Name: 改変自家馴化血清の作製とマウス角膜上皮における治癒能の ex vivo 評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: 学ぶ改変自家馴化血清の作製法とマウス角膜上皮における治癒能の評価方法。簡便なプロトコルで従来の自家血清より優れた創傷治癒効果を確認し、眼表疾患治療の新たな選択肢を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、優れた技術支援を提供してくれたYa-Lan ChienとChia-Ying Lee、そして言語版を提供してくれたOnLine English社に感謝します。この研究の一部は、Chang Gung Medical Research Project(助成金番号CMRPG3L1491)によって資金提供されました。

研究は、プロトコルセクションの冒頭にある制度的ガイドラインに準拠して実施されました。すべてのプロトコルと手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、長宮医療財団治験審査委員会によってレビューおよび承認されました。すべてのボランティアは、この研究の性質を知らされ、インフォームドコンセントフォームに署名しました 含める前に。実験手順全体に必要な消耗品は、図 1 と 図2、および 材料表に示されています。
1. mACS点眼剤の製造に必要な材料の準備
<ol><li>250 mLの10%グリセロール溶液を調製し、21 Gの蝶の羽の輸液セット、針なしの3 mLシリンジ、およびヘパリン158 USPユニットを含む6本の10 mLバキュテイナーチューブを準備します(図1)。</li>
	<li>21 Gの採血針を3 mLシリンジに接続し、3 mLの10%グリセロール溶液を準備したシリンジに引き出します。 注意: 針を挿入する前に、すべての材料を滅菌する必要があります。</li>
	<li>10%グリセロール溶液を順番にバキュテイナーチューブに分配し、それぞれに約0.5mLの10%グリセロール溶液を入れます(図3A)。 注意: 試験管内の負圧のため、3mLのグリセロール溶液を6本の試験管に均等に分配するには、針が入った直後に針を出す必要があります。</li>
	<li>75%アルコール滅菌綿棒で患者の皮膚を滅菌します。18 Gの採血針で患者の上肢の表在静脈を穿刺します。表在静脈から合計60〜70mLの静脈血を採取します。</li>
</ol>2.mACS点眼剤の準備
<ol><li>採取した静脈血10 mLを6本のバキュテイナーチューブのそれぞれに順次注入します(図3B)。 注意: このステップは、真空の負圧に依存してチューブを満たします。血球破壊や溶血を避けるために、陽圧をかけないでください。</li>
	<li>6本のバキュテイナーチューブを37°Cの一定温度のインキュベーターに4時間入れます(図3C)。 注:低酸素状態は、グリセロールを受け取った密閉チューブ内の残りの負圧によって維持および安定化されます。</li>
	<li>4時間後にチューブをインキュベーターから取り出し、室温で10分間3,500 × g で遠心分離します。</li>
	<li>この時点で、滅菌した点眼ボトル、針付き3 mLシリンジ、0.22 μmフィルター、18 G針、滅菌手袋など、mACS抽出用の材料を準備します(図2)。 注意: 無菌環境を確保するために、手術台は75%アルコールで拭く必要があります。遠心分離後の上清は、すでにmACSの半製品です。</li>
	<li>6本のチューブをチューブラックに置き、完全に遠心分離した後、キャップを開きます(図3D)。 注意: このステップでは無菌は必要ありません。</li>
	<li>滅菌手袋を着用し、18Gの針が付いた3mLシリンジを使用してmACSを1つずつ引き出します。 注意: このステップでは、下の血球層を描画しないように注意してください(図3E)。</li>
	<li>針を引き出し、0.22 μmフィルターに接続し、元の3 mLシリンジを備えた23 G、1.5インチ採血針を下の出口に接続します(図3F)。</li>
	<li>針を0.22 μmフィルターを通して、準備した滅菌点眼ボトルにそっと押し込みます(図3G)。</li>
	<li>すべてのmACSがろ過され、点眼ボトルに保存されるまで、上記の手順を繰り返します(図3H)。</li>
	<li>mACS点眼薬は、すぐに使用できるように4°Cで保管してください。長期保存のために-20°Cで保存してください。 注意: 2°Cで4週間以上、または-3°Cで20か月以上9,19保管しないでください。</li>
</ol>3. マウス角膜上皮の 生体外 創傷治癒モデル
注:以下の ex vivo 動物モデルは、角膜上皮20の機械的損傷に関するHungらの以前の経験に基づいていました。次の手順を顕微鏡下で実行して、十分に外接した一貫した角膜上皮創傷を作成する必要があります。
<ol><li>C57BL / 6マウスを3%〜4%イソフルランで麻酔します。皮膚生検パンチをマウス中央角膜の上にインデントし、均一な創傷縁として上皮に浅い円を残します。 注意: 眼球の破裂を避けるために優しくしてください。</li>
	<li>確認された領域内の角膜上皮をボーマン層までデブライドし、0.5mmのバリを備えた角膜サビリングリムーバーを使用します。</li>
	<li>機械的角膜創傷の ex vivo 動物モデルを確立するには、眼球を採取し、培養物を十分に準備します。<ol><li>最初にマウスを安楽死させます。次に、マウスの上眼窩縁と下眼窩縁をそっと押し、鉗子の先端を球後腔に導入し、眼球を取り出し、鉗子で保持します。</li>
		<li>眼球を完全に隔離するために角膜ハサミで視神経と眼窩周囲軟部組織を切断します。</li>
		<li>その中に溶けたワックスを入れた96ウェルプレートを準備します。鉗子の先端を使って丸い穴をすばやく作成し、固まるのを待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>テストする培地を準備します:比較のために0.5%mACS、0.5%AS、陰性対照としての通常の生理食塩水、およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。 注:mACSは上記のプロトコルを使用して取得されます。</li>
	<li>ex vivo培養では、採取した眼球を準備済みの96ウェルプレートに置きます。各培地200 μLを96ウェルプレートに加えます。</li>
	<li>96穴培養プレートを5%CO2を含む37°Cのインキュベーターに入れます。培地が24時間ごとに交換されることを確認してください。</li>
	<li>逐次創傷治癒効果を確認するには、フルオレセイン染色により8時間ごとに顕微鏡下で上皮創傷領域をモニターします。<ol><li>フルオレセイン紙上のフルオレセインを生理食塩水で溶解します。</li>
		<li>フルオレセイン色素をマウス中央角膜に滴下し、顕微鏡で観察して記録します。典型的な結果を 図4に示します。 注:観察にはフルオレセイン色素1滴(約0.05 mL)で十分です。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+artificial+tears+made+with+autologous+serum+in+patients+with+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca.</a> Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).</li>
<li>Noble, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autologous+serum+eye+drops+with+conventional+therapy+in+a+randomised+controlled+crossover+trial+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).</li>
<li>Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+growth+factor+analysis+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Serum growth factor analysis in dry eye syndrome.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).</li>
<li>Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+serum+sample+extraction+methods+and+their+suitability+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).</li>
<li>Tsubota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+dry+eye+by+autologous+serum+application+in+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).</li>
<li>Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+double-blind+clinical+trial+of+autologous+serum+versus+artificial+tears+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome.</a> Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).</li>
<li>Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).</li>
<li>Jirsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+autologous+serum+eye+drops+in+severe+dry+eye+patients%3B+subjective+and+objective+parameters+before+and+after+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment.</a> Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).</li>
<li>Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for dry eye.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+versus+artificial+tear+drops+for+dry+eye+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).</li>
<li>Soni, N. G., Jeng, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+topical+therapy+for+ocular+surface+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases.</a> The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).</li>
<li>Solomon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anti-inflammatory+forms+of+interleukin-1+in+the+tear+fluid+and+conjunctiva+of+patients+with+dry-eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).</li>
<li>Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+anti-inflammatory+cytokines+in+whole+blood+by+physico-chemical+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction.</a> Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).</li>
<li>Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutics+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutics for ocular surface disease.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).</li>
<li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease%3A+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li>
<li>Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+attenuates+interleukin-1%CE%B2-induced+apoptosis+and+inflammation+in+chondrocytes+through+targeting+hypoxia-inducible+factor-2%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α.</a> Tissue and Cell. 73, 101646(2021).</li>
<li>Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+for+degenerative+diseases+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects.</a> Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).</li>
<li>Gull, M., Pasek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycerol+and+its+derivatives+in+the+biochemistry+of+living+organisms%2C+and+their+prebiotic+origin+and+significance+in+the+evolution+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Catalysts%22%5BJournal%5D)">The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life.</a> Catalysts. 11 (1), 86(2021).</li>
<li>Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+dry+eye+syndrome+treatment%3A+therapeutic+role+of+blood+products%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products.</a> Frontiers in Medicine. 5, 33(2018).</li>
<li>Hung, K. H., Yeh, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+and+in+vivo+animal+models+for+mechanical+and+chemical+injuries+of+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63217(2022).</li>
<li>Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).</li>
<li>Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+autologous+conditioned+serum+for+treatment+of+osteoarthritis%2C+in+vitro+effects+on+cartilage+metabolism+and+intra-articular+levels+after+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection.</a> Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114(2010).</li>
<li>Antebi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+physiological+hypoxia+potentiates+the+therapeutic+function+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265(2018).</li>
<li>Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+serum+eye+drops+with+contact+lenses+in+the+treatment+of+chemical+burn-induced+bilateral+corneal+persistent+epithelial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects.</a> BioMed Research International. 2022, 6600788(2022).</li>
<li>Diaz-Valle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+efficacy+of+topical+insulin+with+autologous+serum+eye+drops+in+persistent+epithelial+defects+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).</li>
<li>Metheetrairut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+epitheliotrophic+factors+in+platelet-rich+plasma+versus+autologous+serum+and+their+treatment+efficacy+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 8906(2022).</li>
<li>NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+keratopathy%3A+current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects.</a> Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).</li>
<li>Garcia-Conca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+treatment+of+hyposecretory+dry+eye+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma.</a> Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).</li>
<li>Gholian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+conditioned+serum+dressings+in+hard-to-heal+wounds%3A+a+randomised+prospective+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial.</a> Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).</li>
<li>Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+applications+in+the+treatment+of+musculoskeletal+diseases%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review.</a> Future Science OA. 8 (2), 776(2022).</li>
<li>Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+in+equine+and+human+orthopedic+therapy%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review.</a> Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).</li>
<li>Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum.+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation.</a> Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).</li>
<li>Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+rich+plasma+versus+autologous+conditioned+serum+in+osteoarthritis+of+the+knee%3A+clinical+results+of+a+five-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study.</a> Cureus. 14 (4), e24500(2022).</li>
</ol>

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

この研究では、mACSの調製のためのプロトコルが説明され、動物モデルの創傷治癒におけるmACS点眼薬の利点がさらに示されています。このmACSプロトコルの重要な変更は、各試験管に約0.5 mLの10%グリセロール溶液を添加することであり、37°Cでの4時間のインキュベーション中に適切な低酸素状態を作り出します。 この設定は、ASに適切なストレスを与え、細胞が創傷治癒を助けるために必要な成長因子を分泌するように促します。0.22μmのフィルターは、高分子タンパク質、血球、不純物を除去するのに役立ち、最終製品を純粋で接着性の低いものにします。
血液を37°Cで4時間インキュベートし、さらに遠心分離とろ過を行います。最終製品を適切な温度で調製および保管する際の無菌性への厳密な注意も重要です。最終血清製品の高い栄養素含有量は、細菌にとって優れた培養培地です。したがって、調製中の不適切な保管または汚染は点眼薬を損なう可能性があります。汚染されたmACSは、結膜炎や感染性角膜炎などの病気を引き起こす可能性があります。
患者の血液の質も重要...

ドライアイ疾患における自家血清(AS)の治療効果は、1980年代にFoxらによって最初に報告されました1。ASの潤滑特性と必須のエピテリオトロピック生化学的成分の両方が、天然の涙を模倣して、角膜上皮細胞の増殖に利益をもたらすと考えられています。過去数十年にわたって、これに基づいていくつかの研究が行われてきました。栄養成分には、上皮成長因子(EGF)、ビタミンA、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)、および他のサイトカインが含まれる。興味深いことに、血清にはTGF-βとビタミンAが豊富に含まれており、これらは表皮増殖に極めて重要な役割を果たしていると考えられています2,3,4,5。さらに、眼表面疾患の患者を治療する場合、いくつかの研究は、患者が報告した結果、他の客観的なドライアイパラメータ6,7、および細胞密度8などの顕微鏡所見におけるAS点眼薬のいくつかの利点を示しています。メタアナリシス研究では、AS点眼薬治療で患者の症候群を改善することにいくつかの利点があるかもしれないことが明らかになりましたが、長期的な結果と観察はまだ不足しています9,10。
ASとは異なり、多血小板血漿(PRP)は、調製中に抗凝固剤を添加することに由来し、血小板のさらなる差遠心分離と化学的活性化を伴う。ASと比較して、TGF-β、血管内皮成長因子(VEGF)、およびEGFなどの多数の化学物質および成長因子がPRPに存在する。また、症状緩和に臨床的利益をもたらす眼表面疾患にも適用されています11。
上皮欠損と炎症の間の架橋は複雑です。特に、免疫病態生理学は眼の表面疾患におけるもう一つの重要な問題である。IL-1βおよびIFN-γなどの炎症誘発性サイトカインは、炎症カスケードにおける極めて重要なメディエーターであると考えられている12。したがって、免疫メカニズムの理解に基づいて、新しい治療の道が開かれます。インターロイキン−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)および他の抗炎症性サイトカインの産生を含むこの炎症過程を止めるための戦略もまた、眼表面疾患において重要な役割を果たす可能性がある13、14、15。
1998年以来、商品化された自家コンディショニング血清(ACS)であるオルソカインは、変形性関節症(OA)、関節リウマチ(RA)、および脊椎疾患に苦しむ整形外科患者に臨床的に使用されてきました13。ASおよびPRPと比較して、化学的にコーティングされたガラスビーズによる処理および単球を活性化するための低酸素インキュベーションは、ACS16の特徴です。理論的には、細胞に生存ストレスを加えることによってより多くの抗炎症因子が分泌され、その結果、IL-1Raを含む必須免疫調節成分の濃度が高くなります。ASと比較して、OAにおけるACSの治療効果の改善も報告されています17。眼表面疾患は、いくつかの点で整形外科炎症性疾患と同様の免疫背景を共有しています。したがって、整形外科分野でのヒト血液由来治療の成功結果に基づいて、ACSは、エピテリオトロピックおよび免疫調節特性によって、臨床診療における従来の治療よりも優れている可能性があります。ACSは整形外科の炎症性疾患で広く使用されていますが、眼科での臨床応用はまだ検討する必要があり、コストが高いこと、文献サポートの欠如、および調製プロセスの標準化の欠如によって妨げられる可能性があり、その結果、多様な性能が得られます。
このビデオ記事では、修飾ACS(mACS)、または成長因子に富む血漿(PRGF)を生成するための、新しく費用効果が高く、便利な方法が実証され、商品化されたACSに匹敵する実用的な価値を持つ点眼液が製造されました。抗凝固剤を添加し、ストレスインキュベーションによって血球に抗炎症性サイトカインを分泌させるという重要なアイデアは保持されましたが、CrSO4コーティングガラスビーズや市販キットに基づく方法などの化学的に誘発される方法とは異なり、臨界ストレス状態は低酸素インキュベーションによって物理的に誘発されますこの方法。さらに、グリセロールは、血球の膜の安定性の向上、適切な浸透圧細胞外液圧の維持18、および細胞に過度のストレスを避ける低酸素状態での適切な栄養源を含む追加の利点を提供するために添加されました。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;96ウェル培養プレート</td><td>Merck KGaA, Germany</td><td>CLS3997</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer lid speculum</td><td>katena</td><td>K1-5355</td><td>15 mm</td></tr><tr><td>Barraquer needle holder</td><td>Katena</td><td>K6-3310</td><td>without lock&nbsp;</td></tr><tr><td>バロン真空パンチ 8.0 mm</td><td>katena</td><td>K20-2108</td><td>濾紙切断用</td></tr><tr><td>BD 10.0 mL ヘパリンを含む 158 USP ユニット</td><td>ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー、US</td><td>367880</td><td>少なくとも 6 本のチューブ、その後の実験のために血液を収集し、血液凝集を避けるために必要</td></tr><tr><td>BD 21 G 蝶の翼を持つ輸液セット</td><td>ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー、米国</td><td>367281</td><td>グリセロール溶液</td></tr><tr><td>C57BL/6マウス</td>の均等な分布&nbsp;<td>国立動物実験動物センター</td><td>RMRC11005</td><td>マウスモデル</td></tr><tr><td>カストロビエージョ鉗子0.12mm</td><td>カテナ&nbsp;</td><td>K5-2500</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>5811000428</td><td>3,500 x g 10</td></tr><tr><td>分間 Cheng Yi 10.0 mL 滅菌済み点眼器ボトル</td><td>Cheng Yi Chemical, 台湾</td><td>CP405141</td><td>無菌でなければならず、最終製品の保存容器として</td></tr><tr><td>角膜錆リング除去剤 0.5 mm バリ</td><td>Algerbrush IITM;Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td><td>CHI-675</td><td>for debridement of the corneal epithelium</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified minimal essential medium</td><td>Merck KGaA, Germany</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>濾紙&nbsp;</td><td>東洋老師株式会社</td><td>1.11</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインナトリウム眼科用ストリップUSP</td><td>OPTITECH</td><td></td> OPTFL100<td>角膜上皮欠損の染色&nbsp;</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーFirstek、台湾</td><td>S300S</td><td>37 &deg;C 4時間用</td></tr><tr><td>カナム滅菌手袋</td><td>カナムラテックスインダストリーズ、インド</td><td>EN455</td><td>無菌操作用</td></tr><tr><td>メルク 0.22 &micro;m filter</td><td>Merck KGaA, Germany</td><td>PR05359</td><td>A least 2 filters for mACS filtration</td></tr><tr><td>Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution</td><td>Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan</td><td>19496</td><td>血液細胞に適した膜安定化効果と細胞外浸透圧を提供するには</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>100-120-1101</td><td></td></tr><tr><td>皮膚生検パンチ 2mm</td><td>STIEFEL</td><td>22650</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td><td>SV11</td><td>手術用顕微鏡</td></tr><tr><td>Terumo 18 G 針</td><td>Terumo, 台湾</td><td>SMACF0120-18BX</td><td>3.0 mL 注射器 18 G 針付き 遠心分離後に上清を抽出する</td></tr><tr><td>Terumo 20.0 mL 注射器</td><td>テルモ, 台湾</td><td>MDSS20ES</td><td>最初の遠心分離後に血清を採取し、二次遠心分離に使用するために使用できます。</td></tr><tr><td>23Gニードル入りテルモ3.0mLシリンジ</td> テル<td>モ、台湾</td><td>MDSS03S2325</td><td>3.0mLシリンジを使用して、遠心分離後に上清を抽出します。次に、フィルターと23G針を接続して点眼薬ボトルに注入します。</td></tr><tr><td>ウェストコット腱切開はさみミディアム</td><td>カテナ</td><td>K4-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

改変自家馴化血清の作製とマウス角膜上皮における治癒能の ex vivo 評価

Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium

ヒト血液由来の局所療法は、ここ数十年で臨床医に恩恵をもたらしてきました。自家血清(AS)および多血小板血漿(PRP)は、角膜創傷治癒に不可欠な上皮向性成長因子が豊富に含まれています。ASとは異なり、PRPは差動遠心分離システムに基づいており、より多くの血小板由来成長因子を生成します。自家馴化血清(ACS)は、ASおよびPRPの調製を保存するだけでなく、炎症性疾患において重要な免疫調節特性にも焦点を当てています。
標準化されたプロトコルの欠如と高い準備コストは、ACSの臨床応用の限界です。このビデオ実験は、修正された自己条件化血清(mACS)点眼薬を調製するための標準的な操作手順を示しています。まず、低酸素インキュベーション中に血球安定剤としてグリセロールをヘパリン注射器に添加した。血球を活性化するために、37°Cで4時間のインキュベーションを開始した。その後、血液サンプルを室温で10分間3,500× g で遠心分離した。上清を0.22 μmのフィルターでろ過した後、mACS点眼薬を十分に調製しました。
mACSの治療効果の暫定的なトライアウトは、 それがex vivo マウス眼における角膜創傷治癒において従来のASよりも競争上の優位性を有する可能性があることを示した。本研究で用いたASは、公表された研究と当院での臨床診療に従って調製された。したがって、眼の表面疾患に対するmACSの有効性は、 in vivo 動物実験および臨床試験を通じて将来の研究で評価される可能性があります。

図1と図2は実験に必要な材料を示し、図3はmACSの調製中の連続したステップと成功した中間生成物を示しています。まず、0.5 mLの10%グリセロール溶液を各10 mLの滅菌試験管に添加した(図3A)。次に、患者から60〜70mLの静脈血を採取し、各チューブに10mLの血液を注入した(図3B)。患者の血液は、血液の質が標準に達していることを確認するために、準備の前に徹底的な定期的な臨床検査を受けなければなりません。最も一般的な低品質の血液製剤は脂質異常症によるものであり、遠心分離後に血清の上層が濁り、除去が困難です。点眼薬のさらなる調製は継続できない(図5A)。
次いで、密封された試験管を37°Cのインキュベーターに4時間入れる...

この記事では、プロセスを簡素化し、自家コンディショニング血清(ACS)の調製をより安価にするプロトコルについて説明します。特別な注射器や表面コーティングされたガラスビーズは必要ありません。さらに、修飾ACS(mACS)は、マウス眼の角膜創傷治癒において、 エキサイビボで従来の自家血清よりも競争上の優位性を有する。

Human blood-derived topical therapies have been a boon to clinicians in recent decades. Autologous serum (AS) and platelet-rich plasma (PRP) are enriched ...

このプロセスは、複雑な技術的処理を必要としないmACSと呼ばれる革新的な血液由来製品を提示します。また、従来の自家血清よりも創傷治癒を大幅に促進します。標準化された調製プロセスを提供することに加えて、この技術は血清点眼薬のコストを削減し、より手頃な治療オプションへの患者のアクセスを改善することもできます。この技術は、創傷または組織の再生、修復、および抗炎症を促進することを必要とする分野に適用され得る。この技術は、治癒が困難な創傷や重度の眼表面疾患などの慢性炎症性疾患にとって大きな利点となるであろう。はじめに、以前に採取した10ミリリットルのヒト静脈血を6本のバキュテイナーチューブのそれぞれに注入します。チューブを摂氏37度のインキュベーターに4時間置き、次にチューブを3, 500 Gで室温で10分間遠心分離します。チューブをラックに置いた後、チューブをデキャップします。滅菌手袋を着用した後、18ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器を使用して、各チューブからmACSを引き出します。針を引き出し、0.22マイクロメートルのフィルターを取り付けます。23ゲージ、1.5インチの採血針を元の3ミリリットルのシリンジでフィルターの出口に接続します。すぐに使用できるように、フィルターを通して針を準備済みの滅菌点眼ボトルにそっと押し込み、点眼薬を摂氏4度で保管します。ex-vivo表面治癒モデルでは、mACS点眼薬で治療された被験者は、自家血清滴で治療された被験者と比較して優れた角膜治癒を示しました。16時間で、すべてのグループの角膜創傷は、0.5%mACSで治療されたものよりも治癒が遅かった。DMEM群のマウス角膜および24時間後の自家血清は、通常の生理食塩水群を除いて、32時間でmACSSと同等の治癒を示しました。他のすべてのグループは、ほぼ完全に回復しました。最も重要なステップは、プロセス中に無菌手順に従うことです。血清製品は栄養素が豊富であるため、角膜に汚染された製品を使用すると、重度の角膜潰瘍を引き起こす可能性があります。この製品は、創傷の治癒および眼表面疾患症状の改善を評価するために使用することができる。サイトカイン成分を分析し、mACSのより大規模なランダム化比較試験を実施することは、さらなる研究に不可欠です。

production-modified-autologous-conditioned-serum-ex-vivo-assessment

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。...

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。...

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。...

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。...

生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。...

操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。...

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

ウサギの角膜間質創傷修復のための現場ブルーライト交差ゲラチンリボフラビンハイドロゲルの調製、濃縮、適用に関する再現可能なプロトコルを提示し、手術的取り扱い、部分的な足蘠切除術、術後ケアの手技手順を含みます。...

ウサギの角膜創傷修復のための強化光交連ゲラチン–リボフラビンハイドロゲルの製造および外科的応用

学ぶ改変自家馴化血清の作製法とマウス角膜上皮における治癒能の評価方法。簡便なプロトコルで従来の自家血清より優れた創傷治癒効果を確認し、眼表疾患治療の新たな選択肢を提供します。

改変自家馴化血清の作製とマウス角膜上皮における治癒能の ex vivo 評価

さらに動画を探す