インテリジェントハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの適用と薬剤耐性指数

このプロトコルは、EST検出とファージ図の両方について、マルチレベル法を提示します。また、さまざまな制御技術のEMRレベルを比較するために、保存用の大きなインデックスも導入されました。この費用対効果の高い手法は、インテリジェントで、ハイスループットで、多機能です。

これにより、 20 、 000 の流行遺伝子と分析ファージを収集した獣医モニタリングネットワークである VAMS の確立が可能になりました。この方法は、医療、農業、動物の心臓バッテリー、および漁業における病原菌のモニタリングと制御にも使用できます。このプロトコルとこの会社の論文は、提供する必要があります。

技術トレーニングガイド付き。それに従うことで、誰でも短期間でテクニックを習得することができます。まず、品質管理生物である大腸菌と93種類の試験サルモネラ菌株をMueller-Hinton寒天プレート上でインキュベートします。

次に、調製した各菌株の接種菌を10倍に希釈する。ネガティブコントロールとして、200マイクロリットルの滅菌生理食塩水を96ウェルプレートのa-1ウェルに移します。次に、大腸菌の2つの懸濁液をa-2およびa-3ウェルにそれぞれポジティブコントロールおよび品質管理としてピペットで移します。

残りの93ウェルに、200マイクロリットルの希釈試験株を加えます。抗菌寒天プレートの調製用。まず、LAR指数に従って、試験するさまざまな抗菌剤の濃度範囲を設定します。

CLSI標準寒天希釈法に従って、抗生物質溶液の対数2倍増希釈スキームを実行します。次に、18ミリリットルの溶融ミューラーヒントン寒天培地を含む滅菌ガラス瓶に2ミリリットルの抗菌溶液を加えます。完全に混合した後、バイオ安全キャビネット内のプレートに注ぎます。

寒天を室温で固化させます。寒天の表面を乾燥させるために、プレートの蓋の下に必ず隙間を残してください。インキュベートプレートの下側に抗菌剤の種類とそれぞれの濃度をラベル付けします。

各抗菌剤の複数のインキュベートプレートを、log 2倍希釈順に並べたスタックに配置します。最後に、各薬剤のコントロールとして機能する2枚の薬剤フリー寒天プレートを調製します。滅菌した接種ピンプレートを、バイオセーフティキャビネット内の96ドットマトリックス接種器の支持体に取り付けます。

次に、調製したシードブロックを試験株と寒天培養プレートとともにモバイルキャリア上に配置します。シードブロックが接種ピンプレートの下に来るまで、携帯電話キャリアを押します。次に、操作ハンドルを押して接種ピンプレートを下げ、96ピンをシードブロックの96ウェルの接種物に導きます。

制御された方法で操作ハンドルを放し、接種ピンプレートを自動的にリセットして、各接種物をよく攪拌し、操作ハンドルを2〜3回押します。その後、インキュベーションプレートが接種ピンプレートの下に来るようにキャリアプレートをずらして配置します。操作ハンドルを押し下げ、接種ピンプレートを下げて1〜2秒間放置し、インキュベートプレートの表面に完全に接触するようにします。

操作ハンドルを離すと、1回の接種が完了します。インキュベートしたプレートを交換し、抗菌寒天プレートのバッチが完了するまでプロセスを繰り返します。新しい接種ピンプレートとシードブロックに切り替えて、テストされた株の別のグループに接種します。

接種した抗菌寒天プレートを室温で、接種斑からの水分が寒天に完全に吸収されるまでインキュベートします。インキュベーション後、プレートを反転させてインキュベーションを続け、抑制されていないバクテリアがコロニーを形成するようにします。画像取得とデータ統計を実行するには、まず96ドットマトリックスAST画像取得システムをクリックしてプログラムを起動します。

タスク バーから [テスト情報] を選択します。[新規] をクリックして新しいテスト タスクを作成し、必要な詳細を入力します。次に、データ収集を押してから写真とテスト項目を押して、新しく作成したタスクを選択します。

抗生物質名を選択するには抗生物質を選択し、抗生物質の初期濃度を選択するにはグラジエントを選択します。最後に、[接続]をクリックして、画像取得コンバーターとの接続を確立します。次に、インキュベートしたプレートを検出プレートベースに置き、画像取得コンバーターに挿入します。

コレクションをクリックして、プレートの画像をキャプチャします。抗生物質を押して、次のプレートのセットを選択します。グラデーションを選択して開始グラデーションを特定し、画像コレクションの次のラウンドに進みます。

送信をクリックして手順を確定し、コロニー形成を決定し、画像を最小発育阻害濃度、つまりMIC値に変換します。クエリをクリックすると、すべての MIC 結果にアクセスできます。まず、二重層寒天法を利用して、さまざまなファージを産生します。

ファージを適切な平行濃度に希釈し、200マイクロリットルのファージ接種液を96ウェルシードブロックに加えます。次に、検査する菌株ごとに2層のインキュベートプレートを用意します。2層プレートの蓋の下に隙間を空けて乾燥させます。

調製したファージシードブロックと二層プレートを96ドットマトリックス接種器のモバイルキャリア上に置きます。すべてのファージを半寒天表面に無眼で移します。.すべての眼球水分が半寒天に吸収されるまで、プレートを室温のままにします。

次に、プレートを摂氏37度で4〜6時間インキュベートします。画像取得コンバータを使用して、各二重層プレートの実験結果の画像を取得して保存します。得られた画像に基づいて、さまざまなスポット形状の数と形態をスプレッドシートに記録し、さまざまな種類のファージのそれぞれの比率を計算します。

アンピシリンを含むプレート上でのサルモネラ菌の増殖の形態学的研究は、a-1のネガティブコントロールが増殖を示さないことを示しました。a-4のサルモネラ菌株のMICは64マイクログラム/ミリリットルであったのに対し、a-5のMICは16マイクログラム/ミリリットルであった。アンピシリン、シプロフロキサシン、およびアモキシシリン-クラブラン酸のパーセンテージ耐性値は50%以上でしたドキシサイクリン、フロルフェニコール、セフォタキシム、エンロフロキサシンの耐性値は30%から50%でしたゲンタマイシン、アミカシン、メロペネムは30%未満の耐性値を示しましたシプロフロキサシンとアモキシシリン-クラブラン酸のLAR指数は大幅に延期されました。

二層板上でのサルモネラ菌増殖の形態学的解析により、ファージの4つの主要なスポット形態が観察されたことが示された。丸く透明な溶解斑は、プレート上の宿主を確実に殺すことができるファージからのものでしたが、その宿主を犠牲にして複製に成功する場合とできない場合があります。プラークのコレクションは、真のプラークによって形成されました。

濁った溶解斑は、プレート上の宿主を確実に殺さなかったファージに起因し、その宿主を犠牲にして複製に成功する場合とできない場合があります。溶解性のない斑点は、非溶解性を示しました。この技術は、96寒天レンズを一度に簡単に効率的に転送し、機器が自動的に画像を認識し、ラインダイスを計算します。

この技術は、ファージの研究と産業化を促進することが期待されており、ファージの応用は、AMRの問題を軽減および解決するための驚くべき方法の1つです。