Name: マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶマウス卵巣の細胞特異的エピゲノムとトランスクリプトームのペア解析法。TRAPとINTACT法を最適化し、細胞分選なしで老化関連変化を同定。女性不妊治療への応用が期待される。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01AG070035、R01AG069742、T32AG052363)、ブライトフォーカス財団(M2020207)、および長老派健康財団からの助成金によって支援されました。この作業は、米国(US)のMERIT賞I01BX003906および共有機器評価プログラム(ShEEP)賞ISIBX004797によっても部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス。著者らはまた、臨床ゲノミクスセンター(OMRF)とイメージングコアファシリティ(OMRF)の支援と機器の使用に感謝したいと思います。

すべての動物の手順は、オクラホマ医学研究財団(OMRF)の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。親マウスはジャクソン研究所(メイン州バーハーバー)から購入し、OMRFで14時間/ 10時間の明暗サイクル(午前6:00に点灯)でHEPAバリア環境でSPF条件下で飼育および飼育されました。
注:このデモンストレーションでは、Cyp17iCre+/-(株#028547、ジャクソン研究所)のオスとNuTRAPのメス(株#029899、ジャクソン研究所)のペアを使用します。所望のCyp17-NuTRAP子孫(Cyp17iCre+/−;NuTRAPflox/WT)は、卵巣間質細胞においてCyp17a1プロモーターの制御下でNuTRAP対立遺伝子を発現する。この原稿作成には、4ヶ月齢の雌のCyp17-NuTRAPマウス(n=4)を用いた。Cyp17iCreおよびNuTRAP導入遺伝子の遺伝を確認するためのジェノタイピング、および1)ジェネリックCre、2)Cyp17iCre、および3)NuTRAPフロックスのPCR検出のために、マウスイヤーパンチサンプルからDNAを抽出しました。
1.マウス卵巣解離
<ol><li>動物の世話のガイドラインと施設の承認に従ってマウス安楽死を行い、続いて卵巣を採取します。</li>
	<li>卵巣を解剖して、卵巣組織に付着している可能性のある脂肪組織または卵管の一部を取り除き、卵巣をバッファー付きのチューブに入れます。すぐにTRAPまたはインタクトテクニックに進みます。 注:このプロトコルは、凍結組織での使用に最適化されていません。各手法に同じマウスの1つの卵巣を使用することは、将来の統計分析に推奨されます。</li>
</ol>2.特定の卵巣細胞型からの核の分離
<ol><li>バッファー調製<ol><li>核精製バッファー(NPB):100 mLのNPBを調製するには、2 mLの1 M HEPES(最終濃度:20 mM HEPES)、0.8 mLの5 M NaCl(40 mM NaCl)、4.5 mLの2 M KCl(90 mM KCl)、0.4 mLの0.5 M EDTA(2 mM EDTA)、0.1 mLの0.5 M EGTA(0.5 mM EGTA)、 92.2 mLのヌクレアーゼフリー水。核分離当日に1xプロテアーゼ阻害剤を補給します。 注:NPBは、プロテアーゼ阻害剤なしで事前に調製することができ、4°Cで最大3週間持続します。</li>
		<li>核溶解バッファー(完全):核分離当日に1xプロテアーゼ阻害剤を核溶解バッファーに補充します。</li>
	</ol></li>
	<li>核懸濁液の作成 注意: 特に明記されていない限り、サンプルは常に氷上に維持する必要があります。<ol><li>Cyp17-NuTRAPマウス(または他の関連するCre-NuTRAP)から500 μLの核溶解バッファー(完全)で1つの卵巣を採取します。自己開放マイクロハサミを使用して、バッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。</li>
		<li>ワイドボアピペットチップを使用して、ミンチ卵巣と500 μLの溶解バッファーを氷上のガラス製Dounceホモジナイザーに移します。緩い乳棒Aで卵巣を10x-20xホモジナイズし、400 μLの溶解バッファーをDounceホモジナイザーに加え、乳棒Aを洗浄します。</li>
		<li>タイトな乳棒B 10x-20xで卵巣を均質化します。1,000 μLの溶解バッファーを加え、乳棒Bを洗浄し、ホモジネート(1.9 mL)を2 mLの丸底チューブに移します。</li>
		<li>200 x g で4°Cで1.5分間遠心分離し、解離していない組織と血管を除去します14。上清には核が含まれています。解離していない組織のペレットを捨てる。</li>
		<li>30 μmのセルストレーナーを100 μLの溶解バッファーで事前に濡らした後、上清をセルストレーナーを通して15 mLのコニカルチューブにろ過します。次に、核含有混合物を2mLの丸底チューブに移します。</li>
		<li>サンプルを500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットは核を含む。</li>
		<li>核ペレットを250 μLの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、中速から高速で短時間ボルテックスします。1.5 mLの溶解バッファーを加えて、容量を1.75 mLまで上げます。穏やかに混合し、核懸濁液を氷上で5分間休ませます。</li>
		<li>500 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、核をペレット化します。 核ペレットを乱すことなく上清を慎重に廃棄する。ペレットを200 μLの氷冷保存バッファーに再懸濁し、短時間ボルテックスして核ペレットを完全に再懸濁します。</li>
		<li>再懸濁したペレット(20 μL)の10%を下流分析用の投入核サンプルとして確保します。</li>
		<li>再懸濁した核ペレットを取り、氷冷したNPBで容量を2.0 mLに補います。INTACTアフィニティベースの精製法を使用して標識核を分離します。</li>
	</ol></li>
	<li>特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)<ol><li>バイアル中のストレプトアビジンビーズを中速で30秒間ボルテックスし、完全に再懸濁されていることを確認します。各サンプルの再懸濁ビーズ30 μLを2 mLの丸底チューブ(1本のチューブで最大10サンプルのビーズを洗浄可能)に加え、1 mLのNPBを加え、ピペッティングでよく再懸濁します。</li>
		<li>チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズを分離します。上清を廃棄し、チューブを磁石から取り外します。洗浄した磁気ビーズを1 mLのNPBに再懸濁します。</li>
		<li>洗浄手順を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、ビーズをNPBの初期容量(サンプルあたり30 μL)に再懸濁します。</li>
		<li>洗浄したビーズ30 μLをステップ2.2.10の2 mL核懸濁液に加えます。ビーズと核の混合物をピペッティングし、チューブを静かに反転させて、十分に再懸濁します。</li>
		<li>チューブを冷蔵室または冷蔵庫の回転ミキサーに低速で30分間置きます。同じ条件でビーズなしで入力サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>核懸濁液とビーズを入れたチューブを磁石の上に置き、ストレプトアビジンビーズ(正画分)に結合したビオチン化核を核の負分画から分離します。ビーズを磁石上で3分間分離させます。</li>
		<li>上清を取り除き、陰性画分を新しい2.0 mLチューブに渡し、氷上で保存します。ポジティブフラクションチューブごとに、チューブを磁石から取り外し、内容物を1 mLのNPBに再懸濁します。</li>
		<li>チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。チューブを磁石から取り外し、洗浄したビーズと核の混合物を1 mLのNPBに再懸濁します。</li>
		<li>手順2.3.8を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。3回の洗浄が完了したら、陽性画分のビーズ-核混合物を30 μLのNPBに再懸濁します。</li>
		<li>各負分画チューブについて、ステップ2.3.7の核懸濁液を500 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を注意深く吸引して廃棄します。ネガティブフラクション核ペレットを30 μLのNPBに再懸濁します。</li>
		<li>インプットからの核(ステップ2.2.9)、負の画分(ステップ2.3.10)、および正の分画(ステップ2.3.9)を、核DNAまたはRNAを単離する準備ができるまで-80°Cの冷凍庫に保存します。 注:インプットとして無傷の核を必要とするプロトコル(すなわち、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン、クロマチン免疫沈降のアッセイ)のために核を凍結しないでください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 特定の卵巣細胞型からのmRNAの単離
<ol><li>バッファーの準備<ol><li>TRAPバッファーベース:78.8 mLのRNaseフリー水、5 mLの1 M Tris-HCl(最終濃度:50 mM Tris [pH 7.5])、5 mLの2 M KCl(100 mM KCl)、1.2 mLの1 M MgCl 2(12 mM MgCl2)、および10 mLの10%NP-40(1%NP-40)を組み合わせて、100 mLのTRAPバッファーベースを調製します。4°Cで最長1ヶ月間保管してください。</li>
		<li>高塩緩衝塩基:68.8 mLのRNaseフリー水、5 mLの1 M Tris-HCl(最終濃度:50 mM Tris [pH 7.5])、15 mLの2 M KCl(300 mM KCl)、1.2 mLの1M MgCl 2(12 mM MgCl2)、および10 mLの10%NP-40(1%NP-40)を組み合わせて、100 mLの高塩緩衝塩基を調製します。4°Cで最長1ヶ月間保管してください。</li>
		<li>TRAPホモジナイゼーションバッファー(完全):組織採取日にサンプルあたり1.5 mLを調製します。10 mLのTRAPバッファーベース(ステップ3.1.1から)と10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mLシクロヘキシミド)、10 mgのヘパリンナトリウム(1 mg/mLヘパリンナトリウム)、20 μLの0.5 M DTT(1 mM DTT)、50 μLの40 U/μL RNase阻害剤(200 U/mL RNase阻害剤)を組み合わせて、10 mLのTRAPホモジナイゼーションバッファーを調製します。 200 μLの0.1 Mスペルミジン(2 mMスペルミジン)、および1つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤(1x)。</li>
		<li>低塩分洗浄バッファー(完全):組織採取当日にサンプルあたり1.5mLを作ります。10 mLの低塩洗浄バッファーを作るには、10 mLのTRAPバッファーベース(ステップ3.1.1から)を10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミド(100 μg/mLシクロヘキシミド)および20 μLの0.5 M DTT(1 mM DTT)と組み合わせます。</li>
		<li>高塩分洗浄バッファー(完全):TRAP分離の2日目にサンプルあたり1.5 mLを作ります。10 mLの高塩洗浄バッファーを作るには、10 mLの高塩バッファーベース(ステップ3.1.2から)を10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミドおよび20 μLの0.5 M DTTと組み合わせます。</li>
	</ol></li>
	<li>翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)の実行<ol><li>Cyp17-NuTRAPマウス(または他の関連するCre-NuTRAP)から他の卵巣を採取し、100 μLの氷冷TRAPホモジナイゼーションバッファーを含む1.5 mL RNaseフリーチューブに入れます(ステップ3.1.3から)。自己開放マイクロハサミを使用して、バッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。</li>
		<li>ワイドボアチップを使用して、卵巣と100 μLのホモジナイズバッファーをガラス製Dounceホモジナイザーに移します。緩い乳棒Aで10x-20xホモジナイズし、400 μLのTRAPホモジナイズバッファーを加え、乳棒Aを洗浄します。</li>
		<li>ホモジネートを2 mLの丸底チューブに移します。追加の1 mLのTRAPホモジナイゼーションバッファーでDounceホモジナイザーを洗浄し、洗浄したボリュームを2 mLの丸底チューブに移します。</li>
		<li>ホモジネートを12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 透明の上清を新しい2 mLの丸底チューブに移します。ペレットを廃棄します。</li>
		<li>透明にしたホモジネート100 μLを新しい2 mLの丸底チューブに移し、氷上でインプットとして保存します。</li>
		<li>透明化したホモジネートの残り(ステップ3.2.4から)を抗GFP抗体(5 μg/mL)とともに、エンドオーバーエンドで回転させながら4°Cで1時間インキュベートします。同じ条件で入力サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>インキュベーションの最後の15分間で、次のステップ(3.2.8-3.2.11)を使用して、低塩洗浄バッファーでプロテインG磁気ビーズを洗浄します。</li>
		<li>プロテインG磁気ビーズのバイアルを30秒間ボルテックスし、完全に再懸濁します。各サンプルのプロテインG磁気ビーズ50 μL(1本のチューブで最大10サンプルを洗浄可能)を2 mLの丸底チューブに移します。</li>
		<li>500 μLの減塩洗浄バッファーをビーズに加え、ピペットで軽く混ぜます。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面に対してビーズを収集します。上清を取り除いて廃棄する。</li>
		<li>チューブを磁気スタンドから取り外し、1 mLの減塩洗浄バッファーをチューブに追加します。ピペットでやさしく混ぜます。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面に対してビーズを収集します。上清を取り除いて廃棄する。</li>
		<li>手順3.2.10を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、チューブを磁気ラックから取り出し、ビーズを低塩洗浄バッファーの初期容量(サンプルあたり50 μL)に再懸濁します。</li>
		<li>再懸濁した洗浄ビーズ(50 μL)を抗原サンプル/抗体混合物に移し、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら4°Cで一晩インキュベートします。入力サンプルを4°Cで一晩回転させてインキュベートし、同等の条件を維持します。</li>
		<li>一晩インキュベーションした後、ローテーターからチューブを取り外し、磁気スタンドを使用して上清(陰性画分)からターゲットリボソーム/ RNA(陽性画分)を含む磁気ビーズを2.5〜3分間分離します。陰性画分を吸引し、新しい2 mLの丸底チューブに入れ、陽性画分を処理しながら氷上に置きます。</li>
		<li>500 μLの高塩分洗浄バッファー(ステップ3.1.5から)をポジティブ画分を含むチューブに加え、穏やかにピペットで混合します。氷上に1分間維持された磁気スタンドにチューブを置き、ビーズを分離します。上清を廃棄し、チューブを磁石から取り外します。</li>
		<li>手順3.2.14を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、3.5 μLの2-メルカプトエタノール(BME)を添加した350 μLのRNA溶解バッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温でインキュベートし、デジタルシェーカーで900rpmで10分間混合します。</li>
		<li>ターゲットリボソーム/RNAを含む溶液からビーズを磁気スタンドで室温で1分間分離します。溶出した陽性画分(上清)を新鮮な1.5 mLチューブに集め、350 μLの100%エタノールを加えます。反転して混ぜます。RNA単離に進みます。</li>
		<li>オプション:インプットサンプル(ステップ3.2.5)およびネガティブフラクション(ステップ3.2.13)からRNAを単離するには、100 μLの入力フラクションとネガティブフラクションを新しい1.5 mLチューブに移します。3.5 μLのBMEを添加した350 μLのRNA溶解バッファーを各サンプルに加えます。反転して混ぜます。各チューブに250 μLの100%エタノールを加え、反転させて混合します。RNA単離に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA単離<ol><li>700 μLのポジティブフラクション、およびオプションでインプットフラクションおよび/またはネガティブフラクションをRNAスピンカラムに移します。製造元の指示に従って、スピンカラムからRNAを分離します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は利益相反を宣言しません。

NuTRAPマウスモデル6は、利用可能なCreドライバーを使用して任意の細胞タイプに適応できる、特定の細胞タイプからのトランスクリプトームとエピゲノムのペアインベリングのための強力なトランスジェニック標識アプローチです。ここでは、卵巣細胞と間質細胞を標的とするCyp17-NuTRAPマウスモデルの特異性を示します。Cyp17-NuTRAPモデルは、卵巣の老化、癌、および疾患に関与するthecaおよび間質細胞特異的エピジェネティックメカニズムをさらに解明するために使用できます。
Creドライバーを選択する際には、いくつかの直交アプローチを使用して、Creを介したNuTRAP発現の細胞特異性を検証することをお勧めします。Cyp17a1-Creは構成的に表現されています。NuTRAPモデルは、発生中の非標的細胞における遺伝子の一過性の発現を回避するために、誘導性Cre株と交配することもできます。ほとんどの卵巣細胞はホルモンの変動に非常に敏感であるため、発情周期の病期分類も考慮する必要があります17</su...

卵巣は体細胞老化の主要なプレーヤーであり1、特定の細胞集団からの明確な寄与があります。卵巣の細胞不均一性は、バルク、全卵巣アッセイからの分子結果を解釈することを困難にします。卵巣の老化における特定の細胞集団の役割を理解することは、高齢女性の生殖能力と健康低下の原因となる分子ドライバーを特定するための鍵です。従来、特定の卵巣細胞タイプのマルチオミクス評価は、レーザーマイクロダイセクション2、シングルセルアプローチ3、またはセルソーティング4などの技術によって達成されていました。しかし、マイクロダイセクションは費用がかかり、実行が困難な場合があり、細胞の選別は細胞の表現型プロファイルを変化させる可能性があります5。
卵巣細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを評価するための新しいアプローチは、核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)マウスモデルを使用します。NuTRAPモデルでは、アフィニティー精製法(翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)および特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)6)を使用することで、細胞ソーティングを必要とせずに細胞種特異的核酸を単離できます。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。NuTRAPマウスを細胞型特異的Creラインと交差させることにより、STOPカセットを除去すると、リボソーム複合体のeGFPタグ付けと核のビオチン/mCherryタグ付けがCre依存的に行われます6。次に、TRAPおよびINTACT技術を使用して、目的の細胞型からmRNAおよび核DNAを分離し、トランスクリプトームおよびエピゲノム解析に進むことができます。
NuTRAPモデルは、脂肪組織6、脳組織7、8、9、網膜10などのさまざまな組織で使用されており、全組織ホモジネートでは検出されない可能性のある細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を明らかにしています。従来の細胞選別技術に対するNuTRAPアプローチの利点には、1)生体外活性化アーティファクトの防止8、2)特殊な機器(すなわち、細胞選別機)の必要性の最小化、および3)細胞タイプ特異的分析のスループットの向上とコストの削減が含まれます。さらに、1匹のマウスから細胞種特異的なDNAとRNAを単離できるため、統計的検出力を高めるペア分析が可能になります。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型11,12,13の駆動に関与していることが示されているため、Cyp17a1-Creドライバーを使用してNuTRAP発現系を間質細胞とテカ細胞に標的化しました。ここでは、NuTRAP構築物の誘導が卵巣間質細胞とテカ細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAとRNAが単一の卵巣から得られることを実証します。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つあらゆる卵巣細胞タイプの研究に使用できます。
細胞型特異的卵巣NuTRAPマウス株の作製のために、核タグおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)対立遺伝子は、BirA、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付きmCherry/mRANGAP1、およびeGFP/L10aの発現を制御するフロックスSTOPコドンを有する。細胞型特異的Creラインと交差させると、NuTRAPカセットの発現は核タンパク質mRANGAP1をビオチン/mCherryで標識し、リボソームタンパク質L10aをeGFPでCre依存的に標識します。これにより、細胞選別を必要とせずに、特定の細胞タイプから核およびmRNAを単離することができます。NuTRAPフロックス/フロックス は、卵巣細胞タイプに関連する細胞タイプ特異的Creと組み合わせて、これを評価することができます。

<table><tbody><tr><td>0.1 M スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05292-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>100 mg/mL シクロヘキシミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>30&マイクロ;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td></td><td>Abcam Ab290</td><td>TRAP および IHC 用 (ウサギ ポリクローナルから GFP)</td></tr><tr><td>バッファー RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA Lysis Buffer in protocol</td></tr><tr><td>cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>11836170001</td> For <td>TRAP HomogenizationBuffer</td></tr><tr><td>Cyp17iCreマウスモデル</td><td>:ジャクソン研究所</td><td>、28547</td>、<td>B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako / J</td></tr><tr><td>DynaMag-2磁石</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ジェノタイピングプライマーIDT</td><td></td><td>カスタム</td><td>ジェネリックCre-ジャクソン研究所プロトコル22392、プライマー:oIMR1084、oIMR1085、oIMR7338、oIMR7339</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>Cyp17iCre - ジャクソン研究所のプロトコル30847、プライマー:21218、31704、31705、35663</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor カクテル (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861278</td><td>For NPB Buffer</td></tr><tr><td>M-280 Streptavidin Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>2.8 &micro;m ビーズ径</td></tr><tr><td>MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>核分離キット: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nuc101</td><td>には核溶解バッファーと核貯蔵バッファーが含まれています</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>NuTRAP マウスモデル</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>29899</td><td>B6;129S6-GT(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J</td></tr><tr><td>Pierce DTT No-Weigh Format</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>10004D</td><td>For TRAP</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>超高純度 1M Tris-HCl, pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>VWRチューブローテーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9854190</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を評価することは、卵巣の老化を理解するための鍵です。この目的のために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法の最適化と特定の細胞型でタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、新しいトランスジェニックNuTRAPマウスモデルを使用した細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのその後のペアインテロゲーションのために行われました。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型の駆動に関与していることが示されているため、NuTRAP発現システムは、Cyp17a1-Creドライバーを使用して間質細胞を標的としました。NuTRAP構築物の誘導は卵巣間質線維芽細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAおよびRNAが単一の卵巣から得られた。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つ任意の卵巣細胞タイプの研究に使用できます。

TRAPプロトコルとINTACTプロトコルの回路図を図1に示します。ここでは、卵巣間質/テカ細胞に対するCyp17-NuTRAPマウスモデルの特異性は、免疫蛍光イメージングおよびTRAP単離されたRNAからのRNA-Seqによって実証されています。まず、卵巣におけるeGFPシグナルの免疫蛍光イメージングと、theca細胞および間質細胞へのeGFPシグナルの局在化を行った。簡単に説明すると、5μm切片をキシレンおよびエタノール勾配で脱パラフィンした。より良いeGFPシグナル伝達のために、eGFPタンパク質をヤギ抗GFP一次抗体およびAlexa 488ロバ抗ヤギ二次抗体を用いて染色し、核をDAPI15で染色した。画像は20倍の倍率で蛍光顕微鏡で撮影した(図2A)。次に、生後4ヶ月のCyp17-NuTRAPマウスの卵巣でTRAPを行い、リボソーム結合RNAをテカ/ストローマ細胞から特異的に単離しました。TRAP単離RNA(陽性画分)および全組織RNA(インプット)を使用して、次...

このプロトコルでは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法と特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、Cyp17a1-Creマウス系統に交配されたNuTRAPマウスモデルを使用して、細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのペアインプロゲーション用に最適化されました。

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the ...

この方法は、細胞ソーティングを必要とせずに、同じマウスの特定の卵巣細胞集団から核酸を単離する技術を提供します。この手法は、特定の細胞集団がさまざまな条件下でどのように変化しているかを特定するのに役立ちます。たとえば、加齢とともに。この技術の主な利点は、細胞選別を必要とせずに、特定の卵巣細胞型からのエピゲノム解析とトランスクリプトーム解析のペアを可能にすることです。これにより、スループットが大幅に向上し、コストが削減され、卵巣組織から細胞種特異的分析を実行する際に特殊な機器が不要になります。ここでの目標は、生殖老化前の卵巣老化に伴って起こる細胞型特異的変化を特定することであり、これは女性の不妊症の治療に影響を及ぼします。この方法は、細胞型固有のCreドライバーが利用可能な身体システム全体の任意の細胞型に適用できます。この手法の最も難しい部分は、目的の細胞タイプに適したCreラインを選択することです。細胞特異性の広範な検証が推奨されます。まず、安楽死させたマウスから500マイクロリットルの核溶解バッファーで卵巣を1つ採取し、自己開口マイクロハサミを使用してバッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。ミンチ卵巣と溶解バッファーを氷上のガラスダウンスホモジナイザーに移し、緩い乳棒で卵巣を10〜20回ホモジナイズしますA.400マイクロリットルの溶解バッファーをダウンスホモジナイザー洗浄乳棒Aに追加し、次に卵巣をタイトな乳棒Bで10〜20回ホモジナイズします。ホモジネートを2ミリリットルの丸底チューブに移し、200gで摂氏4度で1.5分間遠心分離して、解離していない組織と血管を取り除きます。30マイクロメートルのセルストレーナーを100マイクロリットルの溶解バッファーで事前に濡らした後、上清をストレーナーを通して15ミリリットルのコニカルチューブにろ過します。核含有混合物を2ミリリットルの丸底管に移す。サンプルを摂氏4度で5分間500gで遠心分離し、上清を廃棄します。核ペレットを250マイクロリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、中程度から高速で短時間ボルテックスします。1.5ミリリットルの溶解バッファーを加えて、容量を1.75ミリリットルまで上げます。穏やかに混合し、核懸濁液を氷上に5分間置く。500 gで4°Cで5分間遠心分離して核をペレット化します。そして核ペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ペレットを200マイクロリットルの氷冷貯蔵バッファーに再懸濁し、短時間ボルテックスして核ペレットを完全に再懸濁します。再懸濁したペレットの10%を下流分析用の入力核サンプルとして予約します。再懸濁した核パレットを取り、氷冷核浄化バッファー(NPB)で容量を2ミリリットルに補います。各サンプルに対して30マイクロリットルの再懸濁ビーズを2ミリリットルの丸底チューブに加えます。その後、1ミリリットルのNPBを加え、ピペッティングでよく再懸濁します。チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズを分離します。上澄み液を廃棄し、磁石からチューブを取り外します。洗浄した磁気ビーズを1ミリリットルのNPBに再懸濁します。洗浄手順を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。そして最後の洗浄の後、NPBの初期容量でビーズを再懸濁します。30マイクロリットルの洗浄ビーズを2ミリリットルの核懸濁液に加え、チューブをピペッティングして穏やかに反転させることにより、ビーズ核混合物をよく再懸濁します。チューブを冷蔵室または冷蔵庫の回転ミキサーに低速で30分間置き、同じ条件でビーズなしでインキュベートします。核懸濁液とビーズを入れたチューブを磁石の上に3分間置き、ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化核を核の負の部分から分離します。上清を取り除きます。負の割合を新しい2ミリリットルのチューブに渡し、氷の上に保存します。正のフラクションチューブごとに、チューブを磁石から取り外し、内容物を1ミリリットルのNPBに再懸濁します。チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。ポジティブフラクションビーズ核混合物を30マイクロリットルのNPBに再懸濁します。卵巣と100マイクロリットルのホモジナイザーをガラスダウンスホモジナイザーに移し、緩い乳棒Aで10〜20回ホモジナイズします.400マイクロリットルのTRAPホモジナイズバッファーを洗浄乳棒Aに追加し、ホモジネートを2ミリリットルの丸底チューブに移します。追加の1ミリリットルのTRAPホモジナイゼーションバッファーでホモジナイザーを洗浄し、洗浄した量を2ミリリットルの丸底チューブに移します。ホモジネートを12, 000 gで摂氏4度で10分間遠心分離します。そして、透明にした上清を新鮮な2ミリリットルの丸底チューブに移します。ペレットを廃棄した後、100マイクロリットルの透明なホモジネートを新しい2ミリリットルの丸い底のチューブに移し、氷上の入力として保存します。透明化した残りのホモジネートを、1ミリリットルあたり5マイクログラムの抗GFP抗体とともに、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら摂氏4度で1時間インキュベートします。同じ条件でインプットサンプルをインキュベートします。各サンプルの50マイクロリットルのプロテインG磁気ビーズを2ミリリットルの丸底チューブに移します。500マイクロリットルの減塩洗浄バッファーをビーズに加え、ピペットで穏やかに混合します。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面にビーズを集めます。上清を廃棄した後、チューブを磁気スタンドから取り外し、1ミリリットルの減塩洗浄バッファーをチューブに追加します。ピペットでやさしく混ぜます。もう一度、チューブを磁気スタンドに入れ、合計3回の洗浄で手順を繰り返します。最終洗浄後、ビーズを低塩洗浄バッファーの初期容量に再懸濁します。再懸濁した洗浄ビーズを抗原サンプル抗体混合物に移し、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら摂氏4度で一晩インキュベートします。入力サンプルを同等の条件で一晩インキュベートします。その後、磁気スタンドを用いて2.5〜3分間、陰性画分または上清から標的リボソームRNAを有する陽性画分または磁気ビーズを分離する。負の分数を吸引します。それを新鮮な2ミリリットルの丸い底のチューブに入れ、氷の上に置いておきます。500マイクロリットルの高塩分洗浄バッファーをポジティブ画分とともにチューブに加え、穏やかにピペットで混合します。氷上に維持された磁気スタンドにチューブを1分間置き、ビーズを分離します。上清を廃棄した後、チューブを磁石から取り外し、合計3回の洗浄のために手順を繰り返します。最終洗浄後、3.5マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを添加した350マイクロリットルのRNA溶解バッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温でインキュベートし、デジタルシェーカーで900 RPMで10分間混合します。標的リボソームRNAを含む溶液からビーズを磁気スタンドで室温で1分間分離します。溶出した陽性画分を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに集めます。免疫蛍光イメージングは、Cyp17-Cre陽性NuTRAPフロックスおよびCyp17-Cre陰性NuTRAPフロックスマウスのパラフィン化卵巣に対して実施した。EGFPタンパク質は、ヤギ抗GFP一次抗体およびAlexa 488ロバ抗ヤギ二次抗体を用いて染色し、核をDAPIで染色した。画像は蛍光顕微鏡で20倍の倍率で撮影されました。インプットおよびTRAP陽性画分RNAをCyp17-Cre陽性NuTRAPフロックスマウス卵巣から単離し、対末端様式で配列決定した。発現した全ての遺伝子の主成分分析は、第1成分におけるTRAPインプットと陽性画分の分離を示した。入力分数と正分数の間で発現差のある遺伝子の火山プロットがここに示されています。TRAP陽性画分と入力値の比較は、間質/テカ細胞マーカー遺伝子の全体的な濃縮と、TRAP陽性画分における卵母細胞、顆粒膜、免疫、および平滑筋細胞マーカー遺伝子の枯渇を示しました。解離していない血管を除去するための核懸濁液の最初の遠心分離の後、核は上清中にある。この時点で、上清を必ず保持し、ペレットを廃棄してください。インタクトな方法に続いて、クロマチンアクセシビリティやDNA修飾のアッセイなど、いくつかのエピゲノム技術を実施できます。TRAP法に続いて、RT-qCPRまたはRNAシーケンシングを実施してトランスラトームを評価することができます。これは、マウス卵巣におけるNuTRAP法の最初の適用です。これにより、特定の卵巣細胞タイプからのハイスループットエピゲノムおよびトランスクリプトーム解析が可能になり、卵巣の老化や癌の研究に使用できます。

cell-specific-paired-interrogation-mouse-ovarian-epigenome

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

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シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。...

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ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。...

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。...

マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。...

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶマウス卵巣の細胞特異的エピゲノムとトランスクリプトームのペア解析法。TRAPとINTACT法を最適化し、細胞分選なしで老化関連変化を同定。女性不妊治療への応用が期待される。

マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション

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