Name: ブタ脳組織からのチューブリン収量の最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶブタ脳組織からチューブリンを高収率で精製する方法。遠心分離と電子顕微鏡を用いて重合活性を評価し、神経変性疾患の治療薬開発に活用する。

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<meta charset="utf8"></head><body>神経組織からの効率的なチューブリン単離

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL</td>チューブ<td>---</td><td>---</td><td>共通材料</td></tr><tr><td>10 mLチューブ</td><td>------</td><td></td><td>共通材料</td></tr><tr><td>50 mL</td>チューブ<td>---</td><td>---</td><td>共通材料</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>デュースガラスホモジナイザー</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>ホモジナイザー</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>目盛り付きビーカー---</td><td></td><td>---</td><td>一般的な機器</td></tr><tr><td>目盛り付きシリンダー</td><td>---</td><td>---</td><td>一般的な機器</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td>非常に高品質の</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>ティッシュ輸送用イゾレーテッドボックス</td><td>---</td><td>---</td><td>一般的な機器</td></tr><tr><td>キッチンブレンダー</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>ガラスまたはプラスチック容器</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>---</td><td></td><td>---一般的な材料</td></tr><tr><td>メス&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>A94469</td><td>超遠心分離機</td></tr><tr><td>ホスホセルロースカラム</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>空のカラム</td></tr><tr><td>ホスホセルロース樹脂</td><td>クリエイティブ-Biomart、inc</td>リン<td>酸塩-001C</td><td>イオン交換樹脂</td></tr><tr><td>パイプ</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>分析グレード</td></tr>サ<tr><td>ッカロー</td>ス<td>PENTA</td><td>24970-31000</td>分析<td>グレード</td></tr><tr><td>スケール</td><td>---</td><td>---</td><td>共通機器</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>---</td><td>---</td><td>共通機器</td></tr><tr><td>スプーン&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>プラスチックまたはガラス</td></tr><tr><td>Ti45ローター</td>ベ<td>ックマンコールター&nbsp;</td><td>339160</td><td>超遠心</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>用ローター---</td><td>---</td><td>共通機器</td></tr><tr><td>ウルトラターラックス IKA T18 基本</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>実験室ディスペンサー</td></tr><tr><td>ウォーターバス 37 &deg;C</td><td>---</td><td>---</td><td>攪拌</td></tr></tbody></table>

ブタ脳組織からのチューブリン収量の最適化

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

分離および精製ステップでは、SDS-PAGE電気泳動用のサンプルを採取し、その後、Coomassie-blue染色を使用して分析しました(図2)。各サンプル20μLをLaemmliサンプルバッファー10μL(188 mM Tris-HCl pH 6.8、3% SDS (w/w)、30%グリセロール(v/v)、0.01ブロモフェノールブルー(w/w)、15% β-メルカプトエタノール)と混合し、95°Cで15分間インキュベートし、各サンプル4μLを12.5%アクリルアミドSDSゲルにロードし、還元および変性条件で1ゲルあたり30mAの定電流で分離しました。
その結果、相対チューブリン濃度の漸進的な増加と、汚染タンパク質の減少が確認されました。さらに、最初の遠心分離(ステップ3.2.7)では、このステップを省略した場合(図2A、B)と比較して、清澄化されたライセート中のチューブリンの有意な損失はありませんでした。
タンパク質濃度は、BCAアッセイ、Bradfordタンパク質アッセイ、およびSDS-PAGEゲルデンシトメトリー分析19 (図3)の3つの独立した方法を使用して決定しました。記載された手順を用いたチューブリンの全収率は、250gの神経組織から精製されたチューブリン123mgであった。測定時には、保存バッファー中の高DTT濃度がBCAアッセイに大きな影響を与えることを考慮する必要があります。PEMバッファーとPBSバッファーの両方を、DTTを添加すると、バックグラウンド吸光度が約0.900 A595増加し、BCAアッセイの容量が大幅に減少します(図3A)。DTTの悪影響は、純水で10倍希釈した後でも検出できます(データは示していません)。Bradfordアッセイは、デンシトメトリー分析で確認されたように、保存バッファー(図3B)の影響を受けていないようでした。
チューブリン調製物の純度は、2つの独立した施設(VRI Brno、Czech Republic;CEITEC MU Brno, Czech Republic)のエレクトロスプレーイオン化とMALDI-TOFを使用。どちらの分析でも、いくつかのアイソフォームにブタのチューブリンαとβが存在することが確認されました。全体の純度は 97.07% を超え(PSMs 1065)、最も多く見られる不純物は ホモ サピエンス ケラチン II 由来(PSMs 246、不純物の 2.24%)で、これはおそらくチューブリン単離と MS/MS 分析のためのサンプル調製中に導入されました。322 PSM と Sus scrofa 由来の血清アルブミン、アクチンガンマ、およびトリプシノーゲンのみで構成されるその他の不純物が、1 つのペプチド分解能(0.0069%)で同定されました。
その後の実験では、急速凍結後の重合能力の保存と液体窒素中での保存を確認しました。10 mg/mL アリコートを液体窒素から取り出し、氷上でゆっくりと解凍しました。自己組織化実験のために、DTT、ATP、および GTP を含む PEM バッファーでアリコートを希釈することにより、異なる濃度のサンプル(10 mg/mL、8 mg/mL、6 mg/mL、4 mg/mL、および 2 mg/mL)を調製しました。1つの希釈シリーズを37°Cで60分間インキュベートし、もう1つの希釈シリーズを氷上で60分間インキュベートしました。両シリーズを、21,000 x g および対応する温度(4°Cまたは37°C)で60分間遠心分離しました。上清30μLを除去し、SDS-PAGEに使用した。残った上清はピペットで丁寧に取り除き、廃棄しました。ペレットは、100 μMのPEMバッファーを加えて短時間洗浄した後、ピペットを使用して直ちに除去しました。その後、ペレットを50 μLの1倍濃縮SDSローディングバッファーに再懸濁して、ペレットと上清の相対濃度が保持されるようにしました。10 μL の SDS ローディングバッファーを各上清に加えました。すべてのサンプルは、SDS-PAGEおよびCoomassie Stainingを使用して分析しました(図4)。SDS-PAGEにロードされる各サンプルの量は、開始濃度に応じて調整されているため、濃度による降水量の差がより明確になります。PEM緩衝液中でのチューブリンの自己組織化試験により、温度依存的にチューブリン繊維を形成する能力が確認されました。
MAP2c駆動チューブリン20,21アセンブリアッセイを実施し、チューブリンが他のタンパク質と相互作用する能力を検証した22。MAP2cの段階希釈液は、100 μLの1 mg/mLチューブリンアリコートをMAP2cと混合して、最終濃度0 μMから8 μMの範囲に調製しました。すべてのサンプルは、新たに調製したPEMバッファーで1 mM DTTおよび1 mM GTPで希釈することにより、氷上で調製しました。チューブリンを異なる濃度のMAP2cで37°Cで15分間インキュベートし、21,000 x g、37°Cで60分間遠心分離しました。 ペレットの最終洗浄は、100 μLのPEMバッファーで2回行いました。この実験では、MAP2cを含まないサンプルのみがペレットを形成しなかったため、調製したチューブリンがMAP2cによる重合を受ける能力が確認されました(図5)。
さらに、共重合実験から得られたチューブリンフィラメントの存在を確認するために、透過型電子顕微鏡を用いた。MAP2cで沈殿させた精製チューブリンの懸濁液を、ネガティブ染色を用いた透過型電子顕微鏡法のために調製した。サンプルは、Formvarでコーティングされた炭素安定化銅グリッドに吸着されました。次に、グリッドを2%NH4MoO4 で陰性染色し、18,000倍の倍率と80kVの加速電圧で電子顕微鏡で調べました。明確な糸状構造と適切なサイズを持つ均質な微小管の存在は、天然のコンフォメーションで微小管を形成する能力を示しました(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> 図1:チューブリンの分離と精製の概略図。 括弧内の数字はプロトコルステップを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> 図2:チューブリンの分離と精製 (A)温度駆動重合を利用したチューブリン分離中に採取したサンプルのSDS-PAGE分析(1ラインあたり3 μL)。チューブリンの相対存在量(約50 kDa)の安定した増加に伴う不純物の減少が見られます。各行の上の数字は、プロトコルのステップ番号に対応しています。(B)リン酸化セルロース樹脂上のタンパク質クロマトグラフィー後に得られた画分のSDS-PAGE分析(1ラインあたり4μL)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> 図3:タンパク質濃度。 PEM バッファーまたは PBS 中で 1 mg/mL までのウシ血清アルブミンの希釈シリーズを、PEM または PBS バッファー中に 0.1 ATP、1 mM GTP、1 mM DTT を別々に、または組み合わせて 0.1 mM ATP、1 mM GTP、および 1 mM DTT を含む BSA 希釈シリーズと比較しました。(A)BCAアッセイを使用した場合、DTT(ソリッドシンボル)を含むサンプルのバックグラウンドに大きな変化が見られました。(B)この効果は、ブラッドフォードアッセイで濃度を測定したときには検出されませんでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> 図4:Tubulin自己組織化アッセイ。 自己組織化アッセイのSDS-PAGE解析により、(A)4 °Cまたは(B)37 °Cでインキュベートした保存チューブリンが、広範囲の濃度で温度依存的に重合する能力が確認されました。(P-ペレット、S-上清;チューブリンのそれぞれの濃度は各ラインペアの上に示され、ロードされた各サンプルの量は10μgであった)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> 図5:チューブリン共沈降アッセイ。 MAP2c支援チューブリン集合体のSDS-PAGE解析により、貯蔵チューブリンが微小管関連タンパク質との相互作用によって濃度依存的に重合する能力が確認されました。MAP2cのモル濃度は、各線の上に示されています。(P - ペレット、S - 上清)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> 図6:透過型電子顕微鏡。 TEM顕微鏡写真は、チューブリンが(A)MAP2cタンパク質で装飾された均質なチューブリンフィラメントからなる適切な直径(B)の微小管に集合することを示しました。バーは1000 nm(A)と200 nm(B)に対応します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

optimizing-tubulin-yield-from-porcine-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。...

マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

このビデオは、新鮮なブタの脳からの毛細血管の分離を示しています。このプロセスには、髄膜の除去、脳組織からの灰白質の分離、灰白質の均質化とろ過による毛細血管の分離、そして最後に酵素消化を使用して毛細血管をさらに精製することが含まれます。...

ブタの脳からの毛細血管の浄化

このビデオは、安楽死させたラットから脳の微小血管を分離するプロセスを示しています。これには、脳の解剖、組織の洗浄、機械的消化、その後の遠心分離の繰り返しによる微小血管の純粋な画分を分離することが含まれます。...

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リボソームの構造は広範囲に特徴付けられていますが、ポリソームの組織化はまだ十分に研究されていません。この知識不足を克服するために、ここでは、空気中および液体中の原子間力顕微鏡(AFM)による哺乳類のポリソームの正確なイメージングのための詳細な準備プロトコルを示します。...

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB)...

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

このプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。...

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。...

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。...

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした...

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。...

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ...

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

学ぶブタ脳組織からチューブリンを高収率で精製する方法。遠心分離と電子顕微鏡を用いて重合活性を評価し、神経変性疾患の治療薬開発に活用する。

ブタ脳組織からのチューブリン収量の最適化

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