機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

私たちの研究は、前臨床試験で健康な肝組織と病気の肝組織を厳密に模倣し、薬効と安全性試験のためのヒトに関連する in vitro 肝臓モデルを開発することを目的としています。肝臓の複雑さを完全に再現し、長期的な機能を達成し、プロトコルを標準化し、ハイスループットアプリケーション向けのオルガノイド生産のスケーリングは、オルガノイド研究における主要な実験的課題であり続けています。私たちは最近、健康な肝臓オルガノイドから肝線維症をモデル化し、患者由来細胞からシトルリン血症やピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症などの肝希少疾患モデルを確立しました。他の方法とは異なり、当社のeHEPOプロトコルは、機能的な肝臓オルガノイドを迅速かつ大規模に提供し、1つの一貫した開始集団からの長期的な機能と複数のアッセイをサポートします。

[ナレーター]まず、6 ミリリットルの冷たい DMEM/F-12 を 15 ミリリットルの円錐形チューブに加えます。すぐに80マイクロリットルのFOD基底膜マトリックスまたはBMMをチューブに加え、よく混合します。組織培養処理されたウェルプレートにBMM溶液をコーティングし、ウェルプレート表面を覆うように溶液を分注します。プレートを摂氏37°のインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。誘導性多能性幹細胞またはIPSCプレートを取り、IPSC特異的培地を吸引します。プレートをDMEM / F-12またはDPBSですすぎ、1ミリリットルの特定の酵素を6ウェルプレートの1つのウェルに加えます。1分間インキュベートした後、酵素を吸引し、プレートを摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの予熱したIPSC培地をプレートに加え、側面を軽くたたいて、未分化のコロニー凝集体をプレートの表面から切り離します。懸濁液を5ミリリットルの血清学的ピペットで穏やかに混合し、細胞懸濁液を所望の密度でBMMコーティングウェルに播種します。細胞を摂氏37度で3〜5日間インキュベートし、70%のコンフルエンスに達します。分化を開始する前に、IPSC培地を内胚葉培地に交換します。細胞は分化後にとがった形状になり、細胞間相互作用を示します。内胚葉細胞をPBSですすぎます。300マイクロリットルのトリプシンを加えます。そして、細胞をインキュベーターで5分間インキュベートします。3ミリリットルの冷たいDMEM/F-12を細胞に加え、1,000マイクロリットルのフィルターチップでピペットでピペットを打つと、単一細胞を生成します。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、細胞を室温で300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを10ミリリットルのFACSバッファーで洗浄します。単一細胞懸濁液を作るには、細胞懸濁液を5分間遠心分離する前に、100マイクロメートルのメッシュストレーナーで細胞をろ過し、次に40マイクロメートルのメッシュストレーナーでろ過します。1,500万個の細胞を105マイクロリットルのFACSバッファーで再懸濁し、45マイクロリットルのFcRと15マイクロリットルのEpCAMを懸濁液に加えます。細胞を摂氏4°で10分間インキュベートし、チューブを光から保護します。次に、500マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞懸濁液を洗浄します。細胞を遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、0.5マイクロモル/ミリリットルDAPIを細胞懸濁液に加えて死細胞を定量化します。細胞選別後、細胞を300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。そして、3,000〜5,000個の細胞を20マイクロリットルのBMMに再懸濁します。各48ウェルプレートの中心にBMMの液滴を加えて細胞を播種し、BMMが固まるまで細胞を摂氏37°で2分間インキュベートします。液滴を膨張媒体で重ねます。オルガノイド液滴を分割するには、オルガノイド培地を廃棄し、500マイクロリットルの冷たいAd-DMEM / F-12をウェルに加えます。1,000マイクロリットルのフィルターチップを使用して、BMM液滴を激しくピペットします。最大10個のBMM液滴を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、5ミリリットルの冷たいAd-DMEM/F-12を加えます。チューブを氷の上に3〜5分間置きます。細胞を摂氏4°Cで5分間200 x g で遠心分離し、上清1ミリリットルが残るまで上清を廃棄します。200マイクロリットルのフィルターチップを使用して、細胞ペレットを30〜40回激しくピペットでピペットします。機械的解離後、細胞を5分間遠心分離する前に、5ミリリットルの冷たいAd-DMEM / F-12を加えます。上清を捨てます。そして、懸濁液を氷の上に置きます。50マイクロリットルのBMM液滴を播種します。そして、1ミリリットルあたり25ナノグラムのBMP7を膨張培地に加えます。3日間培養した後、培地を分化培地に交換し、少なくとも14日間細胞を培養します。免疫染色分析を実施して、EpCAM+細胞に由来するオルガノイドが肝系統にコミットしているかどうかを検証しました。CK19+およびHNF4ɑ+細胞の存在は、肝芽細胞および胆管前駆細胞がオルガノイドに存在することを示しています。さらに、E-CAD+細胞やZO-1を発現する立方体または多面体上皮細胞などの上皮組織マーカーを発現するオルガノイドは、細胞間のタイトジャンクションの存在を示します。免疫組織化学により、E-CAD+細胞は肝細胞様表現型を反映した多角形の上皮質構造を示すことが明らかになりました。eHEPOの透過型電子顕微鏡画像をここに示します。白い円は細胞間接合複合体を示します。黒い矢印は、頂端表面の分化を示しています。そして、赤い矢印は微絨毛の横断面を示しています。qPCR分析では、オルガノイドがALB、A1AT、CYP3A4、CYP3A7などの成熟肝細胞マーカーを獲得したことが示されました。PAS染色のピンク色の染色領域は、オルガノイドのグリコーゲン貯蔵能力を示します。さらに、私たちの分析により、オルガノイドが培地にALBを分泌し、培地からアンモニアを除去する能力、CYP3A4酵素活性、および胆汁酸輸送能力が示されました。