Name: 機能的肝内胚葉オルガノイドの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ 内胚葉由来肝オルガノイド（eHEPO）の作製法。2週間で作製でき、1年以上の長期培養が可能で、分化能と機能性を維持します。肝臓生物学と再生医療研究に有用です。

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<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mLコニカル遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 & 度;Cウォーターバス</td><td>N&uuml;ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 & 度;C、5 % CO2 インキュベーター</td><td>メマート</td><td>インコ153</td><td></td></tr><tr><td>50 mLコニカル遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m と 40 & micro;m セルストレーナー</td><td>隼</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>シグマ</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1ATの</td><td>アブカム</td><td>AB166610</td><td>希釈:1/500(IF)、1/50(IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (TGF-&ベータ阻害剤)</td><td>トクリス・バイオシエン</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>アイソラボ</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>粘着顕微鏡スライド</td><td>ヒストボンド</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>アドバンスドDMEM-F12</td><td>ギブコ</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP通信</td><td>アブカム</td><td>AB3980</td><td>希釈:1/25(IHC)</td></tr><tr><td>寒天</td><td>EMS対応</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>アルブ</td><td>アブカム</td><td>AB10241</td><td>希釈:1/100(IF)、1/20(IHC)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (マウス)</td><td>インビトロゲン</td><td>A11001</td><td>希釈:1/1000(IF)</td></tr><tr><td>アレクサフラワー488(ウサギ)</td><td>インビトロゲン</td><td>A110034</td><td>希釈:1/1000(IF)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (マウス)</td><td>インビトロゲン</td><td>A11005</td><td>希釈:1/1000(IF)</td></tr><tr><td>アレクサ粉594(ウサギ)&nbsp;</td><td>インビトロゲン</td><td>A11037</td><td>希釈:1/1000(IF)</td></tr><tr><td>アンモニアアッセイキット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>マック-310</td><td></td></tr><tr><td>クロリドアンモニウム</td><td>サンタクルス</td><td>SC-202936</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント 50x</td><td>ギブコ</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ベース金型</td><td>さくら</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティ、クラスII、安全キャビネット</td><td>熱</td><td>SAFE 2020</td><td></td></tr><tr><td>校正済みピペット</td><td>ギルソン</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>コリルグリシルアミド-フルオレセイン</td><td>コーニング</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸緩衝液 pH 6.0</td><td>バイオオプティカ</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>サンタクルス</td><td>SC-51582</td><td>希釈:1/100(IF)、1/20(IHC)</td></tr><tr><td>CK-19</td><td>サンタクルス</td><td>SC-6278</td><td>希釈:1/100(IF)、1/20(IHC)</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>極低温ハンドリング手袋と目の保護具</td><td>クライオキット</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 1950年</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>DABの</td><td>ロシュ</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPTの</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A5942</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ&nbsp;</td><td>幹細胞技術</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>ギブコ</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>サンタクルス</td><td>SC-8426</td><td>希釈:1/100(IF)、1/20(IHC)</td></tr><tr><td>EDTAの</td><td>インビトロゲン</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>シグマ500</td><td></td></tr><tr><td>ELISAキット</td><td>フォルティスライフサイエンスベチル</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 埋め込みキット</td><td>EMS対応</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>エンテラン</td><td>メルク</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>エオシン Y %1</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>エプカム</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>130-059-901</td><td>希釈:1/11(FACS)</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ギブコ</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>フォルスコリン(FSK)</td><td>トクリス・バイオシエン</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>冷凍容器(フロスティさん)</td><td>熱</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>凍結媒体</td><td>ギブコ</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>アイソラボ</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス 100x</td><td>ギブコ</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>グルテアルデヒド%25、EMグレード</td><td>EMS対応</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスHRP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62-6520</td><td>希釈:1/1000(IHC)</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギHRP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31460</td><td>希釈:1/1000(IHC)</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>ギブコ</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>メルク</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>ミリポール</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス、1 m</td><td>ギブコ</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&アルファ;</td><td>アブカム</td><td>AB55223</td><td>希釈:1/50(IHC)</td></tr><tr><td>氷とドライアイス</td><td>ホームメード</td><td>ホームメード</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター(65°C;C)</td><td>N&uuml;ve</td><td>EN 400</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15ガストリンIヒト</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>ベルトルテック</td><td>ポンド960</td><td></td></tr><tr><td>マスターミックス&nbsp;</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックス、hESC認定</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックス、フェノールレッドフリー</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>メルク</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>アクシーゲン</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオバート A1</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>羽</td><td>S35、C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>幹細胞技術</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェル懸濁培養プレート</td><td>ザルシュテット</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>N2サプリメント100倍</td><td>ギブコ</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン %10</td><td>鉄金</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>ギブコ</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>10月</td><td>ティッシュテック</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>EMS対応</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>P450-Gloアッセイキット&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>V9001</td><td></td></tr><tr><td>パップペン</td><td>シグマ</td><td>Z377821-1個</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>鉄金</td><td>電話番号 200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>PAS染色キット</td><td>アブカム</td><td>AB150680</td><td></td></tr><tr><td>PBSの</td><td>ロンザ</td><td>BE17-516</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>ホスホタングスチン酸</td><td>テッド・ペラ</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>ピペット補助装置</td><td>アクシーゲン</td><td>モトペット-1</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー varioskan flash&nbsp;</td><td>熱</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>エンプローラーアンチフェードマウント剤</td><td>インビトロゲン</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド、EMグレード</td><td>EMS対応</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td>7500 ファスト&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトアクチビンA</td><td>R&D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトBMP7</td><td>ペプロテック</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトEGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF10</td><td>ペプロテック</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF19</td><td>ペプロテック</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトHGF</td><td>ペプロテック</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rhoキナーゼ阻害剤、Y-27632二塩酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase フリー 1.5 mL チューブ</td><td>アクシーゲン</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNaseフリーフィルターチップ</td><td>ザルシュテット</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>2245リンギット</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>ギブコ</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Rspo1 コンディショニング培地</td><td>ホームメード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドマスター</td><td>バイオオプティカ</td><td>15-MEQ001型</td><td></td></tr><tr><td>ソレンソン's リン酸塩バッファー</td><td>EMS対応</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>紡績工</td><td>熱</td><td>マイスピン6</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清学的ピペット</td><td>隼</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュカセット</td><td>ライカ</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>トリマー</td><td>ライカ</td><td>EMトリム2</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酵素</td><td>ギブコ</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>ウラニ酢酸</td><td>EMS対応</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>渦動</td><td>熱</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Surrogate-Fc融合タンパク質</td><td>イムノプレシブ</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>インビトロゲン</td><td>40-2200</td><td>希釈:1/400(IF)</td></tr></tbody></table>

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

まず、ヒト線維芽細胞または末梢血単核細胞(PBMC)細胞を培養し、エピソームリプログラミング により iPS細胞に転換しました。新鮮なノックアウト血清は、健康なiPS細胞を得るために不可欠でした。次に、iPS細胞をBMMコーティングした培養プレートに50%〜60%のコンフルエンシーで播種しました。iPS細胞コロニーが小型/中型のコロニーを持つことで、分化効率が向上しました。その後、iPS細胞をActivin A、Wnt3a、およびR-spo1因子を含む培地で5日間、決定的な内胚葉に分化させました。分化中、細胞の数とサイズは大幅に増加しました。そのため、媒体のリフレッシュには注意が必要です。内胚葉分化の終了時に、EpCAM+細胞を蛍光活性化細胞選別法(FACS)法で濃縮し、選別した細胞をBMMに包埋し、増殖培地(EM)で10〜14日間増殖させた。オルガノイド形成能力は、新鮮な培地成分と純粋な細胞集団に依存します。したがって、セルソーティングを成功させることは重要なステップです。eHEPOのサイズが100μmより大きく、70%〜80%のコンフルエント度を持つ場合、細胞は解離しました。eHEpOは長期培養(1年)の能力があり...

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

私たちの研究は、前臨床試験で健康な肝組織と病気の肝組織を厳密に模倣し、薬効と安全性試験のためのヒトに関連する in vitro 肝臓モデルを開発することを目的としています。肝臓の複雑さを完全に再現し、長期的な機能を達成し、プロトコルを標準化し、ハイスループットアプリケーション向けのオルガノイド生産のスケーリングは、オルガノイド研究における主要な実験的課題であり続けています。私たちは最近、健康な肝臓オルガノイドから肝線維症をモデル化し、患者由来細胞からシトルリン血症やピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症などの肝希少疾患モデルを確立しました。他の方法とは異なり、当社のeHEPOプロトコルは、機能的な肝臓オルガノイドを迅速かつ大規模に提供し、1つの一貫した開始集団からの長期的な機能と複数のアッセイをサポートします。[ナレーター]まず、6 ミリリットルの冷たい DMEM/F-12 を 15 ミリリットルの円錐形チューブに加えます。すぐに80マイクロリットルのFOD基底膜マトリックスまたはBMMをチューブに加え、よく混合します。組織培養処理されたウェルプレートにBMM溶液をコーティングし、ウェルプレート表面を覆うように溶液を分注します。プレートを摂氏37°のインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。誘導性多能性幹細胞またはIPSCプレートを取り、IPSC特異的培地を吸引します。プレートをDMEM / F-12またはDPBSですすぎ、1ミリリットルの特定の酵素を6ウェルプレートの1つのウェルに加えます。1分間インキュベートした後、酵素を吸引し、プレートを摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの予熱したIPSC培地をプレートに加え、側面を軽くたたいて、未分化のコロニー凝集体をプレートの表面から切り離します。懸濁液を5ミリリットルの血清学的ピペットで穏やかに混合し、細胞懸濁液を所望の密度でBMMコーティングウェルに播種します。細胞を摂氏37度で3〜5日間インキュベートし、70%のコンフルエンスに達します。分化を開始する前に、IPSC培地を内胚葉培地に交換します。細胞は分化後にとがった形状になり、細胞間相互作用を示します。内胚葉細胞をPBSですすぎます。300マイクロリットルのトリプシンを加えます。そして、細胞をインキュベーターで5分間インキュベートします。3ミリリットルの冷たいDMEM/F-12を細胞に加え、1,000マイクロリットルのフィルターチップでピペットでピペットを打つと、単一細胞を生成します。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、細胞を室温で300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを10ミリリットルのFACSバッファーで洗浄します。単一細胞懸濁液を作るには、細胞懸濁液を5分間遠心分離する前に、100マイクロメートルのメッシュストレーナーで細胞をろ過し、次に40マイクロメートルのメッシュストレーナーでろ過します。1,500万個の細胞を105マイクロリットルのFACSバッファーで再懸濁し、45マイクロリットルのFcRと15マイクロリットルのEpCAMを懸濁液に加えます。細胞を摂氏4°で10分間インキュベートし、チューブを光から保護します。次に、500マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞懸濁液を洗浄します。細胞を遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、0.5マイクロモル/ミリリットルDAPIを細胞懸濁液に加えて死細胞を定量化します。細胞選別後、細胞を300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。そして、3,000〜5,000個の細胞を20マイクロリットルのBMMに再懸濁します。各48ウェルプレートの中心にBMMの液滴を加えて細胞を播種し、BMMが固まるまで細胞を摂氏37°で2分間インキュベートします。液滴を膨張媒体で重ねます。オルガノイド液滴を分割するには、オルガノイド培地を廃棄し、500マイクロリットルの冷たいAd-DMEM / F-12をウェルに加えます。1,000マイクロリットルのフィルターチップを使用して、BMM液滴を激しくピペットします。最大10個のBMM液滴を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、5ミリリットルの冷たいAd-DMEM/F-12を加えます。チューブを氷の上に3〜5分間置きます。細胞を摂氏4°Cで5分間200 x g で遠心分離し、上清1ミリリットルが残るまで上清を廃棄します。200マイクロリットルのフィルターチップを使用して、細胞ペレットを30〜40回激しくピペットでピペットします。機械的解離後、細胞を5分間遠心分離する前に、5ミリリットルの冷たいAd-DMEM / F-12を加えます。上清を捨てます。そして、懸濁液を氷の上に置きます。50マイクロリットルのBMM液滴を播種します。そして、1ミリリットルあたり25ナノグラムのBMP7を膨張培地に加えます。3日間培養した後、培地を分化培地に交換し、少なくとも14日間細胞を培養します。免疫染色分析を実施して、EpCAM+細胞に由来するオルガノイドが肝系統にコミットしているかどうかを検証しました。CK19+およびHNF4ɑ+細胞の存在は、肝芽細胞および胆管前駆細胞がオルガノイドに存在することを示しています。さらに、E-CAD+細胞やZO-1を発現する立方体または多面体上皮細胞などの上皮組織マーカーを発現するオルガノイドは、細胞間のタイトジャンクションの存在を示します。免疫組織化学により、E-CAD+細胞は肝細胞様表現型を反映した多角形の上皮質構造を示すことが明らかになりました。eHEPOの透過型電子顕微鏡画像をここに示します。白い円は細胞間接合複合体を示します。黒い矢印は、頂端表面の分化を示しています。そして、赤い矢印は微絨毛の横断面を示しています。qPCR分析では、オルガノイドがALB、A1AT、CYP3A4、CYP3A7などの成熟肝細胞マーカーを獲得したことが示されました。PAS染色のピンク色の染色領域は、オルガノイドのグリコーゲン貯蔵能力を示します。さらに、私たちの分析により、オルガノイドが培地にALBを分泌し、培地からアンモニアを除去する能力、CYP3A4酵素活性、および胆汁酸輸送能力が示されました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ヒト胚性幹細胞集団からヒト肝内胚葉の発生に焦点を当てます。...

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids...

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このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

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マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。...

ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。...

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

肝細胞がん(HCC)オルガノイド形成に関する既存のプロトコルを包括的に概観し、改良し、オルガノイド培養のすべての段階を網羅しています。このシステムは、潜在的な治療標的の特定と医薬品候補の有効性の評価のための貴重なモデルとして機能します。...

ヒト肝細胞癌患者由来オルガノイドモデルの開発と最適化による標的同定と創薬

オルガノイドは、臓器開発、創薬、疾患研究のための個別化組織モデリングに革命をもたらします。オルガノイド工学は、複雑な合成組織の作成へと進歩しています。その目的は、形態形成、アッサンブロイド技術、およびバイオマトリックスを統合して、組織工学を進歩させることです。このプロトコルは、肝臓の器官形成をモデル化し、合成組織構築のガイドラインを確立するのに役立ちます。...

ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶ 内胚葉由来肝オルガノイド（eHEPO）の作製法。2週間で作製でき、1年以上の長期培養が可能で、分化能と機能性を維持します。肝臓生物学と再生医療研究に有用です。

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

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