Name: 卵巣摘出マウスモデルにおける妊娠確立への子宮寄与の研究方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶ 卵巣摘出マウスモデルを用いた子宮の妊娠確立への寄与の研究方法。外科的手技とホルモン補充プロトコルにより、子宮単独の役割を解析し、生殖生物学研究に応用できます。

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この作業は、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャサポートとオーストラリア政府国家保健医療研究評議会(NHMRC)IRIISSを通じて可能になりました。この作業は、モナッシュ大学医学部、看護、健康科学プラットフォームへのアクセス助成金によってサポートされました A.L.W.(Winship-PAG18-0343)モナッシュ生殖サービスプラットフォームにアクセスするため。A.L.W.は、オーストラリア研究評議会(ARC)からのDECRA資金DE21010037によってサポートされています。JNHとLRAは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金によってサポートされています。LRAは、モナッシュ大学院優秀奨学金によってサポートされています。KJHは、ARCフューチャーフェローシップFT190100265によってサポートされています。

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著者は、競合する金銭的またはその他の利益を宣言しません。

この記事では、妊娠と出産への子宮の寄与を理解することに焦点を当てた研究のために、OVXを実行し、外因性ホルモンを提供する方法について段階的に説明します。これらの方法の2つの実験的応用について、胚移植の実施および人工的な脱落膜化の誘導を含む2つの詳細なプロトコルが提供されている。
OVXの実行は、特にげっ歯類モデルに不慣れな研究者にとって、最初は困難な場合がありますが、適切にトレーニングおよび実践すれば、比較的簡単な手順です。手順の重要なステップには、麻酔下にある動物を注意深く監視し、卵巣組織が残っていないことを確認することが含まれます。一部のモデルでは、卵管が無傷のままになることがあります。しかしながら、卵管は豊富なエストロゲンおよびプロゲステロン受容体を有するホルモン応答性組織であることに留意すべきである19。卵巣と卵管を切除するための外科的プロトコルは、前者が肉眼で完了できるため、卵巣だけを切除する場合に比べてはるかに簡単です。後者の場合、卵巣だけを取り除き、卵管を所定の位置に残すには、これははるかに複雑な手順であるため、解剖顕微...

ここ数十年で生殖補助医療の使用が増えるにつれ、受胎に対する多くの障壁が克服され、不妊の問題にもかかわらず多くのカップルが家族を始めることができました1。卵母細胞または精子の欠損は、 体外 受精または細胞質内精子注入を使用してバイパスできることがよくあります。しかし、子宮と子宮内膜受容性に関連する問題は、生殖能力のとらえどころのない「ブラックボックス」のままです2。
妊娠は、高品質の胚が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用したときに確立されます。特定の月経周期で妊娠が成功する可能性は低く、約30%です3,4。成功したもののうち、妊娠20週を過ぎて前進するのは50%〜60%のみであり、着床の失敗は20週に達しない妊娠の75%の原因です3。これらの数字は1990年代後半にさかのぼりますが、この分野は、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限をまだ克服していません。その結果、近年、体外受精の成功率が停滞し、時には低下しています5,6。
原因不明の不妊症の女性は、多くの場合、受容性の窓がずれているか、未知の理由で受容性を達成できません。最近、子宮内膜受容性アレイが開発され、胚移植のタイミングを個人の受容性のウィンドウに合わせて調整する目的で、数百の遺伝子の発現を評価します7,8,9。しかし、この分野は、着床プロセスが完了した後に現れる妊娠合併症の病因についてまだ理解されていません。
女性の生殖器系は非常に動的で、厳密なホルモン管理下にあります。視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸は、卵胞の成熟やエストロゲンとプロゲステロンの活性など、卵巣周期の側面を調節する黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンの放出を制御します。次に、子宮月経周期はエストロゲンとプロゲステロンによって調節されています10,11。したがって、子宮の生物学的メカニズムの研究は卵巣の影響によって複雑になります。たとえば、がん治療が子宮にどのように影響するかを研究する場合、観察された子宮表現型(妊娠喪失や月経非周期性など)が子宮への直接の侮辱の結果なのか、卵巣の損傷による結果的な影響なのかを区別するのは難しい場合があります。
生殖能力を包括的に理解するためには、妊娠への子宮の寄与を特徴付けなければなりません。重要なことに、この理解は卵巣の制御下にある子宮機能を超えて拡張されなければなりません。これは人間では研究できません。したがって、動物モデルがしばしば採用される。そのため、卵巣摘出術(OVX)は、研究者がホルモンを外因的に供給することにより、げっ歯類の発情周期(月経周期に類似)を調節できるようにするために一般的に使用されています。さらに、OVXは、卵巣の影響とは無関係に子宮反応を研究することを可能にします12。ただし、OVX後にホルモンがすぐに供給されない場合、更年期障害の表現型が発生するため、研究者は慎重に検討する必要があります。
OVXはげっ歯類モデル13,14,15,16,17で頻繁に利用され、適切な訓練後に比較的容易に実施できる。方法は、卵巣のみを取り除くか、卵巣と卵管を切除するか、および動物の年齢によって異なります(成体、サイクリング動物は、表面に黄体が見える大きな卵巣を持っているため、卵巣が視覚化しやすいことを意味します)。同様に、皮下注射14、徐放性ペレット15、浸透圧ミニポンプ18、および卵巣移植を含むホルモン補充の多くの方法が存在する。
この記事では、卵巣摘出術を行い、皮下注射、徐放性ペレット、浸透圧ミニポンプを含む3種類のホルモン補給を準備する方法について詳しく説明します。OVXとそれに続く外因性ホルモン補給(胚移植および人工脱落膜化)の恩恵を受ける実験エンドポイントには、2つの詳細なプロトコルが提供されています。この記事では、特に妊娠と生殖能力の研究分野で、子宮への影響を分離するための研究を実行する方法について研究者を導くことを目的として、各アプローチの長所と短所について説明します。

<table><tbody><tr><td>ALZET 1002 ミニ浸透圧ポンプ</td><td>BioScientific</td><td>1002</td><td>0.25 &micro;L / hは14日間です。セクション7(実験手順-胚移植)に使用します。</td></tr><tr><td>ALZET 1003Dミニ浸透圧ポンプ</td><td>BioScientific</td><td>1003D</td><td>Delivers 1 & micro;L / hは14日間です。セクション8(実験手順-人工脱落膜化)に使用します。</td></tr><tr><td>ALZETリフレックス 7mmクリップ</td><td>バイオサイエンティフィック</td><td>0009971</td><td>リフレックスクリップまたはミシェルクリップを創傷閉鎖に使用することができます、好みに応じて</td></tr><tr><td>ALZETリフレックスクリップアプリケーター</td><td>バイオサイエンティフィック</td><td>0009974</td><td>リフレックスクリップまたはミシェルクリップを創傷閉鎖に使用することができます、好みに応じて</td></tr><tr><td>ALZETリフレックスクリップリムーバー</td><td>バイオサイエンティフィック</td><td>0009976</td><td>リフレックスクリップまたはミシェルクリップのいずれかを創傷閉鎖に使用できますが、好みに応じて</td></tr><tr><td>Bupivicaine 注射</td><td>ファイザー</td><td>NA</td><td>ストック 0.5%。生理食塩水エ</td></tr><tr><td>ストラジオール</td><td>Sigma</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td>イリウム</td><td>NA</td><td>活性成分0.5mg / mLに0.05%で使用してください。.ケージウォーターボトル400本あたり3.5mL、または施設の獣医師の指示に従ってください。</td></tr><tr><td>ミシェルクリップ</td><td>ダニエルズ</td><td>NS-000242</td><td></td></tr><tr><td>多目的シーラント</td><td>ダウ コーニング</td><td>732</td><td></td></tr><tr><td>非外科的胚移植 (NSET) デバイス</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>6mmの鏡が含まれています。1回限りの使用です。</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma</td><td>P0130</td>エ<td>タノールに可溶。【用途】&nbsp;セクション3(ホルモン製剤-皮下注射)および&nbsp;セクション4(ホルモン製剤 - 徐放性ペレット)</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma</td><td>P7556</td>水<td>に可溶。セクション5(ホルモン製剤-浸透圧ミニポンプ)</td></tr><tr><td>リフレッシュアイ軟膏</td>アラ<td>ガン</td><td>NA</td><td>42.5% w / v流動パラフィン、57.3%w / vソフトホワイトパラフィン</td></tr>リ<tr><td>マジルカルプロフェン</td><td>ゾエティス</td><td>NA</td><td>ストック50mg / mL。1 mg / mlで使用(5 mg / kg用量用)</td></tr><tr><td>ゴムチューブ</td><td>ダウコーニング</td><td>508-008</td><td>100%エタノールで洗浄し、1 cmの小片にカットします。内径1.57 mm &plusmn;&nbsp;0.23ミリメートル;外側径3.18mm&plusmn;0.23ミリメートル;壁0.81ミリメートル。</td></tr><tr><td>ごま油</td><td>Sigma</td><td>S3547</td><td></td></tr><tr><td>ソフシルク シルク縫合糸 サイズ3-0</td><td>Covidien</td><td>GS-832</td><td></td></tr></tbody></table>

卵巣摘出マウスモデルにおける妊娠確立への子宮寄与の研究方法

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

妊娠が確立されるためには、生存可能な胚盤胞が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用して、着床と胎盤形成を促進し、継続的な妊娠を可能にする必要があります。胚の欠陥によって引き起こされる妊娠の成功の限界はよく知られており、 体外 受精(IVF)と生殖補助医療技術の台頭により、ここ数十年で大部分が克服されました。しかし、この分野はまだ、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限を克服していないため、体外受精の成功率が停滞しています。卵巣によって産生されるホルモンが子宮内膜の月経周期性に関与しているため、卵巣と子宮内膜の機能は密接に絡み合っています。そのため、妊娠のげっ歯類モデルを使用する場合、観察された結果が卵巣または子宮の欠損によるものであるかどうかを確認するのは難しい場合があります。これを克服するために、妊娠への子宮特異的寄与の研究を可能にするために、胚移植または人工脱落膜化を伴う卵巣摘出マウスモデルが開発されました。この記事では、卵巣摘出術の実施方法について説明し、健康なドナーからの胚移植後の人工脱落膜化または妊娠の成功をサポートするための外因性ホルモンを供給するためのさまざまな技術に関する洞察を提供します。これらの技術には、皮下注射、徐放性ペレット、および浸透圧ミニポンプが含まれます。各方法の主な長所と短所について説明し、研究者が特定の研究課題に最適な研究デザインを選択できるようにします。

人工脱落膜化の十分に特徴付けられたモデルは、このプロトコルペーパーに記載されています(図1A)。ここで、若年成体雌マウス(8週齢)は、セクション1およびセクション2に記載されるように外科的卵巣摘出術を受けた。その後、マウスを2週間休ませて、内因性卵巣ホルモンが消散してから、セクション3〜7およびセクション9に記載されているように外因性ホルモンでサポートされることを確認しました。ゴマ油の膣内注射によって人工的な脱落膜化を誘発し、次いで、セクション9に記載されるように、動物を組織採取まで休ませた。本研究では、一般的に使用されているマウス系統であるC57BL6/Jマウスで人工脱落膜化を行いました。組織採取時に体重を記録し、子宮を解剖し、十分にトリミングしてから体重を測定した(図1B)。脱落反応の程度は、子宮重量を体重の比として表すことによって記録した。この研究では、C57BL6/Jマウスの80%が脱落膜化し(0.01012 ± 0.001515、n = 15)、動物の子宮の20%は...

妊娠の確立は、複雑な胚と子宮のクロストークを含む動的なプロセスです。これらの過程に対する母体の子宮環境の正確な寄与は、依然として活発な研究分野である。ここでは、これらの研究課題に対処するための in vivo 動物モデルの設計を支援するための詳細なプロトコルが提供されています。

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

したがって、妊娠の確立に対する子宮ホルモンと卵巣ホルモンの影響は密接に関連しているため、両方を分離することは困難です。したがって、このプロトコルにより、子宮の寄与を直接調べることができます。卵巣摘出術のようなこれらの技術のいくつかは非常に侵襲的ですが、練習とトレーニングの後に実行するのが比較的簡単であるため、マウスモデルに不慣れな研究者に適しています。したがって、この方法は、卵巣と子宮の両方がこの軸の調節に重要な役割を果たすため、HPG軸のより広い調節を理解するために利用できます。これまでにこれらの技術を実行したことがない場合は、研究所の獣医チームに相談してトレーニングとサポートを受けてください。まず、麻酔をかけたマウスに、脊椎の予感の下のへこみの小さな領域を剃った後、目に軽くたたき、目の潤滑剤をたっぷりと塗布します。0.1ミリリットルのカルプロフェンを首筋に皮下注射します。動物が後ろのつま先をつまんで反射をチェックすることによって麻酔をかけられているかどうかをテストします。次に、ベタジンを手術部位に塗布します。それから外科用ドレープでそれを覆います。ラットの歯の鉗子を使用して、後感で皮膚を上に引き離し、5ミリメートルの縦方向の切開を行います。次に、鈍い鉗子を使用して、皮膚を下の筋肉層から腎臓に向かって片側まで解剖します。筋肉壁を通して腎臓、卵巣、卵巣の脂肪パッドを特定します。鉗子で筋肉層をつかんで持ち上げます。次に、はさみを使用して、0.5〜1センチメートルの長さの切開を行い、鈍い鉗子で卵巣パッドを切開部から引っ張ります。次に、湾曲したニードルホルダーを使用して、卵巣と卵管の下を子宮角の遠位端で固定し、ハサミで卵巣を切除します。30秒後、クランプを取り外し、滅菌ガーゼで軽くたたきます。筋肉壁切開を閉じるには、鉗子を使用して切開の上部を持ち上げます。次に、絹の縫合糸を使用して外科医の結び目で切開を結びます。針を付けずに1ミリリットルの注射器を使用して数滴のブピバカインを局所的に塗布し、滅菌ガーゼで余分なものを軽くたたきます。反対側でも同様に卵巣摘出術を行った後、皮膚の両側を一緒に押し付け、7ミリメートルの手術用クリップを2つ適用して皮膚の切開部を閉じ、創傷の腫れの余地を残します。必要なすべての機器を層流またはクラスIIバイオセーフティフード内のホイルに置き、20分間UV滅菌します。シラスティックチューブを100%デシノールで洗浄し、フード内で風乾させます。乾いたら、メスを使用してチューブを1センチの長さに切ります。次に、プランジャーなしで約200マイクロリットルのシーラントをシリンジに絞ります。プランジャーを交換し、少量のシーラントを押し出します。シーラントをチューブの一方の端に塗布し、手袋をはめた指で滑らかにします。また、シーラントをフード内で一晩またはUV光の下で30分間乾燥させます。次に、プロゲステロン粉末を滅菌したペトリ皿に注ぎます。鉗子の助けを借りてペレットに粉末をすくい取る。ペレットの密封された端をフード表面に軽くたたいて、粉末を凝縮させます。次に、シーラントで開放端をシールします。ペレットが入っているペトリ皿をホイルで包み、光から保護します。皮下挿入の約72時間前に、ペレットを木炭で剥ぎ取ったFCSでインキュベートして活性化します。この手順を実演するのは、ハドソン医学研究所の初期のキャリア研究科学者であるフィオナ・カズンズ博士です。皮下エストラジオール注射で動物をホルモンプライミングした後、人工脱落膜化の2日前に皮下プロゲステロンペレットで動物をプライミングします。手術の前に、マウスに麻酔をかけ、つま先のつまみ反射をチェックして麻酔の深さをテストします。次に、マウスを腹臥位に置き、尾を持ち上げて、6ミリメートルの検鏡を膣にゆっくりと挿入します。利き手でない手の最初の2本の指の間にマウスの下半身を置きます。次に、人差し指を使用して、尾をゆっくりと上に押して、膣へのアクセスを改善します。20マイクロリットルのゴマ油を非外科的胚移植チップに移し、その先端を膣と子宮頸部を通して子宮角に挿入します。ゆっくりと油を排出します。完了したら、膣から検鏡を取り除きます。この研究では、マウスの80%が脱落膜化に成功しましたが、20%は成功しませんでした。したがって、すべての手術器具と作業領域を無菌状態に保ち、子宮頸部からマウスの子宮角にNSAIDデバイスを挿入するときは患者がいることが重要です。人工的な脱落膜化を誘発した後、プロゲステロン口蓋を除去して月経を模倣し、子宮内膜の破壊を研究することができます。この方法を使用すると、卵巣の影響とは無関係に子宮の生物学と調節を研究することができます。これは、一般的に出産と女性の健康の分野で本当にエキサイティングです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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子宮組織の自動移植による外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデル

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子宮収縮は女性の幸福のために重要である。しかし、病理学的に収縮性が増加すると、特に若い女性では月経困難を引き起こす可能性がある。ここでは、月経困難の治療に使用できる平滑筋弛緩剤の有効性を迅速に評価できる簡単なex...

マウス生殖管自発的運動性を評価するためのEx Vivo法とデータ解析のためのMATLABベースの子宮運動追跡アルゴリズム

子宮内膜症の多くのげっ歯類モデルは、技術的な複雑さ、再現性、および/または免疫不全動物または特別なレポーターマウスの必要性によって制限されています。我々は、独立して検証可能な客観的なスコアリングシステムを有し、卵巣切り出しまたは生存手術の要件を持たない任意の実験マウスを使用して、病変誘導の簡略化されたシステムを提示する。...

自然サイクリングマウスを用いた子宮内膜症のシンジニアスマウスモデル

ここでは、子宮内膜脱落膜化の研究分野における古典的な子宮内膜脱落膜化実験である卵巣摘出マウスを用いた人工脱落膜モデルの生成方法について述べる。...

子宮内膜脱落膜化研究のための卵巣摘出術を用いたマウス人工脱落膜モデルの生成

提示された子宮頸部操作方法は、精管切除された雄と雌を繁殖させる必要なしに、マウスにおいて偽妊娠を誘発することができる。偽妊娠の誘導は、非外科的胚移植および非外科的人工授精の成功に必要であり、どちらも提示されている。...

非外科的胚移植または人工授精の前に精管切除された雄を必要とせずに雌マウスに偽妊娠を誘導する

さまざまな性腺外組織および臓器における卵胞刺激ホルモン(FSH)は、複数の疾患の病因と関連しています。卵巣摘出術およびFSH処理マウスモデル(OVF)を使用して、FSHの性腺外作用を調べることができます。...

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

この研究では、臨床的に重要な子宮内膜症のサブタイプである子宮内膜腫をシミュレートするために特別に設計された新しいマウスモデルを紹介します。C57BL/6Jマウスを用いることで、子宮内膜腫関連不妊症の病態生理学的メカニズムを解明し、現在の生殖医療の知見ギャップを埋める精緻なツールを提供することを目指します。...

子宮内膜腫に関連する不妊症を研究するための実験的モデルマウスの確立

この記事では、95%エタノールをマウスの子宮に1〜3分以内に注入することにより、死亡率が非常に低く、子宮内癒着が最小限に抑えられた、信頼性と再現性のある薄い子宮内膜を作製するための詳細なプロトコルについて説明します。...

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

このプロトコルは、マウスモデルで子宮損傷を誘発する手順を説明し、その後の妊娠中に下流の分析を行います。...

外科的子宮損傷とその後の妊娠転帰のマウスモデル

学ぶ 卵巣摘出マウスモデルを用いた子宮の妊娠確立への寄与の研究方法。外科的手技とホルモン補充プロトコルにより、子宮単独の役割を解析し、生殖生物学研究に応用できます。

卵巣摘出マウスモデルにおける妊娠確立への子宮寄与の研究方法

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