Name: Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: 学ぼう、Cre-LoxPとCRISPR-Cas9およびAAV-sgRNAを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウス作製法を。外科的マイクロ注射技術により、選択的交配なしで迅速に組織特異的遺伝子改変動物を作成できます。

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この研究の一部は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK122808、R01DK102898、およびR01DK132469(Y.-H.T.へ)、およびP30DK036836(ジョスリン糖尿病センターの糖尿病研究センターへ)によって支援されました。T. T.は、サンスター・リサーチ・フェローシップ(金田博夫奨学金、サンスター財団)および米国心臓協会助成金903968の支援を受けました。Y.Z.はチャールズA.キングトラストフェローシップによってサポートされました。原稿を校正してくださったショーン・D・コダニに感謝します。

すべての動物実験とケア手順は、ジョスリン糖尿病センターの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 培養細胞における有効sgRNAのスクリーニング
注:アッセイを費用対効果の高いものにするために、sgRNAをAAV粒子にパッケージングする前に、Cas9/sgRNA発現用のレンチウイルスベースのシステム を介して 培養細胞でさまざまなsgRNAをテストし(図1)、 in vivo 実験で最高のノックダウン効率が得られるsgRNAを選択することをお勧めします。
<ol><li>クリスプル-Cas9 sgRNAデザイン<ol><li>Broad sgRNA設計ツール(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21、CRISPORオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)22、およびその他の利用可能なツールなどのオンラインツールを使用してsgRNAを設計します。</li>
		<li>遺伝子名ボックスに遺伝子名またはDNAターゲット配列を入力し、SpCas9のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)として NGG を選択して、潜在的なsgRNA配列を生成します。</li>
		<li>予測されるオンターゲット効率が高く、オフターゲット活性が低いsgRNAを選択します。例えば、CRISPOR出力で特異性スコアが50以上のsgRNAの使用が推奨されます。フィルターを通過する特定のsgRNAの中から、効率スコア23の高いものを選びます。 注:一般に、効果的なsgRNAを確実に同定するために、3つまたは4つのsgRNAが選択されます。</li>
	</ol></li>
	<li>CRISPR-Cas9 sgRNAプラスミドの構築<ol><li>BsmBI制限部位(表1)からオーバーハング(5'と3'の両方)を持つ20ヌクレオチド(nt)標的配列をコードするsgRNAオリゴペアをDNA合成プラットフォームを介して合成します。</li>
		<li>リゲートアニールオリゴは、BsmBI線形化レンチクリスプルv2ベクターとペアを合わせます。</li>
		<li>ライゲーション産物をStbl3大腸 菌 株に変換し、U6フォワードプライマーを用いたサンガーDNAシーケンシングによりsgRNAの挿入を確認します。 注:LentiCRISPRv2およびlentiGuide-PuroというタイトルのAddgeneのプロトコルの詳細なクローニング手順を参照してください:レンチウイルスCRISPR/Cas9およびシングルガイドRNA24。</li>
	</ol></li>
	<li>レンチウイルス粒子の生成<ol><li>トランスフェクションの約24時間前に、7 x 105 HEK-293細胞を4 mLの完全増殖培地に6 cm組織培養プレートでプレートします。</li>
		<li>15 μLのLT1トランスフェクション試薬を250 μLの無血清培地に加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>表2に従って、250 μLの無血清培地中で各sgRNAのトランスフェクションカクテルを調製します。ステップ1.3.2で調製したトランスフェクション試薬をプラスミドカクテルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートします。</li>
		<li>完全な増殖培地をHEK-293細胞用の3.5 mLの新鮮な増殖培地と交換し、3.5 mLの新鮮な増殖培地で培養したHEK-293細胞にDNAトランスフェクション試薬混合物を滴下します。</li>
		<li>トランスフェクションから12〜15時間後、培地を交換してトランスフェクション試薬を除去し、4 mLの新鮮な増殖培地と交換します。</li>
		<li>24時間のインキュベーション後、レンチウイルス粒子を含む細胞培養培地を収集し、0.45 μmフィルターで培地をろ過してHEK-293細胞を除去します。ウイルスは4°Cで数日間保存することができます。長期保存の場合、ウイルスは-80°Cで凍結する必要があります。 注:レンチウイルス粒子を調製するときはバイオセーフティガイドラインに従い、レンチウイルスの取り扱いに適した環境(BL2 +など)で作業してください。pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G)と題されたAddgeneのプロトコルの詳細なレンチウイルス調製手順を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>褐色脂肪前駆細胞の感染とsgRNAを介したノックダウンの決定<ol><li>プレート1 x 10 6マウス不死化褐色脂肪前駆細胞を、ウェルあたり8 μg/mLのポリブレンを含む1 mLの新しい培地に6 ウェルプレートに入れます。 注:この研究では、不死化褐色前駆脂肪細胞はSV40 T抗原25を使用して生成されました。褐色脂肪前駆細胞は、10%FBSを含む高グルコースDMEMで培養されます。</li>
		<li>ステップ1.3のレンチウイルス粒子溶液1 mLを加えて、細胞に感染させます。1つの非感染ウェルの細胞を並行して維持し、抗生物質選択コントロールとして機能する。</li>
		<li>感染後24時間で新鮮な培地に交換します。対応する抗生物質(例:.、最終濃度1 μg/mLのピューロマイシン)を培地に追加して、感染していない細胞を殺し、感染した細胞を選択します。感染していないすべての対照細胞が死滅するまで、選択した抗生物質を含む新しい培地に1日おきに変更します。</li>
		<li>ウイルス感染細胞からタンパク質を採取し、ウェスタンブロット解析によりsgRNAのノックダウン効率を測定します。EslamiおよびLujan26の詳細なウェスタンブロッティング手順に従ってください。タンパク質間の代謝回転率が異なるため、複数の時点(ウイルス感染後6日目から12日目など)をテストして、タンパク質シグナルの喪失を観察します。 注:目的の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体が利用できない場合は、サンガーシーケンシングを利用して、各sgRNAのゲノム編集効率を決定することもできます。簡単に説明すると、sgRNA標的領域に隣接するプライマーを使用してゲノムDNAを増幅し、~700 bpの長さのPCRアンプリコンを生成します。予測されるブレークサイトは、シーケンシング開始サイトから~200 bp下流にあることが望ましいです。次に、PCR産物をサンガーシーケンシングにかけます。DEcompositionによるインデルの追跡(TIDE)などのオンラインツールを使用してシーケンシング結果を解析し、細胞27のプール内の各sgRNAによって生成される小さなインデルの頻度を決定する。</li>
	</ol></li>
</ol>2. AAV-sgRNAプラスミドの構築
注:このステップでは、上記のスクリーニングから同定された有効なsgRNAがpAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPベクター28 にクローニングされます(図2)。その間、マウスゲノム内のいかなる配列も認識しない非標的sgRNA(例えば、TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29)も、非編集コントロールとして機能するために同じベクターにクローニングされる。
<ol><li>合成されたsgRNAオリゴと同一のオーバーハングを生成するBbsIを使用して、pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP骨格を線形化します。</li>
	<li>アニーリングしたオリゴ対を直鎖状pAAVベクターでライゲートし、ステップ1.2の説明に従ってsgRNAの挿入を確認します。 注:レンチクリスCRISPRv2-sgRNAのクローニング手順は、AAV-sgRNAプラスミドの構築にも適用されます。</li>
</ol>3. AAVの包装
<ol><li>セクション2で生成されたAAVベクターをAAV血清型8にパッケージ化します。以前のプロトコル30に従って高力価AAVを調製するか、またはウイルスコアまたは商用サービスからAAVパッケージングサービスを要求する。ウイルス力価を1 x 1013 ゲノムコピー/ mLに希釈します。 注:sgRNAを発現する改変AAV2ゲノムは、AAV血清型8にパッケージ化されています。この血清型は、脂肪組織に対する効率が高いために選択されました18,31。細胞破片や少量の培地成分などの汚染物質によって誘発される免疫応答を防ぐために、in vivo注射には超精製AAVが必要です。超精製は、ヨージキサノール勾配および超遠心分離30によって達成することができる。</li>
</ol>4. Ucp1 Cre/Cas9マウスの作製
<ol><li>Ucp1プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現するUcp1-Creマウス系統( 材料の表を参照)を購入します。ホモ接合型Rosa26フロックスSTOP−Cas9ノックインマウス32 ( 材料の表参照)を購入し、その中でCas9の発現がCreリコンビナーゼ依存的に調節されている。</li>
	<li>これらの株を交配して、前述のようにUcp1-Cre/Cas9マウスを生成します16,17。すべてのマウスを温湿度管理された部屋(23°C、湿度30%)に12時間の明暗サイクル(午前6時30分に点灯、午後6時30分に消灯)に保管し、飼料と水を無料で利用できるようにします。</li>
	<li>得られたUcp1-Cre/Cas9マウスを、コントロールsgRNAまたは目的の遺伝子を標的とするsgRNAのいずれかを保有するAAVで、以下に説明する方法で処理します。この研究では、体重約30 gの12〜15週齢の雄Ucp1-Cre / Cas9マウスを使用しました。</li>
</ol>5.マウスのBATへのAAV注射の手術
<ol><li>誘導および維持のために2.5%イソフルランの連続吸入でマウスを麻酔する。</li>
	<li>乾燥を防ぐために両目を滑らかにします。次に、鎮痛薬(バンアミン、2.5 mg / kg体重[BW]、皮下注射、 材料の表を参照)をマウスに与えて、術後の痛みと苦痛を最小限に抑え、予防します。</li>
	<li>シェーバーを使用して肩甲骨間領域でマウスの毛皮を剃り、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとそれに続く70%エタノールの少なくとも3ラウンドの交互ラウンドで手術領域を滅菌します。次に、切開部位の周りに滅菌外科用ドレープを適用します。</li>
	<li>メスで肩甲骨の間の皮膚を切開し(図3A-B)、剃った皮膚を剥がして、外科用ハサミで首の脂肪組織を露出させます(図3C-D)。切開の大きさは体の大きさにもよりますが、一般的に肩甲骨間部の脂肪組織を露出させるには2cm程度を切開にしてください。</li>
	<li>脂肪組織の遠位領域と筋肉の境界にある脂肪組織を1回の切開を使用して切断します(図3E-F)。切開のサイズは、脂肪組織の鈍い剥離のための外科用ハサミを挿入するための入り口を開くためだけに約1cmであるべきです。</li>
	<li>利き手を使用して、外科用ハサミで脂肪組織を鈍く垂直に剥がし、利き手ではない手でBATを含む脂肪組織をつまんでBATを露出させます(図3G)。スルツァーの静脈をランドマークとして使用して、正確なBATの位置を示します。 注: 図3HのBATは、画像のデモンストレーションの目的で完全に露出しています。過度の解剖は、周囲のBATの神経に損傷を与える可能性があります。はさみの方向を誤ると、周囲の筋肉やSULTZERの静脈がBATを排出し、過剰な出血を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>各マウスについて、ハミルトンシリンジ(100 μL、材料表を参照)に接続された鋭利な針(32 G、 材料表を参照)を使用して、40 μLのAAVを両方のBATローブ(BATの1つの葉あたり20 μL)にゆっくりと注入します(100 μL、 材料の表を参照; 図3I)。AAV投与中に注入部位からの漏れがないことで示されるように、注入が成功したことを確認します。 注: 図3IのBATは、画像のデモンストレーションを目的として完全に露出されています。BATローブに投与されるAAV溶液の量は、レシピエントマウスのBATのサイズによって決定される。20 μLのAAV溶液が、体重30 gの通常のC57BL6 / Jマウスの重量約0.05 gの1つのBATローブに適していると判断しました。必要ならば、所望の量を達成するためにウイルス溶液を濃縮する必要があるかもしれない。</li>
	<li>注入したBATや周辺組織からの出血がないことを確認します。過酸化水素水に浸したガーゼ( 材料の表を参照)を止血のために出血部位に押し付けます。</li>
	<li>露出した脂肪組織を通常の位置に戻します。5-0吸収性モノフィラメント糸を使用して脂肪組織と筋肉の端を縫います(図3J)。5-0コーティングされたビクリル未染色編組糸で開いた皮膚を縫合します(図3K-L)。 注意: 図4 は、皮をむいた脂肪組織と筋肉を縫う手順を説明しています。</li>
	<li>完全に回復するまで、手術後、動物を加熱パッドに維持します。動物に食物、水、および営巣のための十分な寝具へのアクセスを提供します。実験開始前の7日間の回復のために、苦痛や病気の兆候がないか定期的に監視してください。</li>
	<li>マウスから解剖したBATにおけるウェスタンブロット解析により標的遺伝子欠失の効率をSugimoto et al.16のように確認した。</li>
</ol>

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<li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li>
<li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895(2022).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

肩甲骨間BATへのAAV媒介遺伝子送達のための既存の公開された方法には、BATへのAAV直接注入のための外科的技術とアプローチを説明する詳細な写真とビデオは含まれていません。公表された方法33,34のほとんどにおいて、AAVは、BAT自体ではなく、肩甲骨間BAT周囲の脂肪組織に注入される。したがって、このプロトコルには、研究の成功を決定するいくつかの重要なステップがあります。これらには、sgRNAの設計、AAVパッケージングと濃縮、BAT特異的Cas9マウスの生成、および外科的処置が含まれます。in vivo手順を完了するには、慎重で優れた外科的スキルが必要です。特に、BATを露出させ、AAVを投与しながら組織の損傷を最小限に抑えることが重要です。住居の温度、運動トレーニング、食事などの複数の遺伝的および環境的要因により、BATを取り巻く白色脂肪の量とBAT自体の組成は動物によって異なる場合があります。例えば、肥満マウスはBATを取り囲む広大な白色脂肪組織を示し、熱中性(30°C)で飼育されたマウスは白...

肥満は世界中でかなりの速度で増加しており、広範囲の代謝性疾患につながっています1,2,3。脂肪組織はこれらの病状の鍵です。存在する2つの機能的に異なるタイプの脂肪組織は、過剰なカロリーを蓄える白色脂肪組織(WAT)と、熱発生のためにエネルギーを放散する褐色脂肪組織(BAT)とそれに関連するベージュ/ブライト脂肪です。BATはそのエネルギー放散機能で認識されていますが、遠位器官の代謝を調節する生理活性分子の生成を介して内分泌機能も持っています4,5。げっ歯類での多くの研究は、茶色またはベージュ色の脂肪の量または活性を増加させることがエネルギー消費の増加とインスリン感受性の改善につながることを示しています。ヒトでは、BATの検出可能な人は心代謝疾患の有病率が有意に低くなります6。したがって、BATは、肥満関連代謝後遺症7、8、9に対して優れた治療可能性を秘めています。
BATの発生と機能の生理学と病態生理学を調査し、これらのプロセスに関与する分子メカニズムを解明するために、BAT特異的トランスジェニックマウスモデルが最適な方法です10。Cre-LoxP組換えシステムは、マウスゲノムを編集することによって条件付きノックアウトマウスを作製するための最も一般的に使用される手段です。このシステムは、組織/細胞特異的な方法で目的の遺伝子の修飾(過剰発現またはノックアウト)を可能にしました11。また、選択的蛍光レポーター遺伝子を発現させることにより特定の細胞型を標識するために利用することもできる。
最近、Cre−LoxPシステムアプローチは、CRISPR-Cas9技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせることによってさらに発展している12。CRISPR-Cas9システムは、ゲノム13の正確な領域を改変、調節、または標的化するための特異的で効率的な遺伝子編集ツールです。CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集は、遺伝子ターゲティングベクターとの相同組換えを必要としないため、ゲノム遺伝子座の迅速な遺伝子操作を可能にします。Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNA技術を組み合わせることで、研究者は組織/細胞における所望の時間における目的の遺伝子の役割を調査できるため、遺伝子機能をより正確に理解することができます。さらに、これらの組み合わせた技術は、トランスジェニックマウスの生成に必要な時間と労力を削減し、誘導性Cre系統が使用されている場合、マウスにおける誘導性ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9活性の時間的制御を可能にする14。
AAVベクターは、安全で効果的なin vivo遺伝子デリバリーシステムです。しかし、脂肪組織を標的とするAAVは、脳、心臓、肝臓、筋肉などの他の組織での応用に遅れをとっています15。形質導入効率が比較的低く、天然に存在する血清型ベクターでは向性が強いため、脂肪組織へのAAV誘導遺伝子送達は依然として困難です15。過去5年間で、私たちらは、AAVガイド下遺伝子を脂肪組織に送達するための効果的で低侵襲な方法を確立することに成功し、BAT機能の調節に関与する遺伝子の理解を可能にするマウスモデルを作成しました16,17,18,19。例えば、AAV8を用いて、12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)をコードするAlox12を標的とするsgRNAをUcp1-Cre/Cas9マウスのBATに送達することにより、活性化されたBATが12-LOX代謝物、すなわち12-ヒドロキシ-エイコサペンタエン酸(12-HEPE)と13R,14S-ジヒドロキシドコサヘキサエン酸(マレジン2)を産生し、それぞれグルコース代謝を調節し、肥満関連炎症を解消することを発見しました16。17.ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNAシステムを組み合わせてBAT特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順、特にAAV-sgRNAをBATローブに直接マイクロインジェクションする手術に関する段階的なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>化学薬品、ペプチド、組換えタンパク質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM 無血清培地</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン感染/トランスフェクション試薬</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1 トランスフェクション試薬</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>組換えDNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2ベクトル&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td><td>Addgene</td><td>89060</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G エンベローププラスミド</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 パッケージングプラスミド</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>実験モデル: 細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 細胞</td><td>Tseng研究室で開発</td><td>PMID: 14966273</td><td></td></tr><tr><td>実験モデル: 生物/株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 ノックインマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1-CREマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>24670</td><td></td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バナミン</td><td>・パターソン</td><td>07-859-1323</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>モデル 710 RN シリンジ</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>ハミルトン</td><td>32 ゲージ、スモールハブ RN ニードル、ニードルポイントスタイル 2</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 インチ モノフィラメント 12/Bx</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>1273504</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸 5-0 ユニファイ シルク P-3 ブラック 18 インチ 12/Bx</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td></td><td></td>1294522</tr></tbody></table>

cre-loxp、crispr-cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドrnaシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

褐色脂肪組織(BAT)は、エネルギー散逸に特化した脂肪貯蔵庫であり、生理活性分子の分泌 を介して 内分泌器官としても機能します。BAT特異的ノックアウトマウスの作成は、BATを介したエネルギー調節に対する目的の遺伝子の寄与を理解するための最も一般的なアプローチの1つです。Cre-LoxPシステムを利用した従来の遺伝子ターゲティング戦略は、組織特異的ノックアウトマウスを作製するための主要なアプローチでした。ただし、このアプローチは時間がかかり、面倒です。ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて、BATの目的遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトするためのプロトコルについて説明します。肩甲骨間BATは、筋肉間の深い層にあります。したがって、視野内のBATにAAVを正確かつ直接注入するには、BATを露光する必要があります。BATにつながるスルツァー静脈などの交感神経や血管の損傷を防ぐためには、適切な外科的取り扱いが不可欠です。組織の損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元解剖学的位置と技術的ステップで必要な外科的スキルを理解することが重要です。このプロトコルは、目的の遺伝子を標的とするsgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、BAT特異的ノックアウトマウスを生成するための両方のBATローブへのAAVの直接マイクロインジェクション手術など、主要な技術的手順を強調しており、BATの遺伝子の生物学的機能の研究に広く適用できます。

上記の手順を通して、AAV-sgRNAのBATへの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠です。AAV-sgRNAの効果を最大化し、手術中の組織損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元(3D)解剖学的位置を理解することが不可欠です。図3Eに示すように、組織を露出させずにBATの正確な位置を特定することは困難です。ただし、過剰なBAT曝露は組織を損傷する可能性があります(図3H、I)。したがって、限られた解剖学的空間内にAAV溶液を注入する手順を実行する必要があります(図3G)。図5Aは、AAV注射の成功および手術後のマウスの迅速な回復を確実にするために重要である。図5B-Dは、注射の失敗につながる可能性のある潜在的な欠陥を示しています。これらには、AAV溶液の誤った領域...

このプロトコルでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて褐色脂肪組織(BAT)特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順について説明します。記載されたステップには、sgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、およびBATローブへのAAVのマイクロインジェクションが含まれる。

Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

このプロトコルは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを使用して、褐色脂肪特異的ノックアウトマウスを生成します。これには、AAVを褐色脂肪に安全に投与するための外科的技術が含まれています。この技術の主な利点は、マウスを選択的に繁殖させることなく、組織特異的ノックアウトを迅速に生成できることです。組織特異的ノックアウトまたはノックダウンを行うアプローチは、AAVを注射するための外科的手順が標的臓器に基づいて変更される場合、他の組織に適合させることができる。まず、鎮痛剤を麻酔をかけたUCP1 Cre Cas9マウスに皮下投与して、術後の痛みや苦痛を最小限に抑え、予防します。次に、シェーバーを使用して肩甲骨間領域の毛皮を剃り、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブを少なくとも3回交互に使用し、続いて70%エタノールで手術領域を滅菌します。メスを使用して、肩甲骨の間の茶色の脂肪組織の上の皮膚を2センチメートル切開し、肩甲骨間脂肪を露出させます。1回切開した後、脂肪組織の遠位領域と筋肉の境界にある脂肪組織を切断します。次に、利き手の手術用ハサミを使用して、脂肪組織を鈍く垂直に剥がし、茶色の脂肪組織を露出させ、茶色の脂肪組織を含む脂肪組織を利き手ではない手でつまみます。スルザー静脈をランドマークとして使用して、正確な茶色の脂肪組織の位置を示します。次に、各マウスについて、100マイクロリットルのハミルトン注射器に接続された鋭い32ゲージの針を使用して、20マイクロリットルのアデノ随伴ウイルスまたはAAVを2つの褐色脂肪組織の各葉にゆっくりと注入します。AAV投与中に注入部位からの漏れがないことが示す注入が成功したことを確認します。恒常性を確保した後、露出した脂肪組織を通常の位置に戻し、5-0吸収性モノフィラメント糸を使用して脂肪組織と筋肉の端を縫合します。最後に、5-0コーティングされたVICRYL未染色編組糸で開いた皮膚を縫合します。褐色脂肪組織の正確な位置は、それを露出させなければ特定できないが、組織への過度の曝露損傷である。注射の失敗につながった可能性のある潜在的な欠陥には、AAV溶液を誤った領域に注入すること、組織を通る針の貫通、およびAAV溶液の過剰な量による組織の膨らみが含まれていました。褐色脂肪組織へのAAVシングルガイドRNAの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠でした。褐色脂肪組織を露出させながら成功するための鍵は、はさみの方向と深さ、およびハミルトンシリンジの位置を含む外科用はさみ技術です。この技術は、褐色脂肪関連のエネルギー代謝の分子調節因子を理解するために、負荷を発生させる組織特異的ノックアウト動物を有する。

generation-brown-fat-specific-knockout-mice-using-combined-cre-loxp

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、タモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼシステムを使用して、マウスモデルにタモキシフェンを腹腔内注射した後の標的遺伝子ノックアウトの手順を説明しています。...

CreER-LoxPシステムに基づく標的遺伝子の不活性化:マウスモデルにおける標的遺伝子ノックアウトのためのタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼシステム

エンハンサー活性の実験的検証は、機能喪失分析によって最もよくアプローチされます。ここで紹介するのは、CRISPR/Cas9を介した欠失を使用して、ハイブリッドゲノム(Mus musculus129 x Mus castaneus)を含むF1...

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

このプロトコルは、CRISPR / Cas9技術を用いたマルチ遺伝子ノックアウトの作成に特に有用な、1つのガイドRNAコンカテマーベクターに複数の単一ガイドRNAをクローニングするための工程を記載する。腸オルガノイドにおける二重ノックアウトの生成は、この方法の適用可能性として示されている。...

CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR...

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。...

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

本プロトコールは、完全長コネキシン43生成を保持するが、より小さなGJA1-20k内部翻訳アイソフォームの翻訳を防止する、Gja1における単一のM213L変異を記載する。...

完全長タンパク質の発現を維持しながらmRNAからの内部翻訳開始部位を除去する

このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。...

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

本プロトコルは、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを効率的に作製するためのCRISPR-Cas9およびドナーDNAの接合子マイクロインジェクションを記載する。...

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

このプロトコルは、ベージュ脂肪生物学を調査するためのアデノ随伴ウイルス(AAV)の代替戦略として、脂肪細胞(AdipoSPH)におけるCRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)の使用を示しています。内因性Prdm16遺伝子を標的とするAAV担持sgRNAの インビボ...

CRISPR SunTag-p65-HSF1活性化系を用いたベージュ脂肪の生態と代謝の検討

卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) 法の効率は、ドナーの女性から接合子を採取し、偽妊娠中の女性に移植する必要がある従来のマイクロインジェクションに匹敵します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9 誘発変異を染色体 6 上の ROSA26...

ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

学ぼう、Cre-LoxPとCRISPR-Cas9およびAAV-sgRNAを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウス作製法を。外科的マイクロ注射技術により、選択的交配なしで迅速に組織特異的遺伝子改変動物を作成できます。

Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製

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