Name: トランスクリプトミクスによる温帯バクテリオファージの溶解原体への影響の理解 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぼう、トランスクリプトミクスを用いて温帯バクテリオファージが細菌宿主の遺伝子発現に与える影響を解析する方法。培養条件の最適化により溶解状態を安定化し、RT-qPCRで正確な発現プロファイリングを実現します。

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緑膿菌MC106137,38,39からのStxファージの自発的誘導をより正確に定量化するためにプラークアッセイで以前に使用された選択可能な指標宿主の作成は、緑膿菌ファージLESΦ2についてここに記載されています。この介入には、サンプル処理のステップと時間が短縮され、複数の培養条件での自発的な誘導率の同時評価が可能になるという利点もあります。リファンピシン耐性変異体の作成中に他の変異を生じさせるリスクがある40。ただし、この研究では、進化した株は、目的の培養物からのプラークを列挙するための指標宿主としてのみ使用され、トランスクリプトーム分析には含まれていませんでした。選択可能な指標株が目的のファージによる感染に対して等しく感受性である限り、他の後天性変異についての懸念はありません。それにもかかわらず、PAO1WTおよびPAO1RIFのパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)分析では、制限フラグメント長多型プロファイルに差は検出されませんでした(データは示していません)。
宿主細胞を選択する際、まだ増殖物を保有していない指標株を見つけることはまれです。その好例として、PAO1は糸状のプロファージPf4を保有しています。この研究の実験的コントロールは、特定のファージ(この場合はLESプロファージ2)の遺伝子発現と、このファージが細菌の遺伝子発現に及ぼす影響を直接調べることができるように設計されています。LESプロファージ2を保有するPAO1とLESプロファージ2を欠損するPAO1(リゾゲンと非リソゲンの両方が内因性Pf4を保有)の比較では、宿主に対するPf4の影響を排除するための内部コントロールとして機能します。さらに、Pf4は通常、その宿主細胞41 において溶解を引き起こさず、したがって、これらの実験の結果を混乱させることができないことが実証されている。
有意義なオミクスデータを生成するためのサンプル調製において、慎重な品質管理が重要であることは十分に確立されている42。しかしながら、前述したように11、そのような研究のためのリゾゲン培養物の調製におけるプロファージ活性の慎重な特性評価はめったに行われない。ここでは、細菌と温帯ファージの相互作用をよりよく探索するために、トランスクリプトーム研究のために適切に制御され最適化された培養セットを調製するための体系的なプロトコルについて詳しく説明します。個体群の同期性は、抗生物質ノルフロキサシンを誘発して処理する前に、少なくとも4回の倍増によって培養物を持ち込むことによって制御されました。研究中の菌株のノルフロキサシンのMICを決定することにより、誘導剤の濃度が「誘導」治療のMICをわずかに上回っていることを確認できます。処理された細胞は、細胞が回復し、バクテリオファージ複製プロセスを完了し、細胞の溶解と感染性バクテリオファージ子孫の放出で終わるようにするために、1時間の処理後にMICの下でノルフロキサシン濃度を下げるために1:10を希釈しました。細胞はnorfloxacinの集中が回復期間の間にMICの下に持って来られた後だけ誘導の刺激に続く溶解性の複製周期に入ります。この場合、1 μg·mL-1ノルフロキサシンを超えることは、PAO1のノルフロキサシンのMICが0.19 μg·mL-1であるため、薬物がMICの下で効果的に希釈できなかったことを意味します。インデューサーの希釈レベルは、リゾゲン回収の必要性とRNAを回収するための培養密度の保持とのバランスをとる必要があります。ここで取り上げたデータは、培養を同期させてライソジェニーが優勢なサンプルを作製することで、自然誘導によるノイズを低減し、ライソジェニーによる遺伝子発現の真の変化を検出できることを実証しています。細菌細胞密度が低い指数関数的増殖初期では溶解原性状態が優勢であるため、RNA-Seqなどのその後の遺伝子発現研究に十分なRNAを収穫するために培養をスケールアップすることをお勧めします。
培養物を溶解サイクルに強制するための誘導剤としてのノルフロキサシンの使用は、よく報告されています43,44。しかし、これはプロセスにおける他の細菌遺伝子の発現にも影響を与えるであろう45,46。これを軽減するには、同じ誘導条件と非誘導条件で増殖させた対照野生型培養由来のRNAライブラリーをRNA-Seq実験に含める必要があります。qRT-PCRによるファージ複製の段階を検証するための内部コントロールとキーマーカー遺伝子の使用も、正確な比較のために重要です。定量的RT-PCRプロファイリングは、さまざまな時点での各遺伝子の転写産物の絶対数を比較することによって解釈することはできません。重要なのはプロファイルの形状です。第一に、どの遺伝子の転写産物でも1つの小さな領域しかサンプリングされていないため、それが短命な要素なのか、より長い寿命の要素なのかは不明です27。確かに、転写産物のRNA-Seqマッピングは、マッピングデータの密度が遺伝子の長さにわたって大きく変化することを示しています。第二に、溶解周期または溶解原性ライフスタイルに関連するマーカー遺伝子について解釈されるべき、あるいはファージ調節回路から切り離されたマーカー遺伝子について解釈されるべきであるのは、遺伝子発現プロファイルの形状である11。自然誘導は、ライソゲン培養における真の問題であり、常に溶解周期関連遺伝子の発現をもたらします。しかし、プロファイリングは、溶解性複製サイクルに関連する遺伝子が、その発現前誘導(少なくとも2つの対数フォールド)で抑制され、誘導後にアップレギュレーションされることを示しています。
Stxファージと大腸菌との相互作用のトランスクリプトーム解析は、溶解性の維持と溶解サイクルの引き金となるファージ遺伝子の完全な理解を裏付けている11,17。現在、緑膿菌のLESファージにアノテーションが付けられているが、その重要な遺伝子機能はあまりよくわかっていない。トランスクリプトーム研究により、LESプロファージの再アノテーションが可能になり、溶解と溶解サイクルに関与する遺伝子の理解が深まります。遺伝子配列を機能に結びつけることは、新規プロファージの研究における大きな課題であり、より良いアノテーションツールを製造するために、ファージ遺伝子の機能を確認するためのさらなる研究の必要性をさらに強調している47。このビデオ記事で詳述されているプロトコルのより広範な適用と適応、および追加の品質管理手段は、さまざまなプロファージ機能を明らかにするのに役立ち、したがって、アノテーションパイプラインを改善し、ファージと細菌の生物学の理解を変革する可能性があります。

近年、薬剤耐性1やCRISPR-Casを用いた遺伝子編集2に取り組むファージセラピーが、バクテリオファージ研究に新たな関心を寄せています。繰り返しになりますが、バイオテクノロジーの進歩により、バクテリアとファージの相互作用をより深く調べることが可能になりました3。しかし、ファージの治療的使用(「ファージ療法」)は、病原性および耐性遺伝子を水平方向に伝達する能力を持つ移動性遺伝要素として作用するファージに関する懸念によって妨げられている4。「暗黒物質」5(機能不明の遺伝子)の広がりは、厄介であると同時に魅力的でもあります。暗黒物質は、ファージ生物学の理解におけるギャップであり、分子ツールや潜在的な新規治療法のほとんど未開発のリソースであると考えられています6。改良された遺伝子アノテーション7,8,9および新しいペプチドフォールディングアルゴリズム10とともに、ハイスループット配列決定技術の開発は、ファージ遺伝子の検出、記述、および機能予測を改善している。しかし、科学は、培養や現実の世界におけるほとんどのファージの遺伝子機能を検証するには、まだほど遠い状態です。
RNAシーケンシング(RNA-Seq)は、ファージ感染中の遺伝子発現をグローバルにマッピングすることができ、溶解サイクルと溶解サイクルに関与するファージと細菌の両方の要素の理解を大幅に向上させました11,12。溶解過程において、温帯性ファージゲノムは細菌DNAに組み込まれ、プロファージとなる13。グローバルな遺伝子発現プロファイリング実験は、温帯ファージゲノムにコードされているが、溶解原性状態の間にのみ発現するプロファージ制限遺伝子を同定するために用いることができる11。このような遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードしておらず、ファージ感染プロセスに関与していません。RNA-Seqは、機能獲得を誘導したり、既存の細菌遺伝子を制御したりすることで、細菌宿主の生物学に影響を与える可能性が高い遺伝子を特定するために使用でき、多くの場合、細菌が変化する環境に適応できるようにします。したがって、プロファージが微生物の操り人形として行動し、さまざまな細菌機能を制御する能力を研究することができます。
プロファージ制限遺伝子発現の効果的な解析には、2つの大きな障壁があります。まず、影響を受けやすいホストの可用性が重要な問題です。定義上、プロファージはすでに特定の宿主ゲノムに組み込まれているため、プロファージの存在下と非存在下で全体的な遺伝子発現を比較するために感受性野生型宿主を見つけることは困難です。これは、宿主ゲノムの残りの部分を破壊することなく、別の感受性宿主のde novo感染または元の野生型分離株からのプロファージの欠失のいずれかによって達成できます。第2の障壁は、溶解原性集団の不均一性にあります。一部のプロファージは、突然変異や組換えによって分解され、細菌ゲノムの特定の場所に固定される「隠れた」状態になります。しかし、他のプロファージは「活性」であり、自発的に、または誘導因子への曝露後に、複製性の溶解サイクルに誘導される可能性があります。多くの溶解原性培養では、自発的誘導の速度は、細菌細胞の一部が常に溶解性ファージ複製を受けていることを意味します14,15,16。これらの集団における後期ファージ遺伝子の高レベルの発現は、リソゲン制限遺伝子発現に関連する低レベルの遺伝子発現を覆い隠す11,17。自発的な増殖誘導を受けるリソゲンの割合は、増殖状態、増殖条件、またはその他のトリガーによって変化し得る。したがって、プロファージが溶解原体に及ぼす影響を研究するには、溶解原性状態に有利なように増殖条件を最適化することにより、自発的なプロファージ誘導イベントを可能な限り最小限に抑える必要があります。
この研究は、緑膿菌のリバプール流行株(LES)からの一連の同生プロファージの影響を調査するために行われた準備作業を報告します。活性プロファージを誘導し、LESから単離し、モデル緑膿菌宿主株PAO116,18,19に感染させた。野生型緑膿菌株PAO1とその溶解原体PAO1Φ2の全ゲノムを(30倍の深さで)配列決定し、野生型株の同一性を確保し、溶解原が同質であることを確認しました。LESは、嚢胞性線維症患者の罹患率および死亡率の増加と関連しており、LESファージ19は、嚢胞性線維症の肺環境への適応を助けることが示唆されている16,19,20。これらのプロファージが宿主の生物学に影響を与えるという強力な証拠にもかかわらず20,21、それらの遺伝子機能の大部分は未だに特徴付けられておらず、相互作用の具体的なメカニズムは十分に理解されていません。トランスクリプトミクスのアプローチは、制御された宿主バックグラウンドにおけるプロファージ遺伝子の機能を経験的に明らかにすることができます。自発的誘導は発現プロファイルに影響を与える可能性があるため、本稿では、溶解原性状態を優先するように増殖条件を最適化する方法について説明します。このような培養の同期は、PAO1におけるLESファージ複製の重要な段階に関連する主要な遺伝子マーカーの発現レベルを定量化するために、リアルタイムPCRによって検証することができます。同じアプローチは、大腸菌11,17,21,22の運動性、耐酸性、および抗菌性耐性に影響を与える志賀毒素原性ファージのプロファージ制限機能を同定するために以前に使用されていました。

<table><tbody><tr><td>PAO1</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LESB58</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LESファージ</td><td>ノルフロキサシンを用いてLESB58から誘導および精製した。</td><td>この研究では</td><td></td></tr><tr><td>、リソジェニーブロス (LB)</td><td>Merck</td><td>1.10285.500</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.500</td><td></td></tr><tr><td>Agar Fisher</td><td></td><td>A/1080/53</td><td></td></tr><tr><td>Top Agar</td><td>0.4 g Agar +2.5 g LB Broth in 100 mL water; オートクレーブして使用する。</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>シグマ(ストック:メタノール中の50 mg / mL-よく混ぜて0.22μを使用します。mフィルターを滅菌して-20°Cで保存します。C使用まで)</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャー1%(v / v)水</td><td>10060000</td><td></td></tr>ノル<tr><td>フロキサシン</td><td>シグマ(ストック:25 mg / mLの1%氷酢酸-よく混ぜて0.22&microを使用します。mフィルターを滅菌して-20°Cで保存します。使用までC;凍結融解サイクルを避けるために、小さな分注として保存してください)</td><td>N9890</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ノールをクエン酸緩衝液で飽和 pH 4.3</td><td>Sigma</td><td>P-4682</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレードのエタノール</td><td>フィッシャー</td><td>16695992</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>12044977</td><td></td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ムフィッシャー</td><td>11398187</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー</td><td>17150576</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>10X TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS, BR キット</td><td>Invitrogen</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII first strand synthesis kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>PCR Reagents</td><td>Bioline Mytaq Red</td><td>2X BIO-25043</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Reagents</td><td>Sensifast SYBR Hi Rox</td><td>BIO-92020</td><td></td></tr><tr><td>PCR 精製キット</td><td>アイソレート II PCR & ゲルキット</td><td>BIO-52060</td><td></td></tr><tr><td>TA クローニング</td><td>キット TA クローニングキット、pCR 2.1 ベクター付き、コンピテントセルなし</td><td>K202040</td><td></td></tr><tr><td>StepOne リアルタイム PCR システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスクリプトミクスによる温帯バクテリオファージの溶解原体への影響の理解

Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics

温帯性ファージは、細菌ゲノムの大部分にプロファージとして組み込まれていることがわかっています。一部のプロファージは不可解で細菌の染色体に固定されていますが、他のプロファージは活性であり、自発的に、または誘導因子への曝露によって複製形態に引き起こされる可能性があります。プロファージは一般に、宿主細胞に毒素産生やその他の病原性関連形質を付与する能力と関連しています。最近の研究では、宿主の生理機能を変化させる上で、はるかに大きな役割を果たすことができることが示されています。今回紹介した手法により、プロファージが日和見細菌 である緑膿菌の遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べることができました。
この研究では、野生型の 緑膿菌 PAO1株の増殖を、リバプール流行株(LES)LESB58のプロファージの異なる組み合わせを運ぶ同原性溶解原の増殖と比較しました。溶解原体培養では、細菌細胞の一部が溶解性バクテリオファージ複製(自発的誘導)をサポートし、ファージ粒子の組み立てに関連するものなど、後期ファージ遺伝子の細胞あたりの高レベルの発現をサポートし、溶解原体制限遺伝子発現に関連する低レベルの遺伝子発現をマスクします。したがって、自発的誘導の影響により、ライソゲン集団全体の増殖遺伝子発現が不明瞭になる可能性があります。
成長プロファイリング実験は、指数関数的成長の初期には最小限であった自発的誘導を特定するために使用されました。この研究では、指数関数的増殖の初期にサンプル培養を調製する方法と、細胞数が少ないにもかかわらず適切なコントロールを設定する方法を報告しています。これらのプロトコルは、さまざまな条件下での野生型細菌と溶解原性細菌の信頼性と再現性のある比較を保証し、プロファージゲノムのトランスクリプトームプロファイリングを改善し、これまで認識されていなかったプロファージ機能の同定を支援します。

この研究では、非誘導条件下で増殖したPAO1 LESΦ2リゾゲン培養物からのファージ産生の直接時間的列挙を使用して、自発的なLESΦ2誘導の影響を決定しました。ファージ密度は最低点で、増殖の初期の指数関数的な段階の新鮮培地での継代培養後、平均は~2.61 x 106プラーク形成単位(PFU)·mL-1 2時間であり、リソジェニーが支配的な状態であったことを示唆しています。LESΦ2力価は、4時間以内に平均~2.4 x 108 PFU·mL−1まで急激に上昇し、6時間後には最高密度に達しました(平均:~5.83 x 109 PFU·mL−1;図4)。
最小限の自発的誘導は、リゾゲン増殖の初期の対数期(2時間後)に観察されました。.しかし、培地中のファージの存在が測定可能であったのは、核酸のタンパク質ヘッドへのパッケージング、ファージ粒子へのタンパク質の組み立て、後期ファージ遺伝子、中期ファージ遺伝子、および初期調節ファージ遺伝子の発現など、多くの先行イベントの結果でした。ファージ関連複製イベントの発現前に感染細胞を捕捉することが重要でした。したがって、誘導前に培養を成長させるために90分が選択されました。PAO1の遺伝子発現プロファイルを捕捉するために、ステップ3.4で述べたように、培養物からLESΦ2リソゲンサンプルを90分間にわたって導入前および誘導後に回収しました。この 90 分間の時点は、常在菌の高レベルの自発的誘導がステップ 2.3.2 のプラーク アッセイによって検出されるかなり前の時点です。初期の指数関数的増殖では細菌細胞密度が低かったため、遺伝子発現研究のための十分な材料を確保するために、培養量を800 mLにスケールアップしました。サンプルは、10分ごとに非誘導培養および誘導培養から収集され、RNAを抽出して、細菌増殖中の溶解および溶解性複製の主要なマーカーの発現プロファイルをマッピングしました。 16S rRNA遺伝子を標的とするqPCRアッセイを用いて、トータルRNAを精製し、ゲノムDNAが存在しないことを検証しました(ステップ6.1)。RIN ≥ 9に到達したサンプルは品質管理に合格し、cDNAに変換されました。
アノテーションされたLESΦ2ゲノムを調べて、温帯ファージの溶解原性および溶解性複製サイクルでよく知られているプレーヤーである遺伝子を特定しました。次に、これらの同定された遺伝子を使用して、誘導培養および非誘導培養からの溶解原サイクル制限遺伝子および溶解サイクル関連遺伝子の発現プロファイリングのためのqRT-PCRを検証しました。DNAコピーの絶対数を定量化し、R36を用いてWilcoxon符号ランク試験を実施して、非誘導培養と誘導培養の発現レベルを比較しました(図5)。cro遺伝子(溶解性複製の初期マーカー)の発現が、誘導されていない培養では~2.31 x 109コピーから、誘導後30分で~3.02 x 1011コピー(Wilcoxon符号ランク検定:p < 0.01)に顕著に増加しました。同様に、溶解性複製の中間段階マーカーである(ファージゲノム複製に関与すると予測されている)Oタンパク質とPタンパク質も、~1.74 x 108から~1.25 x 10 10コピー(Wilcoxon符号ランク検定:p < 0.01)および~6.05 x 102から~5.68 x10 5コピー(Wilcoxon符号ランク検定: p < 0.01)をそれぞれ参照してください。最後に、尾部に関連する構造遺伝子を溶解性複製サイクルの後期マーカーとして使用しました。ここでも、誘導されていない培養では~2.31 x 106コピーから、誘導後30分で~4.38 x 108コピーに発現が有意に増加しました(Wilcoxon符号順位検定:p < 0.01)。このように、定量的なRT-PCRデータにより、溶解性複製のための確立されたマーカー遺伝子の遺伝子発現は、予測された順序で多倍の差異的発現を示すなど、予想された傾向に従うことが確認されました(図5)。溶解性複製のマーカーの発現は回復後30分でアップレギュレーションされたため、これは溶解サイクル中の活性温帯ファージとその細菌宿主のトランスクリプトームランドスケープを研究するための適切な代表的な時点であると考えられています。
非誘導条件下で溶解性遺伝子の発現を観察し、初期の対数期にCFUと放出されたPFUの比率が最も高い最適化された培養でも、何らかの自発的誘導が常に起こることを確認しました。これは、トランスクリプトミクスデータには常にある程度の「ノイズ」が存在することを意味し、誘導培養と非誘導培養を含む、慎重に準備されたコントロールの重要性を裏付けています。発現の倍数変化を決定するための内部対照遺伝子の適切な選択は、トランスクリプトミクスデータを注意深く調べて、非誘導サンプルと誘導サンプルの両方で同じレベルで発現している遺伝子を特定することに依存しています。我々の予備的な結果は、rpoDが試験された最も信頼性の高いコントロール遺伝子であり、最も安定した発現を有することを示唆している(誘導前~1.71 x 10 5コピー、誘導後30分で~3.33 x 105コピー;Wilcoxonの符号順位検定:p = 0.3594)を16S rRNAまたはproC遺伝子と比較しました(図5)。内部統制の発現のばらつきは、転写産物の絶対数の測定につながりました。トランスクリプトミクスデータの今後の調査は、さらなる検証のための適切な内部統制の選択をサポートします。
cI遺伝子は、ライソジェニーのマーカーとしてよく知られているため、遺伝子プロファイリングの演習で使用されました。溶解性複製のマーカーと比較して、cI遺伝子の発現は比較的安定していましたが(図5)、この遺伝子のコピー数は、溶解性複製のマーカーと比較して、非誘導培養で安心できるほど高かった。これらのデータは、同じサンプル中のPFU値の低さと一致しており、リプレッサーの発現が高いほどファージ産生のレベルが低いことが確認されています。ここで報告されたデータは、Stxファージに見られるように、この特定のファージのcI転写産物の発現が誘導後に有意にダウンレギュレーションされていないことを示しています11,17。リプレッサー活性は通常、転写レベルと翻訳後レベルの両方で制御されているため、リプレッサー遺伝子は転写できますが、結果として得られるタンパク質はすぐに自己切断されます。転写および翻訳後コントロールを検証するには、さらなる実験が必要です。さらに、検量線から、qPCRの最小検出限界は~102コピーであるように思われます。
プラークアッセイとqRT-PCRアッセイから得られた知見は、RNA-Seq実験のための適切に制御されたインプットを生成するための培養およびRNAサンプル調製に関する当社の戦略を実証するものです。初期の指数関数的段階の非誘導培養物は、自発的誘導および溶解性遺伝子発現のレベルが低く、溶解性が優勢であることを示唆しています。対照的に、誘導後30分で単離された培養物では、溶解性複製の優性を示すマーカー遺伝子の発現が有意に増加しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig01.jpg"> 図1:リファンピシン耐性インジケーターホストを作成するためのプロトコル(BioRender.com で作成)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig02.jpg"> 図2:同じサンプルからリゾゲンのPFUとCFUを列挙するための実験計画。 (BioRender.com で作成)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig03.jpg"> 図3:RNA単離のための誘導培養と非誘導培養のサンプリングの実験計画。 (BioRender.com で作成) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig04.jpg"> 図4:自発的帰納の時間的列挙。PAO1 Φ2 リゾゲンからの PFU と同時 CFU、n = 8 (2 つの生物学的複製と 4 つの技術的複製);誤差範囲は標準偏差を表します。暗赤色の点は、LBのCFU・mL−1 を示します。濃い青色の点はLBのPFU・mL−1 を示す。ライソゲンによるφ2感染性ファージの自然放出は、接種後2時間で測定可能な最低レベルです。. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig05.jpg"> 図5:標的マーカー遺伝子の絶対コピー数。ファージマーカー遺伝子の絶対コピー数は、RT-qPCRを用いて、溶解および溶解サイクルにおいて重要な役割を果たすと予想される遺伝子の予測発現パターンを裏付けています。ドットは、3 つの生物学的反復と 3 つの技術的反復の両方を表します (n = 9)。(ア)赤いボックスは、リソジェニーマーカーcIを表します。(B)緑色は、初期の溶解マーカーであるcroを表す。(C、D)青は中間溶解性マーカー、DNA複製遺伝子を表す。(e)マゼンタは、後期溶解マーカー、尾部構造遺伝子を表す;(F–H)灰色は内部コントロールとして用いた宿主マーカー、(I)白色は誘導コントロール用としたDNAジャイレースB。横実線は分布の中央値を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:この研究で設計されたプライマー。 本研究で用いたマーカー遺伝子および内部コントロールの特異的プライマーの配列を、対応するNCBIアクセッションIDとともに提供します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:この研究で使用したプライマーの効率は、qPCR標準曲線を使用して計算されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルにより、宿主に対するプロファージの影響を明らかにすることができます。細菌培養は、溶解原性状態を最もよくサポートする条件を使用して同期され、自発的な誘導が制限されます。RT-qPCRは、増殖抑制遺伝子およびファージ制御から切り離された遺伝子を、溶解性複製サイクル中に発現する遺伝子と明確に区別します。

Temperate phages are found integrated as prophages in the majority of bacterial genomes. Some prophages are cryptic and fixed in the bacterial chromosome, ...

プロファージは細菌のファージであり、細菌のゲノムに組み込まれています。私たちは、トランスクリプトーム的アプローチを用いて、プロファージが宿主細菌の生物学に及ぼす影響を包括的に研究しています。ここで説明する方法は、プロファージ溶解サイクルの自発的誘導という重要な課題に対処します。培養条件を慎重に最適化することで、増殖状態における遺伝子発現のクリーンなプロファイリングが可能になります。プロファージはほとんどの細菌性病原体に見られますが、その重要性は通常理解されていません。これらのツールは、複数の細菌機能の調節因子としてのプロファージの役割を明らかにすることができます。研究されていないプロファージホストの関係はほぼ無限にあります。これは、これらのプロトコルが予測に役立つ潜在的な治療標的の巨大な未開発のリソースを表しています。主な課題は、リゾゲンの増殖と自発的な増殖誘導のバランスをとるための適切な培養条件を見つけることです。よく知られている二次的な課題であるライソンは、ダウンストリーム研究のためにRNAの完全性を維持します。まず、100ミリリットルのLBを1対100の比率で一晩培養して、新鮮なライソゲンおよび指標宿主培養をセットアップします。摂氏37度でインキュベートし、180RPMで振とうします。リゾゲンの増殖を監視するには、接種時点から8時間、1時間ごとに1ミリリットルのサンプルを収集します。連続的に、900マイクロリットルのLV培地に100マイクロリットルを加えて培養を希釈します。最高速度でボルテックスし、10からマイナス1、10からマイナス9まで希釈系列を続けます。必要な希釈液の10マイクロリットルをLBオーガープレートにスポットします。乾燥させ、摂氏30度で18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、コロニーの数を数え、与えられた式を使用して生菌細胞の数を計算します。次に、側頭サンプル中の感染性ファージ粒子を列挙するために、100マイクロリットルの対数相リファンピシン耐性インジケーター宿主細胞をリファンピシンとともに溶融オーガーに加えます。段階希釈したライソゲン培養液10マイクロリットルを、接種したトップオーガー層にスポットします。乾燥させ、摂氏37度で18〜24時間インキュベートする。インキュベーション後、プラークの数を数え、与えられた式を使用して感染性ファージ粒子を計算します。最初のフラスコに非誘導のラベルを付け、他のフラスコに誘導のラベルを付け、各サンプルを回収する時点を記載します。次に、8つの250ミリリットルフラスコで1対100の比率で80ミリリットルのLBで一晩培養したライソジェニック培養物を継代培養します。フラスコを摂氏37度でインキュベートし、180RPMで振とうします。90分後、600ナノメートルでの光学濃度が0.1〜0.2の場合、4マイクロリットルの1%氷酢酸を非誘導フラスコに加えます。非誘導フラスコから80ミリリットルの培養液を720ミリリットルのLBに加え、すぐに160ミリリットルの停止溶液を加えてから、フラスコを氷上に30分間置いてRNA転写産物を安定化させます。次に、ノルフロキサシンを1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度で、80ミリリットルの培養物を含む誘導標識フラスコに添加する。よく混合し、180RPMで1時間振とうしながら摂氏37度でインキュベートします。720ミリリットルのLBに80ミリリットルの誘導培養を加えて、細胞を回復させます。停止溶液を添加して、ゼロから1時間まで10分ごとに各フラスコから細菌細胞を収穫します。摂氏4度で15分間10, 000 Gで遠心分離し、上清を廃棄します。調整可能な自動ピペットを使用して、ペレットを残留液に静かに再懸濁する前に。懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、13, 000Gで4°Cで1分間遠心分離します。残った上清を廃棄し、マイクロチューブを密封してから、ペレットを液体窒素に瞬間凍結します。各凍結ペレットに1ミリリットルのトリゾールを加え、ピペッティングで懸濁液を均質化します。目的のファージの複製の各段階のマーカーとして作用し得る一組の標的遺伝子を同定した後、関連するプライマーを用いてゲノムDNAから標的遺伝子のそれぞれを増幅する。本文原稿に記載の増幅条件を用いてPCRを行う。PCR後、PCR精製キットを使用して各アンプリコンを精製し、メーカーの指示に従ってTAクローニングベクターでクローニングします。サンガーシーケンシングにより、各クローニング産物の配列を確認します。4つの個別のプラスミドのコピー数を計算した後、プラスミドDNAをヌクレアーゼフリー水で段階希釈することにより、各マーカー遺伝子の標準テンプレートを調製します。1マイクロリットルのCDNAとそれぞれのプラスミド標準試料を、96ウェルプレートの各ターゲットに添加します。そして、メーカーの指示に従って定量PCRを行います。PCR後、Excelプログラムを使用して、ログDNAコピー数とサイクルしきい値をプロットします。線形回帰計算を実行して、決定係数と線形方程式を表示します。次に、線形回帰から導出された線形方程式を使用して、各ターゲットのコピー数を推定します。次に、検量線の線形回帰と所定の式からのパラメータを使用して、PCR増幅の有効性を計算します。プライマーの効率をパーセントで検証した後、DNAの絶対コピー数を計算します。自発的なプロファージ産生の少なさを時間的に列挙したところ、2時間後には細胞当たりのPFU数が最も低く、6時間後には細胞当たりのPFU数が最も高かった。その後、リゾジェンは2時間で最も安定していました。したがって、この条件はQRTPCRプロファイリングに使用されました。溶解性複製の初期マーカーであるcro遺伝子の発現が、非誘導培養では10倍から9コピー目まで、誘導後30分後には10倍から11コピー目まで3.02倍に顕著に増加した。同様に、溶解複製の中期マーカーであるPタンパク質とOタンパク質も、10コピー目が1.74倍から8枚目、10枚目が1.25倍、10枚目が10倍6.05倍、5枚目が10倍5枚目まで、それぞれ有意なアップレギュレーションを示しました。溶解性複製サイクルの後期マーカーは、誘導後30分まで非誘導培養での発現の有意な増加を示しました。試験した内部コントロールの中で、RPODは16のSRNAまたはProC遺伝子と比較して最も安定した発現を示しました。溶解性複製のマーカーと比較して、C-one遺伝子の発現は比較的安定していました。それでも、C-one遺伝子のコピー数は、溶解性複製のマーカーと比較して、非誘導培養で安心できるほど高かった。準備が不十分なRNAライブラリーからは、良いデータや解釈は得られません。自発的誘導とRNAの完全性を制御することが最も重要なことです。あらゆる遺伝子の時間的動態は、発現プロファイリングを用いて研究することができます。適切な実験条件と時間ポイントを調整することは、あらゆる刺激に対する生物学的応答を正しくマッピングするために重要です。この手法により、2つの異なるプロファージホストパートナーシップ間のこれまで知られていなかった相互作用が特定されました。ほとんどの細菌は未研究のプロファージを収容しているため、このアプローチは多くの新しい治療標的や用途の発見に役立つ可能性があります。

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Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

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