Name: 遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ遺伝子組換えPlasmodium bergheiスポロゾイトの生成法。マラリア原虫の肝臓感染メカニズム解明とワクチン開発に貢献する標準化された実験プロトコルを詳細に解説します。

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この研究は、SPKにAI168307された国立衛生研究所の助成金によって支援されました。 UGA CTEGD Flow Cytometry Core と UGA CTEGD Microscopy Core に感謝します。また、プロトコルの最適化におけるAsh Pathak氏、Anne Elliot氏、UGA Sporocoreのスタッフの貢献にも感謝します。貴重な洞察、議論、そしてGFP11およびGFP1-10を含む親プラスミドについて、神山大地博士に感謝します。また、Kurupラボの方々のご支援、忍耐、励ましに心より感謝申し上げます。

私たちの研究室における脊椎動物に関するすべての研究は、ジョージア大学の動物使用ガイドラインとプロトコルに準拠して実施されました。
1. P. berghei に感染したマウスの作製
<ol><li>野生型 P. berghei 寄生虫を使用して、雄または雌の 6-8 週齢の C57BL/6 (B6) マウスで血液段階の感染を開始します。これを行うには、凍結保存された P.berghei感染血液(2 x 105 感染RBC)を、400 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再構成し、1匹または2匹のドナーマウスに腹腔内(i.p.)に移植します。</li>
	<li>感染後5日目のドナーマウス(d.p.i.)から眼窩後出血によって採取した新鮮な血液を、2匹のナイーブB6マウスに移植する。これを行うには、200 μLの血液を採取し、300 μLのPBSで再構成し、200 μLのi.p.をレシピエントマウスに注入します。この時点でのドナーの寄生虫血症が2%〜5%であることを確認してください19,20。</li>
	<li>以前に説明したように寄生虫血症を監視します19,20、レシピエントの2d.p.i.から開始します。寄生虫血症が3%〜5%(約5 d.p.i.)の範囲の場合、レシピエントマウスを安楽死させ、心臓穿刺または眼窩後出血によって採血します。二酸化炭素を吸入した後、子宮頸部脱臼を行うか、施設のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 注:寄生虫血症が5%を超えると、多重感染した赤血球の有病率の増加により、トランスフェクション効率が低下する可能性があります。</li>
</ol>2.文化におけるシゾントの生成
<ol><li>ステップ1.3で感染したマウスから血液を採取し(2匹のマウスから合計約2 mL)、無菌環境で5 mLのAlsever溶液( 材料表を参照)に入れます。ステップ2.1から3.12を無菌条件下で実行します。 注:無菌状態には、手袋の着用、手袋と表面を70%エタノールで拭くこと、滅菌された消耗品と材料の使用、バイオセーフティキャビネット内での作業が含まれます。</li>
	<li>室温(RT)で450 x g で8分間血液を遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10 mLの完全なRPMI培地(20%ウシ胎児血清[FBS]および1%ペニシリン-ストレプトマイシン、v/vを含むRPMI 1640)に再懸濁します。</li>
	<li>室温で450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを25 mLの完全なRPMI培地に再懸濁し、フィルターキャップ付きのT75培養フラスコに移します。</li>
	<li>36.5°C、5%CO2のインキュベーターに入れ、静かに振とうしながら細胞を16時間懸濁液に保ちます。</li>
	<li>16時間の時点で、統合失調症の発生を確認します。これを行うには、500 μLのサンプルを採取し、450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを10 μLの完全なRPMI培地に再懸濁し、薄い血液塗抹標本を調製します。血液塗抹標本をギムザ染色19 ( 材料表を参照)で染色し、シゾントの頻度を決定します(図1)。</li>
	<li>最適なトランスフェクション効率を得るには、寄生虫の60%〜70%がシゾント段階にある必要があります。この閾値を下回ると判断された場合は、ステップ2.4と同様に培養を続行し、1時間ごとに上記の閾値を超えていることを確認してから続行します。</li>
</ol>3. Plasmodium schizontsのトランスフェクション
<ol><li>13 mL の密度グラジエントストック培地( 材料表を参照)を 1.44 mL の 1.5 M NaCl および 5.6 mL の 0.15 M NaCl と 50 mL の遠心分離チューブに再溶解して、グラジエント遠心分離バッファーを調製します。</li>
	<li>25 mLの血液培養液を新しい50 mLの遠心分離チューブに移します。20 mL のグラジエント遠心分離バッファーを、細いガラスピペットを使用して遠心分離チューブの底部に慎重に層状にし、グラジエントカラムを作成します。液体の層や界面を乱さないように注意し、バッファーと培地を明確に分離してください。</li>
	<li>450 x g で20分間遠心分離し、室温でブレーキをかけずに分離します。 パスツールピペットを使用して、培地とグラジエント遠心分離バッファーの界面にあるシゾント層15 を慎重に除去し、新しい50 mL遠心分離チューブに入れます。</li>
	<li>単離したシゾントを完全なRPMI培地に再懸濁し、総容量を40 mLにします。室温で 450 x g で 8 分間遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>シゾントを10 mLの完全RPMI培地に再懸濁します。次に、トランスフェクションごとにこの溶液1 mLを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、16,000 x g で5秒間遠心分離して、感染した赤血球をペレット化します。上記の方法で2匹のマウスに由来する感染した赤血球は、最大10回の別々のトランスフェクションに使用できます。</li>
	<li>100 μL のエレクトロポレーションバッファー(エレクトロポレーションキットのヌクレオフェクター溶液、 材料表を参照)を 5 μg の環状または直鎖化ターゲットプラスミド DNA(最大容量 10 μL)と室温で混合し、トランスフェクションごとに別々の 1.5 mL 微量遠心チューブに入れます。「プラスミドなし」のサンプルは、トランスフェクションおよび抗生物質選択のコントロールとして含める必要があります。</li>
	<li>ステップ3.5から遠心分離後に上清を除去し、調製したヌクレオフェクター溶液+プラスミドDNAに感染した赤血球を慎重に再懸濁します(ステップ3.6から)。</li>
	<li>懸濁液(ヌクレオフェクター溶液+プラスミド+シゾント、最大110 μL)をエレクトロポレーションキュベットに移します。適切な核酸プログラム(U-033、材料表を参照)を使用してトランスフェクションします。 メモ: 手順 3.8 から 3.10 が RT で実行されていることを確認します。</li>
	<li>100 μLの完全RPMI培地をキュベットに加え、溶液全体(総容量200 μL)を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、室温で保持します。</li>
	<li>トランスフェクションした寄生虫の200 μL溶液をマウスに静脈内注射し(i.v.)、トランスフェクションからマウスへの最終注射までの時間を最小化します。 注:トランスフェクションされたシゾントは、エレクトロポレーション後5分以内にマウスに注入され、プロトコルの効率が最大化されます。</li>
</ol>4. トランスフェクションされた寄生虫の選別
<ol><li>トランスフェクションしたシゾントを毎日2d.p.i.から接種したマウスの寄生虫血症レベルをチェックし、感染を確認します。</li>
	<li>感染が確認されたら、飲料水への薬物の経口投与を使用して薬物の選択を開始し、 アドリビタムで提供されます。 注:ピリメタミンは、プラスミドの選択可能な薬物マーカーとして採用されました。この場合、250 mLの浄水(最終濃度70 mg/L)に17.5 mgのピリメタミンを添加しました。さらに、この水に10gの砂糖を加えて、マウスによるピリメタミン含有水の適切な消費を促しました。</li>
	<li>ピリメタミン治療開始から6日後から、5μlの血液で作られた血液塗抹標本を使用して、2日ごとに寄生虫血症を監視します。.15日後に検出可能な寄生虫がない場合は、トランスフェクションの失敗を示します。この場合、手順 1.1 からプロセスを再開して、もう一度やり直してください。</li>
	<li>寄生虫血症が少なくとも1%に達したら、寄生虫をナイーブB6マウスに移し、血液期の寄生虫ストックを作成します。寄生虫血症が2%〜5%に達するまで、新たに感染したマウスで選択を続け、その時点でストックを生成して凍結保存します21。</li>
</ol>5. トランスジェニック株による蚊の感染
<ol><li>選択した寄生虫を含む血液200 μLをB6マウスに感染させます(2 x 105 感染したRBC/マウス、静脈内)。蚊の摂食と感染の日にこれらのマウスの寄生虫症を決定します。2%〜5%の寄生虫血症は、蚊の感染に最適です。確認したら、手順5.2〜5.4に従って、すぐにメスのハ マダラカ に感染を移します。 注意: 感染用の蚊を含むインキュベーターは、20.5°C、湿度80%、および12時間の明暗サイクル(午前7:00から午後07:00の間に点灯)に維持する必要があります。</li>
	<li>蚊に感染する前日に、37°Cに加熱した水で満たされた薄いプラスチック製の蚢や手袋など、雄と雌の両方の蚊が入ったケージの上に熱源を置いて、雌の蚊を分離します。 熱源に引き寄せられた雌の蚊を、昆虫吸引器で取り除き、別の小さなケージに移して感染させます。 注:オスの蚊は、体のサイズがわずかに小さく、羽毛の触角によってメスの蚊と区別できます。</li>
	<li>感染したマウスに全身麻酔薬(例:.、2%トリブロモエタノール/アベルチン)を注射する。各マウスのフットパッドをしっかりとつまんで、完全な麻酔を確保します。それらが反応しない場合、それらは十分に鎮静され、感染を蚊に移す準備ができています。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスを、胸骨横臥位下でケージに入れた雌の蚊の上(ステップ5.2から)に置きます。前脚と後脚を手動で広げて、蚊の餌付けに最大の表面積を提供します。感染したマウスを各ケージに合計15分間放置し、5分ごとにマウスが目覚めていないことを確認します。給餌が完了したら、子宮頸管脱臼を使用して、または施設の動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、安全に処分します。</li>
</ol>6.スポロゾイトの収集
<ol><li>約10 d.p.i.で蚊の中腸にオーシストがないかチェックし、蚊の感染と蚊内での マラリア原虫 の発生が成功することを確認します。鉗子を使用して腹部末端部分を除去することにより、腹部から蚊の中腸を分離します。偏光下で中腸を可視化し、オーシストの存在を確認します22.</li>
	<li>野生型のスポロゾイトは、感染したマウスを食べてから18〜21日後に蚊の唾液腺に存在すると予想されます。18日目に、5〜10匹の蚊を解剖して、スポロゾイトの数を評価します。 注:蚊はエタノールで洗浄して殺します。その後、死んだ蚊をPBSで2回洗浄し、解剖前に破片を取り除きます。</li>
	<li>胞子嚢を分離して数えるには、鉗子または細い解剖針を使用して蚊の胸部に圧力をかけながら、蚊の頭を慎重に取り除きます。唾液腺は、切除した頭部に付着したままです(図2)。</li>
	<li>唾液腺から追加の蚊の残骸を取り除き、400 μLの蚊解剖培地(1%マウス血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの改変Ealge培地[DMEM]; 材料表を参照)を含む微量遠心チューブに入れます。</li>
	<li>30Gの針付きシリンジを15〜20回通過させることにより、孤立した唾液腺を破壊します。.破壊された唾液腺10 μLを蚊の解剖培地に入れ、血球計算盤に入れてカウントします。マウスへの注射、細胞培養への接種、または長期凍結保存のために、所望の濃度の蚊解剖培地またはPBSに再懸濁します23,24。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

私たちの研究室では、上記のプロトコルを使用して、トランスジェニック P.berghei 寄生虫の数系統を作成しました。 P. bergheiに最適化されていますが、このプロトコルを使用してトランスジェニックな P. yoelii sporozoitesを生成することにも成功しています。トランスフェクションしたシゾントをマウスに注入した後、寄生虫は通常、プラスミドなし対照を含むすべてのグループで遅くとも3d.p.i.以内に検出可能です。選択は、エレクトロポレーション後の寄生虫の生存率を確保するために、寄生虫血症が検出された場合にのみ開始されます。さらに、薬物選択の準備をする際には、ピリメタミンを完全に溶解させるために、塩酸で水を酸性化し、pHを4に下げる必要がある場合があります。プラスミドなし対照群からの寄生虫の完全な除去を期待していますが、トランスフェクタントを接種したマウスは感染したままです。対照マウスにおけるクリアランスは、典型的には、ピリメタミン処理の開始後5〜8日で起こる。注目すべきは、 P. berghei に感染したB6マウスは、実験的脳マラリアの徴候を...

マラリアの予防と治療に関する医薬品開発と研究が進歩しているにもかかわらず、マラリアの世界的な疾病負担は依然として高いままです。毎年50万人以上がマラリアで死亡しており、サハラ以南のアフリカなどのマラリア蔓延地域に住む子どもたちの死亡率が最も高い1。マラリアは、寄生虫マラリア原虫によって引き起こされ、唾液腺に寄生虫を宿している雌のハマダラカに刺されることで人間に感染します。マラリア原虫の感染段階であるスポロゾイトは、血食中に脊椎動物の宿主の皮膚に沈着し、血流に乗って肝細胞に感染し、赤血球に感染する前に必須の発達(赤血球性マラリア前症を構成する)を受けます。赤血球の感染はマラリアの血期を開始し、この疾患に関連する罹患率と死亡率のすべてに関与しています2,3。
マラリア原虫の前赤血球発生の義務的な性質は、予防的ワクチンおよび医薬品開発の取り組みの魅力的な標的となっています4。前赤血球性マラリアの生物学を研究し、肝臓段階を標的とするワクチンや薬を開発するための前提条件は、マラリア原虫スポロゾイトへのアクセスです。さらに、遺伝子組み換えマラリア原虫スポロゾイトを生成する私たちの能力は、そのような研究努力の成功に役立っています5,6,7,8,9。蛍光または発光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックマラリア原虫株は、in vivoおよびin vitroでその発生を追跡することを可能にしました10,11。マラリア原虫の複数の遺伝子の欠失によって生成される遺伝的弱毒化寄生虫(GAP)も、最も有望なワクチン候補の一部です12,13。
げっ歯類と非ヒト霊長類のマラリアモデルは、マラリア原虫種間の生物学とライフサイクルの類似性により、ヒトマラリアにおける宿主と寄生虫の相互作用のメカニズムを理解するのに役立っています14。げっ歯類には感染するがヒトには感染しないマラリア原虫種(例:P. berghei)の使用により、寄生虫のライフサイクル全体を維持し、肝臓期マラリアをバイオセーフティレベル1で研究するための感染性スポロゾイトの生成が可能になります。トランスジェニック血液段階のマラリア原虫の生成15、蚊の感染16、およびスポロゾイト17の単離については、すでにさまざまな個別のプロトコルが存在する。ここでは、新規トランスジェニック株PbGFP11を例に、トランスジェニックP.bergheiスポロゾイトを生成および分離するために、これらの方法論を組み合わせた包括的なプロトコルの概要を説明します。PbGFP 11は、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(GFP)の1 β 1本鎖であるGFP11を、宿主肝細胞で生成された寄生胞胞(PV)に輸送します。PbGFP 11は、細胞質(Hepa GFP 1-10細胞)においてGFP 1-10フラグメント(GFP 1-10)を構成する残基を発現するトランスジェニック肝細胞(Hepa1-6バックグラウンド)と組み合わせて使用されます。 PbGFP11は、機能的GFPおよび緑色蛍光シグナルの自己相補および再形成による宿主肝細胞におけるPV溶解を報告する18。注目すべきは、GFP11は、PbGFP11において一連の7つのタンデム配列としてコードされ、結果として生じる蛍光シグナルを増強することである。PbGFP11 スポロゾイトを細胞質色素CellTrace Violet(CTV)で染色すると、寄生虫を追跡することができます。このようなCTV染色された細胞内寄生虫の溶解自体が、CTVの宿主細胞質への漏出と宿主細胞の染色をもたらす。このシステムは、宿主肝細胞におけるマラリア原虫PVおよび/または寄生虫の溶解を視覚化および区別することに加えて、そのような経路の分子成分の遺伝的または治療的摂動を通じて、これらのプロセスのいずれかに関与する免疫経路を研究するために確実に使用できます。

<table><tbody><tr><td>30 G x 1/2 インチ シリンジ針</td><td>エクセル インターナショナル</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>アルセバーのソリューション</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>アマクサ ベーシック パラサイト ヌクレオフェクター キット 2</td><td>ロンザ</td><td>VMI-1021</td><td></td></tr><tr><td>アバーチン (2,2,2-トリブロモエタノール)</td> <td>TCI アメリカ</td><td>T1420</td><td></td></tr><tr><td>採血チューブ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>365967</td><td>血清採取用</td></tr><tr><td>Cチップディスポーザブル血球計算装置</td><td>INCYTO</td><td>DHC-N01-5</td><td></td></tr><tr><td>CellVeiw 細胞培養ディッシュ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5425</td><td>エッペンドルフ</td><td>5405000107</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5910R</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>5910R</td><td>グラジエント遠心分離用</td></tr><tr><td>デルタビジョンII - 倒立顕微鏡システム</td><td>オリンパス</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Σ</td><td>D5879-500ml</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GenClone</td><td>25-525</td><td></td></tr><tr><td>GFP11 プラスミド</td><td>Kurup Lab</td><td>pSKspGFP11</td><td>PL0017 プラスミド</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>48900-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hepa GFP1-10 細胞</td><td>Kurup Lab</td><td>Hepa GFP1-10</td><td>Hepa 1-6 細胞 (ATCC Cat#CRL-1830)</td></tr><tr><td>マウス血清</td><td></td><td></td><td>蚊の解剖媒体に使用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SX0420-5</td><td>1.5 M および 0.15 M パーコール溶液用</td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td><td></td>RBC エレクトロポレーション パスツールピペット VWR 14673-043 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldritch に使用されるプログラム U-033</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Density gradient stock medium)</td><td>Cytivia</td><td>17-0891-02</td><td>プロトコルの詳細</td></tr><tr><td>PL0017 Plasmid</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-786</td><td></td></tr><tr><td>ピリメタミン (経口投与用)</td><td>Sigma</td><td>46706</td><td>準備の詳細: 17.5 mg のピリメタミンを 2.5 mL の DMSO に加えます。ボルテックス、必要に応じて完全に溶解します。HCLを使用して、225 mLのdH2OのpHを4に調整します。DMSO中のピリメタミンを水に加え、250mLにします。砂糖を10g加えて、薬物を飲んだ水の定期的な消費を促します。ピリメタミンは光に敏感です。マウスを治療するときは、暗いボトルまたはアルミホイルで覆われたボトルを使用してください。</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SoftWoRx顕微鏡ソフトウェア</td><td>Applied Precision</td><td>v6.1.3</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

マラリアは寄生虫マラリア原虫によって引き起こされる致命的な病気で、メスのハマダラカに刺されることで感染します。脊椎動物の宿主の皮膚に蚊によって沈着したマラリア原虫のスポロゾイト段階は、臨床的マラリアを開始する前に肝臓で強制的な発達段階を経ます。肝臓でのマラリア原虫の発生の生物学についてはほとんどわかっていません。スポロゾイト段階へのアクセスと、そのようなスポロゾイトを遺伝子組み換えする能力は、マラリア原虫感染の性質とその結果生じる肝臓の免疫応答を研究するための重要なツールです。ここでは、トランスジェニックPlasmodium berghei sporozoitesを生成するための包括的なプロトコルを紹介します。私たちは、血液期のP. bergheiを遺伝子改変し、この形態を利用して、ハマダラカが血食を摂取すると感染します。トランスジェニック寄生虫が蚊の中で発生した後、蚊の唾液腺から寄生虫のスポロゾイト段階を単離し、in vivoおよびin vitro実験を行います。我々は、緑色蛍光タンパク質(GFP)サブユニット11(GFP11)を発現するP. bergheiの新規株のスポロゾイトを生成することにより、プロトコルの妥当性を実証し、肝臓期マラリアの生物学を調査するためにどのように使用できるかを示します。

シゾントの頻度と発生を決定することは、十分な生存可能な寄生虫がトランスフェクションに最適な段階にあることを保証するために重要です。未熟なシゾントは、赤血球の細胞内空間全体を埋めないメロゾイトが少ないことで、完全に成熟したシゾントと区別できます(図1B)。培養血液から血液塗抹標本を作成する場合、感染した赤血球が破裂し、血液塗抹標本中に遊離細胞外メロゾイトが観察される可能性があることに注意することが重要です(図1)。このようなメロゾイトは、ステップ2.5のシゾントの頻度の評価にはカウントされません。
蚊から唾液腺を除去することは、ユーザーが蚊の生理学や小規模な解剖に慣れていない場合、困難な場合があります。唾液腺を蚊から分離する際には、唾液腺の半透明を利用して、不透明な蚊の残骸と区別できることに注意してください(図2)。腺を破壊した後のスポロゾイトの計数は、400倍の倍率で最も効率的であり、位相差の使用により、...

マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫 のスポロゾイトを生成するための合理化された方法論について説明します。

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

現在、肝臓のマラリア原虫感染の生物学の理解は限られています。このプロトコルは、生物の生物学に関するいくつかの重要な質問に答えるのに役立った多くのトランスジェニック系統を生成するのに役立ちました。マラリアの感染と闘うための新しいツールとアプローチを開発するには、寄生虫とその生物学の基本的な理解が必要です。ここで説明しているトランスジェネシスの方法は、生物と宿主のいくつかの重要で複雑な生物学を解読するのに役立ちました。この手順を実演するのは、私の研究室長であるカーソン・バウワーズです。P.Bergeheiに感染したマウスを作製し、安楽死させた後、無菌環境で2匹の感染マウスから2ミリリットルの血液を採取し、5ミリリットルのエルゼビア溶液に入れます。血液を450gで室温で8分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10ミリリットルの完全RPMI培地に再懸濁します。細胞懸濁液を再度遠心分離し、ペレットを25ミリリットルの完全RPMI培地に再懸濁します。細胞懸濁液をフィルターキャップ付きのT75培養フラスコに移し、穏やかに振とうしてインキュベートし、細胞を懸濁液状態に保ちます。インキュベーションの最後に、500マイクロリットルのサンプルを回収します。ペレットを遠心分離し、10マイクロリットルの完全なRPMI培地に再懸濁します。次に、薄い血液塗抹標本を準備します。血液塗抹標本をギムザ染色で染色し、統合失調症の頻度を決定します。最適なトランスフェクション効率を得るには、寄生虫の60〜70%がシゾント段階にある必要があります。50 mmリットルの遠心チューブに13 mLの密度勾配ストック培地を再溶解して、グラジエント遠心分離バッファーを調製します。25ミリリットルの血液培養液を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、20 mmリットルのグラジエント遠心分離バッファーを遠心分離チューブの底に慎重に層状にし、細いガラスピペットを使用してグラジエントカラムを作成し、バッファーと培地を明確に分離します。調製したバッファーと培地を、室温で中断することなく、450 Gで20分間遠心分離します。牧草地のピペットを使用して、培地とグラジエント遠心分離バッファーの界面にあるシゾント層を慎重に除去します。新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。単離したシゾントを完全なRPMI培地に再懸濁し、総容量を40ミリリットルに増やします。遠心分離して上清を廃棄した後、10ミリリットルの完全RPMI培地にシゾントを再懸濁します。次に、トランスフェクションごとにこの溶液1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、16、000Gで5秒間遠心分離して感染細胞をペレット化します。次に、室温で100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーと5マイクログラムのターゲットプラスミドDNAを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れて混ぜ合わせます。感染細胞を遠心分離した後、上清を除去し、調製したヌクレオエフェクト溶液とプラスミドDNAに細胞を慎重に再懸濁します。次に、懸濁液をエレクトロポレーション、キュベットに移し、適切なヌクレオフェクタープログラムを使用してトランスフェクトします。次に、100マイクロリットルの完全なRPMI培地をキュベットに加えます。溶液全体を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。接種後2日から毎日、トランスフェクションされたシゾントを接種したマウスの寄生虫血症レベルを確認します。感染が確認されたら、薬を経口投与し、水を自由に飲むことで薬の選択を開始します。ピロメチミン治療開始から6日後から始まる血液塗抹標本を使用して寄生虫血症を監視します。.寄生虫が1%以上に達したら、その寄生虫をナイーブなB6マウスに移し、血液期の寄生虫ストックを作ります。寄生虫が2%から5%に達すると、ストックを生成して凍結保存します。蚊に感染する前日には、雌雄の蚊が入ったケージの上に、37°Cに温めた水を入れた手袋を置いて、雌の蚊を分離します。昆虫吸引器を使用して、熱源に引き寄せられた雌の蚊を取り除き、感染のために小さなケージに移します。蚊の摂食と感染の日に、感染したB6マウスの寄生虫血症を決定します。2%から5%の寄生虫血症は蚊の感染に最適です。寄生虫を確認した後、胸骨横臥位下でケージに入れた雌の蚊に麻酔マウスを置き、雌の蚊に感染を移します。前脚と後脚を手動で広げて、蚊の餌付けに最大の表面積を提供します。感染したマウスを各ケージに15分間放置し、5分ごとにマウスが目を覚ましていないことを確認します。給餌が完了し、マウスが安楽死したら、施設のガイドラインに従って安全に処分します。蚊への感染が成功したことを確認するには、感染後10日後に鉗子で腹末端部分を切除し、蚊の中腸を分離します。次に、偏光の下で中腸を観察して、オーシストの存在を検出します。感染後18日目に、5〜10匹の蚊を解剖して、存在するスポロゾイトの数を評価します。胞子嚢を分離して数えるには、鉗子または細かい解剖針で胸部に圧力をかけながら、蚊の頭を慎重に取り除きます。唾液腺は、切除された頭部に付着したままになります。次に、唾液腺から追加の蚊の破片を取り除き、400マイクロリットルの蚊解剖培地を含むマイクロ遠心チューブに入れます。次に、分離された唾液腺を30ゲージの針シリンジに15〜20回通して破壊し、その後、破壊された唾液腺の10マイクロリットルを蚊の解剖培地に血球計算盤に入れてカウントします。最後に、マウスへの注射または長期凍結保存のために、唾液腺を所望の濃度の蚊解剖培地またはPBSに再懸濁します。顕微鏡のように、寄生マウスの血液培養における成熟したP.berghei schizontと未成熟なP.berghei schizontを描写した画像が提示されます。解剖中に唾液腺が無傷のままの蚊の頭の顕微鏡画像のように、解剖された唾液腺を低倍率と高倍率で表示します。PB、GFP 11に感染したHEPA GFP 1〜10個の宿主細胞における緑色蛍光シグナルの生成は、寄生胞胞の溶解を示した。グラジエント界面を乱すことなく、チェイソン層を慎重に除去することが重要です。また、胞子の光の分離中に頭部と一緒に唾液腺を確実に除去するには、少し練習が必要です。単離後、トランスジェニックスポロゾイトは凍結保存するか、in vivoまたはin vitro感染研究に新鮮に使用することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ハマダラカ蚊は、インドやアジア各地に生息するマラリアのためのベクトルです。このビデオでは、蚊にマラリアに抵抗性を付与される導入遺伝子でこの種のmicroinjectionsを実行するためのテクニックを示しています。このビデオで示されて方法論の多くは、他の蚊の種のマイクロインジェクション技術に適用可能である。...

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。...

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

このビデオでは、蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドDNAをニワトリEimeria寄生虫のスポロゾイト型に送達するエレクトロポレーションベースのトランスフェクション手順であるヌクレオフェクションについて説明します。...

寄生虫形態のヌクレオフェクション:蛍光タンパク質コードプラスミドをスポロゾイト核に送達するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法

このビデオでは、脳マラリアの実験的なマウスモデルの生成を示しています。Plasmodium bergheiに感染した雌の蚊から分離されたスポロゾイトは、拘束されたマウスの尾静脈に注入され、血液脳関門の破壊と脳の炎症を引き起こし、脳マラリアを引き起こします。この感染マウスモデルは、脳マラリアに関連するin...

宿主蚊由来スポロゾイトを用いた実験的脳マラリアのマウスモデル作製

このビデオは、弱毒化した生きたスポロゾイトでマウスモデルを免疫するためのアッセイを示しています。放射線が弱毒化されたマラリア原虫スポロゾイトは、マウスの耳の背側に注入されます。両耳の複数の場所に注射した後、マウスは回復します。...

マウスモデルにおける生弱毒スポロゾイトによる皮内免疫

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。...

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。...

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

GlmSを生成する手法について述べる-熱帯熱マラリア原虫CRISPR/Cas9...

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

化学遺伝学では、標的遺伝子座においてゲートキーパー残基を異なる側鎖を含むアミノ酸に置き換えることが含まれます。ここでは、 cdpk1...

植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解

マラリア原虫の性的発達は、蚊の中腸で起こります。寄生虫の性段階を標的にすることは、感染をブロックするための有望な戦略です。私たちは、受精卵形成後にナノルシフェラーゼを発現するトランスジェニックP.bergheiであるOoklucを開発し、伝達阻害化合物のハイスループットスクリーニングを可能にしました。この記事では、Ooklucを使用したスクリーニングの方法について詳しく説明します。...

Ookluc: Plasmodium berghei 系統による感染阻止化合物の同定

学ぶ遺伝子組換えPlasmodium bergheiスポロゾイトの生成法。マラリア原虫の肝臓感染メカニズム解明とワクチン開発に貢献する標準化された実験プロトコルを詳細に解説します。

遺伝子組換えマラリア原虫ベルヘイ・スポロゾイトの生成

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