Name: 脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぼう、脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成法。物理・化学処理と酵素消化を組み合わせ、低免疫原性と生物活性を保持した細胞足場を作製する手法です。

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この研究は、浙江省の医療および健康技術計画(2019KY050)、浙江省の伝統的な漢方科学技術計画(2019ZA026)、浙江省の重点研究開発計画(助成金番号2020C03043)、浙江省の伝統漢方薬科学技術計画(2021ZQ021)、および中国浙江省自然科学基金会(LQ22H060007)によって後援されました。

この研究は、浙江省の通徳病院の倫理委員会によって承認されました。
1. DC-ECMハイドロゲルの調製
注:この研究では、軟骨は生後12か月のバマミニチュアブタの膝関節から採取され、骨組織の収集を回避しました。
<ol><li>採取した軟骨をメスでブロックし、1〜2mmの3 個に切り刻みます。</li>
	<li>みじん切りにした軟骨20gを50mLの遠心チューブに入れ、20mLの低張性Tris-HCl緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)を加えて組織を完全に沈めます。遠心チューブを-80°Cの冷凍庫に3時間入れ、次に37°Cのオーブンに3時間入れます。凍結と加熱のステップを6回繰り返します。このステップでは、低張Tris-HClバッファーを交換する必要はありません。</li>
	<li>ボルテックスミキサーを使用して遠心分離管を1,000rpmの速度で30秒間振とうします。ステンレス製のふるい(孔径:~250 μm)を新しい50 mL遠心チューブに置きます。</li>
	<li>脱細胞化した軟骨をステンレス製のふるいにゆっくりとデカントし、滅菌PBSで組織を3回洗浄し、軟骨を採取します。</li>
	<li>10 mLのトリプシン溶液(0.25%トリプシンPBS溶液)を加え、チューブを37°Cのシェーカーに24時間置きます。この期間中、4時間ごとにトリプシンを交換してください。ステンレス鋼のふるいを使用して懸濁液をろ過し、組織を保存します。トリプシンは、消化プロセスの1つで一晩処理することができ、これは最終的な消化に影響を与えません。</li>
	<li>トリプシン処理した組織を高張緩衝液(1.5 M NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.6)で洗浄します。</li>
	<li>10 mL のヌクレアーゼ溶液(50 U/mL のデオキシリボヌクレアーゼと 1 U/mL のリボヌクレアーゼを 10 mM Tris-HCl、pH 7.5 に溶解)を加え、チューブを 37 °C のシェーカーに 4 時間置きます。</li>
	<li>ヌクレアーゼ溶液を除去し、軟骨を滅菌PBSで3回洗浄し、低張性Tris-HCl溶液を加えます。遠心分離管をシェーカーの上に置き、室温(RT)で20時間すすぎます。</li>
	<li>低張性Tris-HCl溶液を除去し、軟骨を滅菌PBSで3回洗浄し、1%Triton X-100溶液を加えて組織を24時間浸します。</li>
	<li>Triton X-100溶液を除去し、脱細胞化軟骨を蒸留水で3日間十分に洗い流し、蒸留水を12時間ごとに交換します。</li>
	<li>軟骨を過酢酸溶液(0.1% PAA in 4% ethanol)に4時間浸します。過酢酸溶液を取り除き、軟骨を滅菌蒸留水で3回洗浄します。</li>
	<li>ステンレス鋼のふるい(孔径:~250μm)を50mLの遠心分離管に置きます。脱細胞化した軟骨をステンレス製のふるいにゆっくりとデカントし、軟骨を採取します。DNA、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)の含有量を推定することにより、軟骨の脱細胞化の程度とマトリックス保持をテストします。</li>
	<li>脱細胞化軟骨を粉砕ボウルに入れ、液体窒素を加え、脱細胞化軟骨を粉砕して粉末状にする。脱細胞化軟骨粉末2gを摂取し、0.5M酢酸80mLとペプシン20mgを加え、24時間消化します。400 x g で10分間遠心分離します。沈殿物を捨て、上澄み液(DC-ECM溶液)を回収する。</li>
	<li>1ウェルあたり1 mLのDC-ECM溶液を6ウェルプレートにデカントします。6ウェルプレートを凍結乾燥機に入れます。DC-ECM ソリューションを凍結します。凍結乾燥機内の温度が-40°Cに下がったら、真空ポンプを投入し、真空度を10Paで22時間維持します。</li>
	<li>凍結乾燥したDC-ECM溶液を取り出し、遠心チューブに入れ、-20°Cで保存します。 凍結乾燥DC-ECM溶液の最低保管期間は半年以上です。</li>
	<li>1 mL の滅菌蒸留水を加えて、20 mg の凍結乾燥 DC-ECM 溶液を遠心分離管に溶解します。ボルテックスミキサーを用いて、室温で1,000rpmの速度で1分間振とうし、DC-ECM溶液にビタミンB2(0.1%w/v)1mgを加え、37°Cで60分間インキュベートし、UV光(370nm、3.5mW/cm2)を3分間照射してハイドロゲル(DC-ECMハイドロゲル)を形成する。</li>
</ol>2. 脱細胞化軟骨の検出
<ol><li>脱細胞化軟骨のDNA含量検出 注:DNEasy Blood & Tissue Kitを使用してDNAを抽出します。<ol><li>まず、遠心チューブに20mgのDC-ECM軟骨を採取します。180 μLのBuffer GTLと20 μLのProteinase Kを渦振動により添加し、軟骨が完全に溶解するまで56°Cで4時間インキュベートします。</li>
		<li>ボルテックスミキサーを使用して遠心分離管を室温で1,000rpmの速度で15秒間振とうします。次に、200μLのBuffer GLと無水エタノールを加え、渦振動により十分に混合する。サンプルを4°Cで6,000 x g の速度で1分間遠心分離します。</li>
		<li>500 μL のバッファー GW1 を吸着カラムに添加し、サンプルを 4 °C で 12,000 x g の速度で 1 分間遠心分離します。 500 μL のバッファー GW2 を吸着カラムに加え、20,000 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。最後に、吸着カラムに滅菌水50μLを加え、4°Cで6,000× g の速度で1分間遠心分離し、DNA溶液を回収します。分光光度計を使用してDNA含有量を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>脱細胞化軟骨におけるコラーゲン含量検出<ol><li>脱細胞化軟骨のコラーゲン含有量を検出するには、コラーゲンアミノ酸マーカーとしてヒドロキシプロリンを使用します。5 mgの脱細胞化軟骨を5 mLの6 M塩酸で100°Cで20分間酸性化した後、5 mLの6 M水酸化ナトリウム溶液で中和します。</li>
		<li>分光光度計で570nmのサンプルの吸光度を測定することにより、ヒドロキシプロリンの含有量を計算します。標準ヒドロキシプロリンサンプルを使用して濃度吸収線形回帰を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>脱細胞化軟骨中のGAG含量検出 注:DC-ECM軟骨中のGAG含有量は、組織GAG比色定量検出キットを使用して検出しました。以下のすべての試薬がキットに含まれています。<ol><li>DC-ECM軟骨粉末200mgを採取し、500μLの試薬Aを渦振動により添加します。サンプルを4°Cで16時間インキュベートした後、14,000 x g で10分間遠心分離します。</li>
		<li>試料溶液50mLを採取し、高塩溶液(試薬B)50μLと酸性溶液(試薬C)50μLを渦振動により加えます。サンプルを10分間インキュベートします。</li>
		<li>750μLの色素溶液(試薬D)を渦振動により添加し、暗所で30分間インキュベートします。サンプルを 14,000 x g で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
		<li>洗浄液(試薬E)1μLを加え、よく混ぜる。サンプルを14,000 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
		<li>解離液(試薬F)1μLを試料に加え、よく混合する。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。最後に、600nmの分光光度計を使用してGAG含有量を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>走査型電子顕微鏡(SEM)および透過型電子顕微鏡(TEM)による脱細胞化軟骨の解析<ol><li>脱細胞化軟骨と正常軟骨組織を比較します。サンプルを2.5%グルタルアルデヒド溶液に入れ、4°Cで一晩インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>サンプルを1%OsO4で1時間固定した後、PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>50%、70%、90%、100%エタノール、および100%アセトンにそれぞれ15分間連続的に浸漬して、サンプルを脱水します。サンプルをヘキサメチルジシラザンとエタノール(1:1)の混合溶液に15分間入れた後、純粋なヘキサメチルジシラザンに15分間浸漬します。</li>
		<li>サンプルをHCP-2乾燥機に入れ、液体窒素を使用して乾燥させます。次に、完全に乾燥した試料をスパッタリングコーティングを使用して金パラジウムの薄層でコーティングし、SEMを使用して画像化します。スパッタコーティングは、120Wの電力で5分間行った。実験は、動作電圧15kV、真空度5×10−5Pa 未満の条件で実施した。</li>
		<li>TEM分析では、サンプルを無水アセトンと樹脂(1:1)の混合物に1時間入れ、続いて無水アセトンと樹脂(1:3)の混合物に3時間入れます。次に、サンプルを樹脂に一晩入れます。<ol><li>サンプルを包埋培地充填カプセルに入れ、70°Cで9時間加熱します。</li>
			<li>包埋後、超微細ミクロトームを用いて試料を70nmの薄切りにし、銅メッシュ上に置きます。</li>
			<li>20 μLの酢酸ウラニル染色液を銅メッシュにピペットで移し、室温で15分間染色します。</li>
			<li>次に、20 μLのクエン酸鉛染色溶液を銅メッシュにピペットで移し、室温で15分間染色します。</li>
			<li>濾紙で裏打ちされた清潔なペトリ皿に銅メッシュを置きます。自然乾燥後、TEMで切片を撮影します。プローブは500 nNの下向きの力で印加され、1 Hzの速度でスキャンされ、弾性定数(k値)は40 Nm-1でした。プローブ先端の半径は8nmと測定した。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルは密接に密接に軟骨のティッシュの自然なECMをまねるdecellularized軟骨の細胞外マトリックスのハイドロゲルの準備に組織的アプローチを提供する。このプロトコルでは、ECMの構造と組成を維持しながら細胞物質を除去するために、物理的、化学的、および酵素的破壊を組み合わせています。プロトコルの重要なステップには、脱細胞化の時間と方法を調整し、完全な脱細胞化を確実にすることが含まれます。
組織工学や再生医療のための他の既存の方法と比較して、このプロトコルにはいくつかの利点があります。DC-ECMハイドロゲルは、優れた生物活性、空間構造、生物学的誘導機能を有し、免疫原性が低く、これらの特性は細胞の接着、増殖、分化、遊走の促進に有益である11。DC-ECMハイドロゲルは、薬物送達や軟骨欠損治療にも使用できる12。
このプロトコルに行うことができる1つの修正は、ヒドロゲルの機械的特性を高めるための異なる架橋剤の使用である。...

軟骨組織工学は、損傷または病変した軟骨組織の再生を目指す急速に発展している分野です1。この分野における重要な課題の1つは、軟骨の産生に関与する細胞である軟骨細胞の成長と分化をサポートできる生体模倣スキャフォールドの開発です2。軟骨組織のECMは、軟骨細胞の挙動を調節する上で重要な役割を果たしています。DC-ECMは、組織工学アプリケーション3の効果的な足場です。
軟骨組織からDC-ECMを製造するために、化学的、酵素的、物理的方法など、多くの技術が開発されています。しかし、これらの方法では、生体模倣が不十分なECMハイドロゲルが生成されることが多く、組織工学用途での使用の可能性が制限されます4,5。したがって、DC-ECMヒドロゲルを製造するためのより効果的な方法が必要である。
この技術の開発は、組織の再生と修復をサポートできる生体模倣スキャフォールドを作成するための新しいアプローチを提供することにより、組織工学の分野を前進させることができるため、重要です。さらに、この技術は、他の組織からECMハイドロゲルを製造するために容易に適応できるため、その潜在的な用途が拡大します。
より広範な文献では、組織工学アプリケーションの足場としてDC-ECMを使用することへの関心が高まっています6。多くの研究により、軟骨を含むさまざまな組織における細胞の成長と分化を促進するDC-ECMハイドロゲルの有効性が実証されています7,8。したがって、軟骨組織の天然ECMを厳密に模倣したDC-ECMハイドロゲルを製造するためのプロトコルの開発は、この分野への重要な貢献です。
この論文で紹介するプロトコールは、軟骨組織の天然ECMを厳密に模倣したDC-ECMハイドロゲルを製造するための新しい方法を提供することで、このニーズに対処します。プロトコルは軟骨のティッシュをdecellularizing、生じるECMを隔離し、そしてbiocompableポリマーとECMを架橋することによってハイドロゲルを作成することを含む。得られたハイドロゲルは、軟骨細胞の増殖と分化をサポートする上で有望な結果を示しています。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl、pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl、pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg;C冷凍庫</td><td>エッペンドルフ</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ</td><td>アラジン</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy血液&ティッシュキット</td><td>Qiagen</td><td>No. 69506</td><td></td></tr><tr><td>GAG 比色定量検出キット</td><td>Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2 乾燥機&nbsp;</td><td>日立</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>サーモフィッシャー</td><td>N/A</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>走査型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ふるい</td><td>SHXB-Z-1</td><td>上海Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>紫外線ランプ</td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ビタミン B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス ミキサー</td><td>上海 Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

脱細胞化軟骨細胞外マトリックス(DC-ECM)ハイドロゲルは、生体適合性と天然の組織特性を模倣する能力により、組織工学および再生医療のための有望な生体材料です。このプロトコルは、軟骨組織の天然ECMを密接に模倣するDC-ECMハイドロゲルを製造することを目的としています。このプロトコルでは、ECMの構造と組成を維持しながら細胞物質を除去するために、物理的および化学的破壊と酵素消化の組み合わせを行います。DC-ECMは、化学薬品を使用して架橋され、安定で生物学的に活性なハイドロゲルを形成します。DC-ECMハイドロゲルは、生物活性、空間構造、生物学的誘導機能に優れ、免疫原性も低い。これらの特性は、細胞の接着、増殖、分化、遊走を促進し、細胞増殖のための優れた微小環境を作り出すのに有益です。このプロトコルは、組織工学の分野の研究者や臨床医に貴重なリソースを提供します。生体模倣ハイドロゲルは、軟骨の修復と再生のための効果的な組織工学戦略の開発を促進する可能性があります。

より優れたDC-ECM軟骨ハイドロゲルを調製するために、以前の文献を研究およびレビューし、脱細胞化率、免疫原性、および機械的機能の観点からさまざまな脱細胞化プロトコルを比較しました9。
これに基づいて、DC-ECM軟骨ハイドロゲルを調製し、骨軟骨欠損症の治療における放射状配向抽出マトリックス/間葉系幹細胞エクソソームバイオインクの効果を調査しました。その結果、DC-ECM軟骨ハイドロゲルは免疫原性が低く、細胞遊走を促進し、軟骨修復を促進する可能性があることが示された10。
近年では、DC-ECM軟骨の作製を最適化しています。上記の実験手順を用いて脱細胞化軟骨を作製した。その結果、脱細胞化軟骨では、天然軟骨と比較してDNA含有量が除去されることが示されました(p &lt; 0.001、 図1A)。ヒドロキシプロリン検査では、天然軟骨と脱細胞化軟骨の間でコラー...

この論文では、脱細胞化軟骨細胞外マトリックス(DC-ECM)ハイドロゲルの新しい合成方法を紹介します。DC-ECMハイドロゲルは生体適合性に優れており、細胞増殖に優れた微小環境を提供します。したがって、それらは理想的な細胞足場および生物学的送達システムとなり得る。

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

私たちのプロトコルは、軟骨組織の性質によく似たハイドロゲルで疾患を作り出すことを可能にするという点で重要です。この技術の主な利点は、空間構造において明らかな生物活性、低い免疫原性、および生物学的産業機能を有するハイドロゲル中で疾患を産生する能力である。まず、採取した軟骨をメスで1〜2立方ミリメートルの大きさに切り刻みます。50ミリメートルの遠心チューブに、みじん切りにした軟骨20グラムを20ミリリットルの低張塩酸トリス緩衝液に浸します。チューブを摂氏80度で3時間置き、次に摂氏37度のオーブンで3時間置きます。遠心分離管を1000RPMで30秒間ボルテックスします。次に、50ミリリットルの遠心分離管に置かれたプラスチックふるいを使用して脱細胞化軟骨をろ過します。軟骨を採取する前に滅菌PBSで3回洗浄します。採取した軟骨に10ミリリットルのトリプシン溶液を加え、摂氏37度のシェーカーで24時間インキュベートし、4時間ごとにトリプシンを交換します。懸濁液を濾過した後、トリプシン処理軟骨を高張緩衝液で洗浄する。軟骨が保存されたら、10ミリリットルのヌクレアーゼ溶液を加え、摂氏37度のシェーカーに4時間置きます。滅菌PBSで洗浄した後、高張塩酸トリス溶液を軟骨に加え、図のようにシェーカーの上に置きます。滅菌PBSで洗浄したら、組織を1%Triton X-100溶液に24時間浸します。Triton X-100を取り外した後、脱細胞化軟骨を蒸留水で3日間すすぎ、12時間ごとに水を交換します。3日後、軟骨に過酢酸溶液を加え、4時間浸します。PBSで洗浄したら、前述のようにプラスチックふるいを使用して軟骨を採取します。液体窒素を用いて、脱細胞化軟骨粉末を調製する。2グラムの軟骨粉末に80ミリリットルの0.5モル酢酸と20ミリグラムのペプシンを加え、摂氏37度で24時間混合物を消化します。消化後、懸濁液を400Gで10分間遠心分離し、上清を回収し、現在はDC-ECM溶液と呼ばれていますDC-ECM溶液を保存するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの溶液を加え、凍結乾燥機に入れます。溶液が凍結乾燥したら、遠心チューブに移します。ヒドロゲルを形成するには、20ミリグラムの凍結乾燥DC-ECM溶液を1ミリリットルの滅菌蒸留水に溶解します。ボルテックスしたら、1ミリグラムのビタミンB2をDC-ECM溶液に加えます。インキュベーション後、UV光を3分間照射します。緩衝液GTLとプロテイナーゼKを20ミリグラムのDC-ECM軟骨粉末に添加し、渦振動を用いて十分に混合します。軟骨を完全に溶解させるには、混合物を摂氏56度で4時間インキュベートします。ボルテックスしたら、200マイクロリットルの緩衝液GTLを加え、続いて無水エタノールを加えます。ボルテックス後、サンプルを6000 Gで摂氏4度で1分間遠心分離します。次に、原稿に記載されているようにDNAを収集して定量します。コラーゲンを分析するには、5ミリグラムのDC-ECM粉末を塩酸中で摂氏100度で20分間酸性化します。次に、5ミリリットルの6モルの水酸化ナトリウム溶液で中和します。中和したサンプルのヒドロキシプロリン含有量を、ヒドロキシプロリン標準試料に対して 570 ナノメートルの吸光度を使用して計算します。混合後、500マイクロリットルの試薬Aを200ミリグラムのDC-ECM粉末に加えます。サンプルを摂氏4度で16時間インキュベートします。遠心分離したら、サンプル溶液の50マイクロリットルを収集し、試薬Bの50マイクロリットルを追加し、試薬C.Afterサンプルを10分間インキュベートした後、試薬Dの750マイクロリットルを追加し、暗闇で30分間インキュベートします。遠心分離後、1マイクロリットルの試薬Eをペレットに加え、遠心分離前によく混合します。次に、GAG含有量測定の前にサンプルを解離します。調製したDC-ECM軟骨では、DNA含量が有意に除去された。しかし、コラーゲンとGAGの含有量は、天然の軟骨と比較して保持されていました。SEMおよびTEM分析により、準備されたDC-ECMの超微細構造が実証されました。逆チューブで調製したヒドロゲルは底部に流れず、ゲル化を示しました。さらに、DC-ECMのみの溶液と比較して、ビタミンB2の添加は、DC-ECMヒドロゲル形成中の誘導架橋によるゲル化時間を短縮した。DC-ECMハイドロゲルの粘度は溶液粘度よりも高く、せん断速度の増加により溶液粘度が低下しました。さらに、DC-ECM溶液とヒドロゲルの高い貯蔵弾性率は、どちらも液体ではなくゲルの特性を持っていることを示しました。SEM分析により、DC-ECM溶液の細孔径は、架橋および凍結乾燥後のヒドロゲル形態で有意に減少することが実証されました。このプロトコルでは、物理的および化学的破壊と酵素消化を組み合わせて、ECMの構造と会話を維持しながら細胞物質を除去します。

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成

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