して、セットアップを準備して開始します。(B,C)[新しいテンプレート] を選択して、新しいプロジェクトと実験名を使用して実験の設定を入力します。(D)開始サイクルウェルとサイクル数を、96ウェルレポータープレート内のレポーター位置を反映するように変更します。(E)実験用に指定された4つのチャンネルに適切な蛍光チャンネルを割り当てます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig05.jpg"> 図5:ウェブベースのソフトウェア(QuPath)を使用した画像の可視化。 ビューアウィンドウには、染色された扁桃腺組織FFPEセクションに26個のマーカーが表示されます。 明るさとコントラスト ウィンドウには、チェックマークの付いたマーカーが表示されます。最後に、ビューアー ウィンドウに、選択したマーカーを含む FFPE サンプルが表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig06.jpg"> 図6:Webベースのソフトウェアを使用した画像の視覚化。 (A)26個のマーカーについて扁桃腺組織切片を染色し、QPTIFF形式の切片の画像を、注釈とレビューのために市販のデジタルスライドビューアソフトウェアまたはオープンソースソフトウェア(QuPath)を使用して視覚化しました。(B-F)信号を見やすくするために、同じ注釈に6つのマーカーが表示されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig07.jpg"> 図7:Webベースのソフトウェアで使用される26の個別のマーカーのビュー。 扁桃腺組織におけるマーカー発現は、免疫腫瘍学パネル(左上)による免疫蛍光染色 によって 示されています。2 つの小さな領域 (赤い四角形) に個々のマーカーが表示されます。拡大インサートには、これらのマーカーに対して陽性のセルが表示されます(白い矢印)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig08.jpg"> 図8:多重化された画像取得ワークフローの概要。 FFPE組織切片を26抗体パネルを用いて染色し、続いてマルチサイクル反応を行った。染色切片の生画像を計算処理し、合成画像を用いて細胞密度および空間解析を行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:扁桃腺組織におけるIHC検証。 FFPE組織切片は、個々の抗体を用いて染色した。扁桃腺組織におけるマーカー発現は低倍率で示され、ズームインインサートはマーカーに対して陽性の細胞(赤い長方形)を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/Suppl%20Figure.psd" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

マルチプレックスバーコード画像分析から得られる大量の生物学的情報により、科学者は腫瘍の微小環境と腫瘍細胞内の特別な分布をよりよく理解することができます。この方法の主な利点は、同じ組織サンプルからはるかに詳細な情報を提供し、個々の細胞のより深い表現型を行うことができることです。この方法により、カスタマイズ可能なパネルが腫瘍微小環境を研究し、新しい標的治療として使用する可能性のある癌組織の予測バイオマーカーを発見することができました。オリゴヌクレオチド結合抗体染色を開始するには、カバースリップを0.1%Poly-L-リジン溶液に室温で24時間浸し、組織の配置と接着の準備をします。ポリ-L-リジン溶液を排出した後、カバースリップを超純水で30秒間洗浄します。洗浄後、超純水からカバースリップを取り出し、糸くずの出ないタオルの上に置いて一晩乾燥させます。目的の組織の厚さ5ミクロンの切片をポリ-L-リジンを帯電させたカバースリップの中央に置き、一晩乾燥させます。カバースリップホルダーを摂氏60度のオーブンで一晩予熱します。組織切片を含むカバースリップを予熱したホルダーに入れます。摂氏60度で30分間焼いた後、パラフィンが組織から溶けたことを確認します。サンプルが入っているカバースリップホルダーを一連の溶液に順番にすばやく配置します。最後に、カバースリップホルダーをDEPC処理された超純水に5分間ずつ2回入れます。空のピペットチップボックスの底に水に浸したペーパータオルを置いて、湿度チャンバーを準備します。圧力鍋に、50ミリリットルのビーカーの半分の高さを覆うのに十分な水を入れます。サンプルあたり5ミリリットルのメタノールを摂氏4度のビーカーに入れます。必要量のAR9バッファーをピロ炭酸ジエチルまたはDEPC処理超純水で1倍に希釈します。次に、50ミリリットルのガラスビーカーに約40ミリリットルの希釈AR9バッファーを充填します。ビーカーのカバースリップホルダーにサンプルを沈め、ビーカーをアルミホイルで完全に覆います。アルミホイルで覆われたビーカーを水で満たされた圧力鍋に入れ、約15PSIで20分間調理します。次に、ビーカーを取り外し、アルミホイルを慎重に開梱します。ビーカーを室温で約10分間冷却します。カバースリップホルダーを1X AR9バッファから取り外します。DEPC処理した超純水中で2回2分間インキュベートします。一方、水和バッファー、抗体希釈液、およびブロッキング溶液N、G、J、Sをマルチプレックスイメージング染色キットから取り出します。カバースリップサンプルを5ミリリットルの水和バッファーに2回、それぞれ2分間入れます。次に、カバースリップサンプルを5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックに入れ、室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、抗体カクテルを調製します。インキュベーション後、カバースリップを前もって準備した湿度チャンバーに入れます。190マイクロリットルの抗体カクテルをカバースリップサンプル上にピペットで入れ、室温で3時間インキュベートした。次に、サンプルを2回洗浄し、それぞれ5ミリリットルのマルチプレックスイメージング抗体希釈ブロックで2分間洗浄します。結合した抗体を組織に固定するには、保存液で1.6%に希釈した16%ホルムアルデヒド中でカバースリップを10分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。カバースリップをメタノール中で5分間インキュベートした後、摂氏4度に予冷する。洗浄後、PBSで希釈した5ミリリットルの固定試薬中でカバースリップを再び20分間インキュベートし、保存する前にPBSで3回洗浄します。本文に記載されている構成に従って、レポーターマスターミックスを準備します。96ウェルプレートのウェルに、レポーターマスターミックスとその実験サイクル用のバーコード化された蛍光色素を含む245マイクロリットルの溶液を入れます。図は、ここで癌腫パネルに用いたレポータープレート構成を示す。バーコード化された蛍光色素を保護するには、96ウェルレポータープレートの上にホイルプレートカバーを接着し、プレートをマルチプレックスイメージング装置内に置きます。顕微鏡ステージにサンプルカバースリップを置き、700マイクロリットルの1:1500滴定液の核染色液を組織に手動でピペッティングすることにより、DAPIチャンネルを使用してイメージングの焦点を校正します。マルチプレックスイメージング装置を調製するには、DEPC処理した超純水を使用して10倍のマルチプレックスイメージングバッファーを1倍に希釈し、試薬ボトルに適切な溶液または溶媒を満たします。すべての顕微鏡パラメータを設定し、画像化するサンプルカバースリップ上の関心領域を選択します。実験計画を機器マネージャソフトウェアに入力します。制御ソフトウェアの[実験]ボタンをクリックし、[実験のセットアップと管理]ウィンドウで[新しいテンプレート]ボタンをクリックします。[プロジェクト]ボタンの横にあるスペースにプロジェクト名を入力し、サイクルの合計数を入力します。チャンネル割り当てボタンをクリックし、正しいサイクル、井戸番号、Zスタックの場所、マーカー名、クラス、各サイクルの露光時間など、各サイクルの情報を列に入力します。次に、[実験の開始] をクリックして実験を開始し、実験を保存します。コンピューターのQuPathアイコンをクリックし、ソフトウェアを開きます。qptiff ファイルをビューアウィンドウにドラッグします。明るさとコントラストボタンをクリックして、[明るさのコントラスト]ウィンドウを開きます。選択した列のマーカーをオンまたはオフにして、マーカー信号を表示または非表示にします。[ズームして合わせる] ボタンをクリックして、対象領域を拡大または縮小します。画像解析ソフトウェアを使用して見ると、合成画像は、すべてのマーカーまたは選択されたマーカーを必要に応じて示しました。すべてのマーカーの信号強度、ダイナミックレンジ、および空間分布が明らかになりました。この技術により、単一の組織切片で細胞内レベルで26のマーカーすべてを分析することができました。多重画像解析プロセスに続いて、情報的アプローチにより、高次元の単一細胞データを処理および分析して、生物学的および臨床的洞察を推測することができる。多重化バーコード画像分析は、科学者が腫瘍組織のプロファイリングを行い、パネル内のマーカーに従って研究の質問に答えることを可能にする強力な方法論です。

multiplexed-barcoding-image-analysis-for-immunoprofiling-spatial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

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組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

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腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

このプロトコールは、マウスFFPE黒色腫組織のDNAバーコードベースのイメージングのためのマルチプレックス免疫蛍光抗体パネルを設計するためのステップバイステップガイドを提供します。また、マウスの黒色腫腫瘍免疫微小環境に対する空間的プロテオミクスの洞察を生成するためのオープンソースツールを使用した画像解析パイプラインについても説明します。...

DNAバーコードを用いたマルチプレックス免疫蛍光イメージングによる、遺伝的に再プログラムされたマウス黒色腫のFFPE検体を解析

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぶ多重バーコード画像解析による腫瘍微小環境の免疫プロファイリングと空間マッピング。オリゴヌクレオチド結合抗体染色と高次元画像解析で細胞構成と相互作用を詳細に解析し、がん治療の新たな標的発見に貢献します。

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

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